Name: Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Erfahren Sie das NAPPA-basierte Hochdurchsatz-Screening von Kinase-Inhibitoren mit selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays. Diese Methode ermöglicht die vergleichende Analyse von Inhibitorwirkungen über mehrere Kinasen und deren Varianten hinweg.

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Die Autoren bedanken sich bei allen im LaBaer-Labor für ihre Hilfe und Kritik bei der Entwicklung des Projekts. Dieses Projekt wurde durch das NIH-Stipendium U01CA117374, U01AI077883 und Virginia G. Piper Foundation unterstützt.

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Änderungen und Fehlerbehebung Während der Optimierungsphase der Untersuchung der Kinase-Aktivität auf NAPPA-Arrays war eine der Hauptquellen für Hintergrund und schwacher Dynamikbereich die BSA, die auf dem Druckmix verwendet wurde. BSA lieferte die primären Adern, die für die Vernetzung mit der Aminosilanoberfläche notwendig sind, und die DNA und den Capture-Antikörper an Ort und Stelle ein. BSA ist jedoch stark phosphoryliert, was die Erkennung des Autophosphorylierungssignals auf dem Array über dem Hintergrundrauschen erschwert. Um dieses Problem zu lösen, wurden mehrere Alternativen für BSA im Druckmix getestet, und Polylysin wurde als guter Ersatz identifiziert. Polylysin fehlt jede Phosphorylierung Seisplatz; Daher ist der Hintergrund von nicht ausgedrückten Arrays sehr minimal. Darüber hinaus sind Mikroarrays, die mit Polylysin bedruckt sind, reproduzierbar und weisen gute Proteine auf (Abbildung 2).
Die nächste kritische Änderung, die am Standard-NAPPA-Test durchgeführt wurde, war die Zugabe eines Phosphatase/DNase-Behandlungsschritts. Die Behandlung der Mikroarrays mit Phosphatase ermöglicht die Entfernung jeglicher Phosphorylierung, die im IVTT-Mix während der Proteinsynthese und -erfassung aufgetreten ist (Abbildung 3). Die Quelle dieser Phosphorylierung könnte aus der intrinsischen Autophosphorylierungsaktivität oder aus der Aktivität von Kiinasen stammen, die im IVTT-Mix vorhanden sind. Die Entfernung aller Phosphorylierung nach der Expression ermöglichte eine einfache Identifizierung der Kiinasen, die aktiv sind und einer Autophosphorylierung unterzogen werden können (Abbildung 3).
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls NAPPA ist eine robuste Technologie, aber wie erwartet gibt es mehrere kritische Schritte. Die erste ist der Erwerb hochwertiger DNA in der entsprechenden Konzentration. Die Verwendung von DNA von schlechter Qualität oder in niedrigen Konzentrationen erzeugt Mikroarrays von schlechter Qualität, wobei mehrere Merkmale nicht ausgedrückt und in den entsprechenden Ebenen angezeigt werden, wodurch die Anzahl der auf dem Array analysierten Proteine verringert wird. Der zweite kritische Schritt ist die Expression von Proteinen auf dem Mikroarray. Die Verwendung eines IVTT-Systems, das ein hohes Maß an funktionellem Protein ausdrückt, ist entscheidend für die Untersuchung der Kinase-Aktivität auf dem Array.
Der nächste wichtige Schritt beim TKI-Screening ist der Umgang mit den Mikroarrays. Die Mikroarrays sollten während eines Schritts des Protokolls nicht trocknen, und eine schonende Handhabung wird empfohlen, um Kratzer zu vermeiden, die das Hintergrundsignal erhöhen können. Da die Arrays aus dem gesamten Experiment miteinander verglichen werden, ist es wichtig sicherzustellen, dass jeder Inkubationsschritt gleichmäßig über alle Folien hinweg erfolgt. Beispielsweise sollte die Zeit berücksichtigt werden, die zum Ausführen eines Schritts in einem einzelnen Array erforderlich ist, wenn ein Batch von 20 Arrays verarbeitet wird, um Unterschiede in der Dauer der Inkubation zwischen Arrays zu vermeiden.
Schließlich sind die Konzeption des Experiments und die Einbeziehung von positiven und negativen Kontrollen für die Qualitätskontrolle und Datenanalyse von entscheidender Bedeutung. Der erste Satz von Steuerelementen sind die in jedem Array gedruckten und enthalten Negativkontrollen [d. h. leere Flecken (ohne Material gedruckt), Wasser oder leeren Vektor (nur das Tag ausdrücken)] sowie eine positivgesteuerte (d. h. gereinigte IgG, die vom sekundären Antikörper und ist inert gegenüber Veränderungen der Phosphorylierungsniveaus). Zusammen messen sie die Hintergrundpegel des Mikroarrays, die mögliche Übertragung während des Drucks und die Signalintensität der Detektionsmethode.
Die nächsten Kontrollen sind die Arzneimittel-Screening-Kontrollen und umfassen die dephosphorylierten und autophosphorylierten Mikroarrays (in Gegenwart oder Abwesenheit von DMSO). Wie bereits erwähnt, misst das dephosphorylierte Mikroarray den Phosphorylierungsgrad nach der Phosphatase-Behandlung und damit den Ausgangswert für alle anderen Experimente. Je niedriger die Basisebene ist, desto höher ist der Dynamikbereich der Assays. Die autophosphorylierten Arrays stellen die maximalen Phosphorylierungswerte aller Arrays dar und das Signal sollte stark und klar sein. Es wird für die Datenanalyse verwendet, aber auch als Kontrolle, dass alle Reaktionen erfolgreich auf dem Array durchgeführt wurden.
Einschränkungen der Technik Ab sofort ist eine der Einschränkungen des hier vorgestellten Arzneimittelscreenings seine Fähigkeit, nur Proteinkiinasen zu überprüfen, die autophosphoryliert werden können. Eine möglichkeit, dies zu überwinden, ist, eine Kinase und ein bekanntes Substrat an der gleichen Stelle zu drucken. Der Co-Druck von DNA für zwei verschiedene Proteine wurde erfolgreich15erfolgreich durchgeführt, was auf die Machbarkeit dieses Ansatzes hindeutet. Darüber hinaus wird das auf dem Array angezeigte Protein möglicherweise nicht richtig gefaltet, was zu einem inaktiven Protein führt. Der Einsatz des humanbasierten Expressionssystems hat die kinase-Aktivität, gemessen auf dem Array, erheblich verbessert; Einige Proteine können jedoch aufgrund ihrer Inaktivität immer noch nicht auf dem Array analysiert werden.
Eine zweite Einschränkung ist die Messung der Phosphorylierung mit einem Pan-Anti-Phospho-Tyr-Antikörper. Trotz seiner Unspezifität bezüglich des Motivs der Phosphorylierungsstelle traten alle gemessenen Phosphorylierungen auf Tyrosinrückständen auf und hinterließen Serinen und Threonine und deren jeweilige Kiinasen. Bis heute wurden mehr als 10 Pan-Phospho-Ser/Thr-Antikörper trotz mehrerer Versuche zur Optimierung der Inkubations- und Waschbedingungen erfolglos getestet. Ein neues Detektionssystem, das unabhängig von Antikörpern ist, kann die beste Option sein, um die Anzahl der Proteinkiinasen zu erweitern, die auf Arzneimittelhemmung untersucht werden können. In diesem Zusammenhang stehen einige Optionen zur Verfügung, darunter Radioaktivität oder chemische Ansätze wie Klickkonjugation. Eine Reihe von Optimierungen sind erforderlich, um das Hintergrundsignal zu minimieren und einen guten Dynamikbereich für die Assays zu bieten.
Die dritte Einschränkung ist die Erfassung von cDNA-Klonen, die auf dem Array gedruckt werden sollen. Die cDNA-Klone können mit jeder Klontechnik generiert werden, einschließlich standortspezifischer Rekombinationssysteme, wie Creator oder Gateway23. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Klone aus der DNAsu-Bibliothek zu erwerben, die unter <https://dnasu.org/DNASU/Home.do> gefunden wird, wo mehr als 17.000 cDNAs-Klone, einschließlich des gesamten menschlichen Kinom, für den Bau von NAPPA-Arrays 24 leicht verfügbar sind. .
Die vierte Einschränkung ist, dass nicht jedes Labor mit geeigneten Geräten ausgestattet ist, um ihre eigenen NAPPA-Arrays herzustellen und zu prüfen. Dieses Protokoll bietet alternative Methoden zur Erzeugung der DNA, die auf das Mikroarray gedruckt werden soll, ohne dass Geräte mit hohem Durchsatz benötigt werden, sowie Protokolle, um alle Hybridisierungsschritte manuell auszuführen. Der Zugriff auf einen Arrayer und Einen Microarray-Scanner ist jedoch weiterhin erforderlich. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu beheben, ist die Nutzung des NAPPA-Kerndienstes und der NAPPA-Einrichtung, die unter <http://nappaproteinarray.org/> zu finden ist und maßgeschneiderte NAPPA-Mikroarrays zu einem gemeinnützigen akademischen Preis vertreibt. Schließlich sind die auf den Arrays gewonnenen Daten ab jeder Screening-Methodik anfällig für Artefakte (entweder positive oder negative) und sollten daher mit orthogonalen Assays validiert werden.
Bedeutung für bestehende Methoden Für das Screening von Proteinkiinasen stehen mehrere Plattformen im Handel zur Verfügung. Ein routinemäßig verwendeter Ansatz sind Bindungstests, die mit Proteinfragmenten, Kinase-Domäne, größeren Proteinfragmenten mit der Kinase-Domäne und einigen regulatorischen Regionen und sogar Voll-Längen-Proteinen durchgeführt werden können. Die Proteine werden in der Regel in bakteriellen Systemen aufgrund der Kosten und Einfachheit in der Expression und Reinigung Protokolle ausgedrückt. Die Wechselwirkung zwischen dem Medikament von Interesse und dem Protein wird dann mit einer Art von Berichtstest wie Fluoreszenz oder Vorhandensein von Tags gemessen, zum Beispiel. Die Hauptbeschränkung dieser Reihe von Ansätzen ist die Tatsache, dass das Protein während der Interaktion mit dem Medikament nicht unbedingt aktiv ist, was zur Identifizierung falsch positiver und falsch negativer Wechselwirkungen führen kann. Proteinfragmente sind besonders anfällig für Veränderungen der Konformation und mangelnde Aktivität, und alle erhaltenen Daten sollten mit aktiven Proteinen validiert werden, vorzugsweise in ihrer vollen Form. Eine weitere Einschränkung einiger Plattformen ist die Möglichkeit, nur ATP-Analoga zu überprüfen, wodurch die Gesamtnutzung eingeschränkt wird.
Die meisten kommerziell verfügbaren Dienstleistungen für das Screening von TKIs mit enzymatischen Ansätzen verwenden nur wilde Typversionen der Kinase von Interesse, und manchmal nur ein paar ausgewählte Mutanten. Da sie wissen, dass Arzneimittelresistenz bei Patienten, die mit TKI behandelt werden, sehr häufig ist, ist es wichtig, die Arzneimittelreaktion bei verschiedenen Mutanten messen zu können, um den am besten geeigneten Inhibitor zu ersinnen. Aufgrund der Natur von NAPPA ist das Screening von Kinase-Mutanten einfach und kann leicht durchgeführt werden, und das einzige erforderliche Werkzeug ist die Einbeziehung der Kinase-Mutante in die NAPPA cDNA-Sammlung, die beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese durchgeführt werden kann.
Zukünftige Anwendungen Eine der häufigsten Behandlungsformen in der Krebstherapie mit Kinase-Inhibitoren ist die Erfassung von Mutationen im Wirkstoffziel während eines Behandlungskurses. Das Screening dieser Mutanten auf ihre Reaktion auf Kinase-Inhibitoren ist von entscheidender Bedeutung für die Auswahl der zweiten/dritten Generation von TKIs, um eine personalisierte Behandlung für jeden Patienten zu erreichen. Der hier vorgestellte Arzneimittel-Screening-Ansatz bietet eine unvoreingenommene Screening-Plattform, auf der jeder Tyrosinkinase-Inhibitor gegen eine Gruppe von Tyrosin-Kiinasen im menschlichen Genom getestet werden kann. Da die auf NAPPA-Arrays angezeigten Proteine in vitro aus der auf dem Dia gedruckten cDNA exprimiert werden, kann jede mutierte Variante problemlos in die cDNA-Sammlung integriert werden, die auf dem Array angezeigt werden soll. Die Anlage, in der die Kinase-Mutanten auf dem Array erzeugt und ausgedrückt werden können, in Kombination mit der hohen Durchsatzleistung der NAPPA-Technik, bietet eine einzigartige Umgebung für die Untersuchung von Kinase-Mutanten und deren Reaktion auf Medikamente, wodurch NAPPA für personalisiertes Arzneimittelscreening, eines der Ziele der Präzisionsmedizin.

Proteinkiinasen sind für die Phosphorylierung ihrer Targets verantwortlich und können komplexe molekulare Bahnen modulieren, die viele zelluläre Funktionen steuern (d. h. Zellproliferation, Differenzierung, Zelltod und Überleben). Die Deregulierung der Kinase-Aktivität ist mit mehr als 400 Krankheiten verbunden, was Kinase-Hemmer zu einer der wichtigsten Klassen von Medikamenten macht, die für die Behandlung mehrerer Krankheiten, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf- und neurologischen Erkrankungen sowie entzündlicher und Autoimmunerkrankungen1,2,3.
Mit dem Aufkommen der Präzisionsmedizin hat die Identifizierung neuer Therapien, insbesondere Kinase-Inhibitoren, eine große pharmazeutische und klinische Anziehungskraft. Mehrere Ansätze können für die Identifizierung möglicher neuer Paarvon Kinase/Kinase-Inhibitoren verwendet werden, einschließlich der De-Novo-Konstruktion von Kinase-Inhibitoren und der Identifizierung neuer Ziele für bestehende FDA-zugelassene Medikamente. Letzteres ist besonders attraktiv, da der Zeit- und Geldaufwand für die Umsetzung dieser Medikamente in Kliniken aufgrund der Verfügbarkeit früherer klinischer Studiendaten drastisch reduziert wird. Ein kanonisches Beispiel für die Umnutzung eines Kinase-Inhibitors ist Imatinib, das ursprünglich für die Behandlung chronischer myelogenöser Leukämie (CML) durch die Hemmung von BCR-Abl entwickelt wurde, das auch erfolgreich zur Behandlung von c-Kit-Überexsedern eingesetzt werden kann. gastrointestinale Stromaltumoren (GISTs)4,5,6,7.
Das Screening von Kinase-Inhibitoren kann in bindungsbezogenen Assays oder enzymatischen Assays durchgeführt werden. Die erste Klasse von Assays konzentriert sich auf Protein-Arzneimittel-Wechselwirkungen und kann Informationen wie Ligation Sitte und Affinität liefern. Da die Aktivität der Kinase zum Zeitpunkt dieser Tests unbekannt ist, kann eine Reihe von Wechselwirkungen aufgrund von konformen Veränderungen im Protein übersehen oder fälschlicherweise identifiziert werden. Auf der anderen Seite erfordern enzymatische Assays, dass die Proteinkiinasen aktiv sind und wertvolle Informationen über die Wirkung des Inhibitors auf die Enzymaktivität liefern, aber diese Art des Screenings ist in der Regel zeitaufwändiger und teurer. Derzeit sind beide Arten von Assays kommerziell aus verschiedenen Quellen erhältlich. Sie stellen eine zuverlässige Option für das Screening von Kinase-Inhibitoren mit einigen Einschränkungen dar, darunter: I) die meisten Methoden beinhalten das Testen mehrerer Kiinasen einzeln, was das Screening einer großen Gruppe von Proteinen kostspielig machen kann; II) Der zu prüfende Satz von Kiinasen beschränkt sich auf eine Liste vorgewählter, wildartgebundener Kinäasen und mehrerer bekannter mutierter Versionen einiger Kiinasen, was die Prüfung vieler neuer mutierter Isoformen verhindert.
In diesem Zusammenhang sind Protein-Mikroarrays eine leistungsstarke Plattform, die in der Lage ist, einige der Einschränkungen zu überwinden, die durch kommerziell verfügbare Techniken dargestellt werden. Es eignet sich für enzymatische Assays im Hochdurchsatz-Screening mit in voller Länge, aktiven Proteinen jeder Sequenz von Interesse. Die Mikroarrays können durch einen selbstzusammengesetzten Ansatz wie NAPPA (Nukleinsäure programmierbares Proteinarray) erzeugt werden, bei dem Proteine gerade rechtzeitig für die Assays exprimiert werden, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die auf dem Array angezeigten Proteine tatsächlich aktiv sind. Die auf NAPPA angezeigten Proteine werden mit humanabgeleiteten Ribosomen und Chaperonproteinen hergestellt, um die Wahrscheinlichkeit natürlicher Faltung und Aktivität zu verbessern.
Die Proteine werden zunächst programmiert, indem cDNAs, die für Gene von Interesse kodiert werden, die mit einem Capture-Tag zusammen mit einem Erfassungsmittel verschmolzen werden, auf die Mikroarray-Oberfläche gedruckt werden. Die Proteine werden dann auf den Mikroarrays mit einem In-vitro-Transkriptions- und -übersetzungssystem (IVTT) produziert, und die frisch exprimierten Proteine werden durch das Erfassungsmittel auf der Mikroarray-Oberfläche immobilisiert. Ausgedrückte NAPPA-Arrays können für die Untersuchung der auf dem Array angezeigten Proteine in einer unvoreingenommenen, hochdurchsatzigen Art und Weise8,9verwendet werden.
Zuvor wurde gezeigt, dass Proteine, die auf NAPPA-Arrays angezeigt werden, richtig gefaltet werden, um mit bekannten Partnern zu interagieren10; Darüber hinaus wurde ihre enzymatische Aktivität erstmals im Jahr 2018 genutzt, als gezeigt wurde, dass Proteinkiinasen auf dem Mikroarray-Autophosphorylat11angezeigt wurden. Bis heute wurde die NAPPA-Methodik für viele verschiedene Anwendungen verwendet, einschließlich der Biomarker-Entdeckung12,13,14,15,16,17, Protein-Protein-Wechselwirkungen10,18, Substrat-Identifikation19und Arzneimittel-Screening11. Seine Flexibilität ist eines der wichtigsten Merkmale der Plattform, die eine Anpassung an jede Anwendung ermöglicht.
Hier wird ein Protokoll zum Screening von Tyrosinkinase-Inhibitoren in selbst zusammengesetzten NAPPA-Arrays vorgestellt. Die Plattform ist für die Anzeige aktiver menschlicher Proteinkinasen und für die Analyse der Proteinkinase-Aktivität mit niedrigem Hintergrund und hohem Dynamikbereich optimiert. Zu den Änderungen, die zur Verwendung von NAPPA für das Screening von Kinase-Inhibitoren implementiert wurden, gehören: I) Veränderungen in der Druckchemie, II) Dephosphorylierung des Proteinmikroarrays vor dem Kinase-Inhibitor-Screening und III) Optimierung des Nachweises von phosphorylierte Proteine auf dem Array. Dieses Protokoll ist das erste seiner Art und liefert einzigartige Informationen über die Kinase-Studie in NAPPA-Mikroarrays.

<table><tbody><tr><td>Reagenz/Material364 Well-Platten</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(zum Arraying)</td><td>Genetix</td><td>x7020</td><td></td></tr><tr><td>800 & micro; L 96-Well-Auffangplatte</td><td>Abgene</td><td>AB-0859</td><td></td></tr><tr><td>96-poliges Gerät</td><td>Boekel</td><td>140500</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Millipore-Sigma</td><td>1.00066</td><td></td></tr><tr><td>Aceton 99,9%</td><td>Millipore Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumdichtung für 96-Well-Platten</td><td>VWR</td><td>76004-236</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilan (3-Aminopropyltriethoxysilan)</td><td>Pierce</td><td>80370</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Antikörper, hergestellt in Maus</td><td>Millipore Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag Kaninchen Antikörper (polyklonal)</td><td>Millipore Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphat Dinatriumsalzhydrat</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>bakteriologischer Agar</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungspuffer</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>37535</td><td></td></tr><tr><td>Brij 35</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>BP345-500</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (Bis-Sulfosuccinimidyl)</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Rinderserumalbumin)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>DeepWell Block, Karton mit 50</td><td>ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0661</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Wasser</td><td>Ambion</td><td>9906</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA-interkalierender Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>P11495</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Millipore-Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Filterplatten</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA77002804</td><td></td></tr><tr><td>Gasdurchlässige Dichtungen, Packung mit 50</td><td>ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>Glasbox</td><td>Wheaton</td><td>900201</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl (Salzsäure)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Pufferlösung</td><td>Millipore-Sigma</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>IVTT-System für den Menschen</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoPure Maus IgG Ganzmolekül</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>31202</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Kaliumchlorid)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4(Kaliumphosphat monobasisch)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Kinase-Puffer</td><td>Cell Signaling</td><td>9802</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (Kaliumacetat)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P1190</td><td></td></tr><tr><td>Lambda-Proteinphosphatase</td><td>new england biolabs</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25X60I24789001LS</td><td></td></tr><tr><td>Metallgestell mit 30 Objektträgern ohne Griffe</td><td>Wheaton</td><td>900234</td><td></td></tr><tr><td>MgCL2 (Magnesiumchlorid)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Natriumorthovanadat)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Natriumchlorid)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc (Natriumacetat)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (Natriumhydroxid)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.10 / 740414.10</td><td></td></tr><tr><td>Nucleoprep Anion II</td><td>Macherey Nagel</td><td>740503.1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure</td><td>Millipore-Sigma</td><td>79617</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung (0,01%)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A-005-C</td><td></td></tr><tr><td>Proteinphosphatase (Lambda)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Natriumdodecylsulfat)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Natriumdodecylsulfat)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Dichtung</td><td>Grace Bio-Labs, Inc</td><td>44904</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumdioxid-Pakete</td><td>VWR</td><td>100489-246</td><td></td></tr><tr><td>Single-Well-Platte</td><td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat (3M, pH 5,5)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>TB Medien (hervorragende Brühe)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T0918</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>IBI wissenschaftliche</td><td>IB70144</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstungen</td><td>Maker/ Modell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programmierbarer Kühlinkubator</td><td>Torrey Pines IN30 Inkubator mit Kühlschüttler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>für Bakterienwachstum</td><td>ATR Multitron Shaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumverteiler mit Flüssigkeitsabfallfalle</td><td>MultiScreenVacuum Manifold 96 Well</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Well Autopippetor/Liquid Handler</td><td>Genmate oder Biomek FX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigkeitsspender</td><td>Wellmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Microarrayer</td><td>Genetix QArray2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatische Hybridisierungsstation</td><td>Tecan HS4800 Pro Hybridisierungsstation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microarray-Scanner</td><td>Tecan PowerScanner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microarray Datenquantifizierung</td><td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kinase-inhibitor-screening in selbstmontierten humanen protein-mikroarrays

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Das Screening von Kinase-Inhibitoren ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Eigenschaften eines Arzneimittels und für die Identifizierung potenziell neuer Ziele mit klinischen Implikationen. Es wurden mehrere Methoden berichtet, um ein solches Screening durchzuführen. Jeder hat jedoch seine eigenen Grenzen (z. B. das Screening nur von ATP-Analoga, die Beschränkung auf die Verwendung von gereinigten Kinase-Domänen, erhebliche Kosten im Zusammenhang mit der Prüfung von mehr als ein paar Kinasen gleichzeitig und mangelnde Flexibilität bei der neuartigen Mutationen). Hier wird ein neues Protokoll vorgestellt, das einige dieser Einschränkungen überwindet und für das unvoreingenommene Screening von Kinase-Inhibitoren verwendet werden kann. Eine Stärke dieser Methode ist ihre Fähigkeit, die Aktivität von Kinase-Inhibitoren über mehrere Proteine hinweg zu vergleichen, entweder zwischen verschiedenen Kinasen oder verschiedenen Varianten derselben Kinase. Es werden selbst zusammengesetzte Proteinmikroarrays eingesetzt, die durch die Expression von Proteinkiinasen durch ein humanbasiertes In-vitro-Transkriptions- und -translationssystem (IVTT) erzeugt werden. Die auf dem Mikroarray angezeigten Proteine sind aktiv, was die Messung der Wirkung von Kinase-Inhibitoren ermöglicht. Im folgenden Verfahren werden die Protokollschritte im Detail beschrieben, von der Mikroarraygenerierung und dem Screening bis zur Datenanalyse.

Selbstzusammengesetzte NAPPA-Mikroarrays bieten eine solide Plattform, die für viele verschiedene Anwendungen verwendet werden kann, einschließlich Biomarker-Erkennung, Protein-Protein-Wechselwirkungen, Substrat-Identifikation und Arzneimittelscreening10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
Die allgemeine Methodik für die Untersuchung der Kinaseaktivität und das Screening von Tyrosin-Kinaseninhibitoren auf NAPPA-Mikroarrays ist schematisch in Abbildung 1dargestellt. Zunächst werden NAPPA-Mikroarrays durch die Immobilisierung von cDNA und Capture-Agent auf die beschichteten Mikroarrays erzeugt. Die cDNAs werden dann als Vorlage für die Transkription und Translation von Proteinen unter Verwendung eines humanbasierten IVTT-Systems verwendet, und die neu synthetisierten Proteine werden durch das Erfassungsmittel9immobilisiert. Die Qualität des gedruckten Mikroarrays kann überwacht werden, indem die DNA-Werte (Bestätigung des konsistenten Drucks) oder des auf dem Array angezeigten Proteins (Bestätigung der Proteinexpression und -erfassung; Abbildung 1). Um das Hintergrundsignal zu verringern und den Dynamikbereich des Experiments zu erhöhen, werden die Mikroarrays mit 1) Lambdaphosphatase behandelt, um Diephosphorylierung aus Ser/Thr/Tyr-Rückständen zu entfernen, dann mit 2) DNase, um die Chemie vor Ort zu vereinfachen und zu verringern Hintergrund (Abbildung 1).
Der nächste Schritt ist die Autophosphorylierungsreaktion, bei der Mikroarrays ohne ATP (negative control array, auch als dephosphorylierte Mikroarrays) mit Kinase-Puffer inkubiert werden und der Kinase-Puffer durch ATP (Positive Control, autophosphorylierte Arrays) oder ATP + DMSO (Fahrzeugsteuerung). Es sollte betont werden, dass in diesem Schritt keine Kinase hinzugefügt wird; Daher wird die intrinsische Aktivität jeder Kinase, die auf dem Mikroarray angezeigt wird, durch Messung ihrer Phosphorylierungswerte mit einem Pan-Anti-Phospho-Tyrosin-Antikörper, gefolgt von einem cy3-labbeled sekundären Antikörper , quantifiziert (Abbildung 1).
Die Qualitätskontrolle der NAPPA-Kinase-Arrays, die ein Panel mit menschlichen Proteinkinasen zeigen, die in Quadruplikat gedruckt sind, ist in Abbildung 2dargestellt. Die Konzentrationen der immobilisierten DNA wurden durch DNA-Färbung gemessen und es zeigte ein gleichmäßiges Signal über das Mikroarray, was darauf hindeutet, dass die Menge der auf dem Array gedruckten DNA einheitlich war. Es ist auch möglich, mehrere Merkmale ohne DNA-Färbung zu beobachten. Diese Merkmale entsprechen einigen Kontrollen, bei denen DNA aus dem Druckmix weggelassen wurde [d.h. leere Flecken (nichts wurde gedruckt), Wasserflecken, gereinigter IgG-Spot (Polylysin, Verlinker und gereinigtes IgG), nur Druckmischung (vollständiger Druckmix: Polylysin plus Verlinker und Anti-Flag-Antikörper, ohne DNA)]. Die auf den NAPPA-Kinase-Mikroarrays angezeigten Proteinmengen wurden nach der IVTT-Reaktion mit Anti-Tag-Antikörpern bewertet.
Für das Kinase-Screening wurde Flag als Tag der Wahl verwendet und der auf dem Mikroarray angezeigte Proteingehalt wurde mit einem Anti-Flag-Antikörper gemessen. Wie gezeigt, zeigte die Mehrheit der Flecken, die cDNA enthalten, erfolgreich nachweisbare Proteinmengen an. Einige der Kontrollpunkte ohne cDNA zeigten auch Signal mit dem Anti-Flag-Antikörper: IgG-Spot (verwendet, um die Aktivität des sekundären Antikörpers zu erkennen) und leere Vektorflecken (cDNA-Codes nur für das Tag) (Abbildung 2). NAPPA-Kinase-Mikroarrays zeigten eine gute Reproduzierbarkeit unter Dias, wobei die Korrelation der Proteindarstellungsniveaus unter verschiedenen Druckchargen höher als 0,88 war (Abbildung 2). Innerhalb desselben Stapels war die Korrelation sogar noch höher, nahe 0,92 (Daten nicht dargestellt).
Als nächstes wurde die Kinase-Autophosphorylierungsaktivität der auf dem Array angezeigten Proteine mit Anti-Phospho-Tyrosin-Antikörpern gemessen (Abbildung 3). Protein, das auf dem Array angezeigt wurde, zeigte einen hohen Gehalt an Proteinphosphorylierung nach Expression(Abbildung 3, links), die durch die intrinsische Kinaseaktivität des auf dem Array angezeigten Proteins oder durch aktive Kinasen im IVTT-Mix verursacht werden kann. Diese Phosphorylierung wurde vollständig mit Lambda-Phosphatase-Behandlung entfernt und diese Mikroarrays wurden für die Kinase-Assays verwendet. Nach der Dephosphorylierung zeigten Autophosphorylierungsreaktionen, die ohne ATP durchgeführt wurden, wie erwartet keine signifikanten Konzentrationen der Phosphorylierung, während Mikroarrays, die in Gegenwart von ATP mit Kinasepuffer inkubiert wurden, eine Proteinphosphorylierung bereits 15 min zeigten ( Abbildung 3). Für das Arzneimittelscreening wurde die Kinaseaktivität nach 60 min Der Autophosphorylierungsreaktion gemessen, um die Anzahl der getesteten Kiinasen zu maximieren.
Der Vergleich zwischen Mikroarrays, bei denen die Phosphorylierungswerte direkt nach der Proteinexpression gemessen wurden(Abbildung 3, links) und nach 60 min Autophosphorylierungsreaktion(Abbildung 3, rechts) zeigte: i) nur phosphorylierte Proteine nach der Expression, was darauf hindeutet, dass sie exogen durch Proteine auf dem IVTT-Mix phosphoryliert werden können, aber nicht autophosphoryliert werden können; ii) Protein, das erst nach der Autophosphorylierungsreaktion phosphoryliert wurde, was darauf hindeutet, dass diese Proteine nach der Proteinexpression nicht aktiv waren und Co-Faktoren im Kinasepuffer erforderten, um aktiv zu sein; oder iii) Protein phosphoryliert auf beiden Arrays, was darauf hindeutet, dass sie in beiden Einstellungen aktiv waren (Abbildung 3).
Als Beispiel für die Ergebnisse, die für das Screening von Tyrosinkinase-Inhibitoren auf NAPPA-Kinase-Arrays erzielt wurden, wurden drei Kinaseninhibitoren mit unterschiedlicher Selektivität über Proteinkinasen hinweg verwendet: Staurosporin, Imatinib und Ibrutinib. Für alle Screenings wurden dephosphorylierte NAPPA-Mikroarrays mit zunehmenden TKI-Konzentrationen (von 100 nM bis 10 uM) während der Autophosphorylierungsreaktion inkubiert. Der erste getestete TKI war Staurosporin, ein globaler Proteinkinase-Inhibitor, der eine starke Kinase-Hemmung auf dem Mikroarray über praktisch alle getesteten Kinasen zeigte11.
Als nächstes wurde Imatinib getestet, ein ABL- und C-Kit-Hemmer zur Behandlung von chronischer myelogener Leukämie und gastrointestinalen Stromaltumoren4,5,6,7. Bei NAPPA-Kinase-Arrays zeigte Imatinib eine signifikante Verringerung der Abl1- und BCR-Abl1-Aktivität, während andere Kinasen weitgehend unberührt blieben (Abbildung 4A). Die Datenquantifizierung für die Kinaseaktivität wurde mit dem dephosphorylierten Array normalisiert und als Prozentsatz des Positivkontrollmikroarrays (nur Fahrzeug) dargestellt. Die Daten für TNK2 (non-relevant kinase), Abl1 und BCR-Abl1 sind in Abbildung 4Bdargestellt. Wie erwartet zeigte Imatinib eine selektive Hemmung gegenüber Abl1 und BCR-ABl1. Die Daten für c-Kit waren aufgrund mangelnder Aktivität auf den Positivkontroll-Arrays nicht schlüssig.
Schließlich wurde Ibrutinib, ein von der FDA zugelassener kovalenter Inhibitor der Bruton-Tyrosinkinase (BTK), getestet. Ibrutinib wird derzeit bei der Behandlung mehrerer blutbedingter Krebsarten mit überaktiver BTK, einschließlich chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Mantelzelllymphom, und Waldenströms Makroglobulinämie21,22. Abbildung 4C, ist repräsentativ für die typischen Ergebnisse, die für das Ibrutinib-Screening erzielt wurden. Die Kinaseaktivität von ABL1 (nicht relevante Kinase) und BTK (kanonisches Ziel) und ERBB4 (potenzielles neues Ziel) ist in Abbildung 4Ddargestellt. Die Daten deuten darauf hin, dass ERBB4 durch Ibrutinib in einer dosisspezifischen Weise gehemmt werden kann. Diese Hemmung wurde in vitro und in zellbasierten Assays11bestätigt, was die Leistungsfähigkeit dieser Plattform demonstrierte.
Zusammengenommen deuten die Daten darauf hin, dass die NAPPA-Kinase-Mikroarray-Plattform für das unvoreingenommene Screening von TK-Inhibitoren verwendet werden könnte. Darüber hinaus ist das Screening schnell und kann leicht angepasst werden, um jede Variation der Protein-Kinasen von Interesse zu umfassen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Qualitätskontrolle und Dessiebung von Tyrosinkinase-Inhibitoren in NAPPA-Arrays. NAPPA-Arrays werden mit cDNA-Codierung für das Protein von Interesse gedruckt, das mit einem Tag und einem Capture-Antikörper verschmolzen ist. Während der In-vitro-Transkription und Translationsreaktion (IVTT) werden die synthetisierten Proteine durch den Capture-Antikörper auf der Mikroarray-Oberfläche durch das Tag erfasst. Die Qualitätskontrolle (QC) der Arrays erfolgt durch die Messung der auf dem Dia aufgedruckten DNA-Werte unter Verwendung eines fluoreszierenden DNA-interkalierenden Farbstoffs und der auf dem Array angezeigten Proteinmengen mit tagspezifischen Antikörpern. Für das Kinase-Screening werden die Mikroarrays nach der IVTT-Reaktion mit DNase und Phosphatase behandelt, um die gedruckte DNA und alle Phosphorylierungen zu entfernen, die während der Proteinsynthese aufgetreten sein können. Die dephosphorylierten Arrays sind nun bereit, für den Drogen-Bildschirm verwendet werden. Für jeden Test werden routinemäßig drei Sätze von Kontrollen verwendet: (I) dephosphorylierte Arrays, bei denen die Autophosphorylierungsreaktion ohne ATP durchgeführt wird; (II) autophosphorylierte Mikroarrays, bei denen die Autophosphorylierungsreaktion in Gegenwart von ATP durchgeführt wird; und (III) DMSO-behandeltes Array (Fahrzeug), in dem die Autophosphorylierungsreaktion mit ATP und DMSO durchgeführt wird. Die mit unterschiedlicher Konzentration von Kinase-Inhibitoren behandelten Dias folgen genau dem gleichen Protokoll, das für die DMSO-behandelten Arrays verwendet wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der Qualitätskontrolle für selbstmontierte NAPPA-Kinase-Arrays. Gezeigt werden DNA-Gehalt, gemessen durch einen fluoreszierenden DNA-interkalierenden Farbstoff (links) und Proteingehalte, die auf dem Mikroarray gemessen werden, gemessen durch Anti-Flag-Antikörper (Mitte). Auf der rechten Seite befindet sich ein Korrelationsdiagramm der Proteinspiegel, die auf zwei NAPPA-Kinase-Arrays in separaten Chargen gedruckt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der Kinase-Aktivität in NAPPA-Kinase-Arrays. Mikroarrays, die Proteinkinasen in Quadruplicate zeigen, wurden verwendet, um die Proteinkinase-Aktivität auf dem Array durch die Messung der Proteinphosphorylierung mit Anti-PTyr-Antikörpern zu untersuchen, gefolgt von cy3-markiertem Anti-Maus-Antikörper. Kontrollarrays ohne Phosphatase/DNase-Behandlung und ohne ATP während der Autophosphorylierungsreaktion wurden verwendet, um die Hintergrundphosphorylierung nach Proteinexpression (Postexpression) zu messen. Die übrigen Mikroarrays wurden mit Phosphatase/DNA behandelt, und die Autophosphorylierungsreaktion wurde ohne ATP (dephosphoryliertes Mikroarray, Negativkontrolle) oder mit ATP (autophosphorylierte Mikroarrays) durchgeführt. Bei den autophosphorylierten Mikroarrays wurde die Autophosphorylierungsreaktion für 15 min, 30 min, 45 min oder 60 min durchgeführt, wie gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Daten vom Tyrosinkinase-Bildschirm auf NAPPA-Kinase-Arrays. (A) Phosphatase/DNase behandelte NAPPA-Kinase-Arrays wurden während der Autophosphorylierungsreaktion in zunehmenden Konzentrationen von Imatinib inkubiert und die Kinaseaktivität mit Anti-Phospho-Tyr-Antikörpern gemessen. (B) Quantifizierung der Kinase-Aktivität, die an NAPPA-Kinase-Arrays beobachtet wurde, die Imatinib ausgesetzt sind. Die Daten wurden gegen das Signal der Negativkontroll-Arrays (dephosphoryliert) normalisiert und als Prozentsatz der positiven Kontrollarrays (Autophosporylierungsreaktion in Gegenwart von DMSO) angezeigt. Ähnliche Daten werden für das Screening von Ibrutinib (C,D) angezeigt. Diese Zahl wurde von Rauf et al.11geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1. Alternatives Protokoll zum Screening von Tyrosinkinase-Inhibitoren in NAPPA-Arrays mit einer automatisierten Hybridisierungsstation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von selbstzusammengesetzten menschlichen Proteinmikroarrays zum Screening von Kinase-Inhibitoren wird vorgestellt.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA ist eine leistungsstarke Protein-Mikroarray-Plattform, die für die Untersuchung der Proteinaktivität und -funktion in einer unvoreingenommenen Hohen Durchsatz-Manier verwendet werden kann. Die auf NAPPA angezeigten Proteine werden in einem menschlichen Expressionssystem mit menschlichen abgeleiteten Ribosomen und Chaperonen hergestellt, um die Wahrscheinlichkeit natürlicher Faltung und Aktivität zu verbessern. Die Verwendung von NAPPA-Arrays zum Screening von Kinase-Inhibitoren bietet eine neue Plattform für den Test neuer Medikamente und klinisch relevanter Kinase-Mutationen.Protein-Mikroarrays, die durch die NAPPA-Methodik erzeugt werden, können für viele verschiedene Anwendungen verwendet werden, einschließlich Biomarker-Erkennung, Protein-Protein-Wechselwirkungen, Substrat-Identifikation und Arzneimittelscreening. Führen Sie unterwegs Qualitätskontrollschritte durch. Testen Sie die Qualität Ihrer DNA-Präparation, des DNA-Mikroarrays und des Protein-Mikroarrays.Wenn in irgendeinem Schritt die Qualität nicht gut ist, fangen Sie einfach von vorne an. Das Verfahren wird Lisa Miller demonstrieren, eine Technikerin in meinem Labor. Um das bakterienwachstum für den hauseigenen Hochdurchsatz Mini-Vorbereitung vorzubereiten, impfen Sie zuerst die Bakterien in der Schneckenplatte in einem 96-Well-Format und lassen Sie sie 16 Stunden wachsen.Am nächsten Tag füllen Sie jeden Brunnen der tiefen Brunnenplatte mit 1,5 Millilitern tollem Brühemedium, ergänzt mit Antikörper-Ampicillin. Der Antikörper hängt vom Selektionsmarker auf dem Plasmid ab. Dann sterilisieren Sie ein 96-Polies-Gerät mit 80% Ethanol und Flamme.Verwenden Sie das sterile 96-Pin-Gerät, um Kolonien aus der über Nacht bebrüteten Agarplatte zu pflücken und in die Brunnen der Tiefenbrunnenplatte zu tauchen, um die Kultur zu impfen. Bedecken Sie den Block mit einer gasdurchlässigen Dichtung und brüten Sie 22 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 300 bis 800 Umdrehungen pro Minute auf einem Shaker. Danach, Pellet Kulturen und resuspend die Kulturen nach dem Manuskript.Lyse Bakterien durch Zugabe von 200 Mikroliter Lösung zwei in jedem Brunnen, versiegeln Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung, und invertieren fünfmal. Inkubieren Sie die Zellen für genau fünf Minuten. Um die Lösung zu neutralisieren, fügen Sie 200 Mikroliter Lösung drei hinzu, versiegeln Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung und invertieren Sie fünfmal.Dann drehen Sie die Platte bei 3800 G, vier Grad Celsius, für 30 Minuten, um den Lysatüberstand zu löschen. Um anionenaustauschen den Harzplatten zuzubereiten, mischen Sie zunächst die Anionenaustauschschlämme und gießen Sie die Gülle in einen Glastrog. Stapeln Sie Filterplatten auf einer tiefen Brunnenplatte, um als Abfallsammelbehälter zu fungieren.Dann, mit breit bordweiten P1000-Spitzen, mischen Sie die Gülle und übertragen Sie 450 Mikroliter der Gülle in jeden Brunnen der Filterplatten. Zentrifugieren und entsorgen Sie den Durchfluss. Nun, übertragen Sie die Lysat überlagert Überstand auf den Stapel von Harzplatte und tiefen Brunnen block.Drehen Sie die gestapelten Platten für fünf Minuten bei 30 mal G mit langsamster Anlaufgeschwindigkeit und entsorgen Sie den Durchfluss. Um die Säule zu waschen, fügen Sie 400 Mikroliter Lösung N3 Waschpuffer zu jedem Brunnen. Übertragen Sie die Harzplatte auf Vakuumkrümmer, um den Waschpuffer zu entfernen.Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal und entfernen Sie dann alle verbleibenden Waschpuffer mit einer kurzen fünfminütigen Drehung bei 30-mal G.To die DNA, legen Sie die Harzplatte auf eine saubere 800 Mikroliter Sammelplatte. Fügen Sie 300 Mikroliter Lösung N5 zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie es bei Raumtemperatur für zehn Minuten sitzen. Dann drehen Sie die gestapelten Platten für fünf Minuten bei 20 mal G mit langsamer Anfahrgeschwindigkeit auf 233 mal G für eine Minute.Platten vor gebrauchen bei minus 20 Grad Celsius lagern. Legen Sie zunächst die Dias auf ein Gestell und tauchen Sie die Dias in ein Glasreservoir, das die Beschichtungslösung von 2% Aminosilanreagenz in Aceton enthält. Rock die Rutschen für 15 Minuten.Dann spülen Sie die Dias in Aceton gefolgt von einer letzten Spüle in Wasser. Anschließend trocknen Sie die Schlitten mit Druckluft. Blasen auf sie aus allen Winkeln für etwa drei Minuten, bis alle Wassertröpfchen entfernt wurden.Bewahren Sie die beschichteten Dias bei Raumtemperatur auf einem Metallträger in einer dicht verschlossenen Box auf. Nun, fahren Sie fort, die DNA, wie in der Handschrift beschrieben, zu stürzen. Dann setzen Sie das DNA-Pellet in 20 Mikroliter Reinstwasser wieder auf und schütteln Sie es zwei Stunden lang bei 1000 Umdrehungen pro Minute.Um eine Arrayprobe vorzubereiten, fügen Sie jeder DNA-Probe 10 Mikroliter frisch zubereiteter Druckmischung hinzu, die Antikörper, Verklinker und Polylysin enthält. Platten mit Alufolie versiegeln und bei Raumtemperatur 90 Minuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute schütteln. Lagern Sie die Teller über Nacht bei vier Grad Celsius.Am Drucktag kurz wirbeln und drehen Sie die Platten. 28 Mikroliter jeder Probe auf eine 384-Well-Platte übertragen. Legen Sie die aminosilanbeschichteten Dias und die 384-Well-Platte auf das Arrayer-Deck und starten Sie das Microarray-Druckprogramm.Wenn der Druckvorgang abgeschlossen ist, beschriften Sie die Mikroarrays. Die Mikroarrays können monatelang bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. Um die DNA-Werte zu messen, legen Sie die Dias in eine Pipettenbox und blockieren Sie sie mit 50 Millilitern Sperrpuffer.Inkubieren Sie die Rutschen auf einem Schaukelshaker bei Raumtemperatur für eine Stunde. Entsorgen Sie dann die Lösung und fügen Sie 20 Milliliter Blockierpuffer und 33 Mikroliter fluoreszierenden DNA-Interkalierenden Farbstoff hinzu. 15 Minuten mit Aufregung inkubieren.Nach der Inkubation ist die Dias schnell mit reinem Reinstwasser abspülen und mit Druckluft trocknen. Die Mikroarrays können gescannt werden. Um die Mikroarrays auszudrücken, blockieren Sie die Dias wie zuvor gezeigt und spülen Sie sie dann mit reinem Ultrawasser ab und trocknen Sie sie mit gefilterter Druckluft.Befestigen Sie eine Dichtung an jeder Rutsche. Fügen Sie 130 Milliliter In-vitro-Transkription und Übersetzungsmischung auf die Dias und massieren Sie die Dichtungen sanft, so dass sich die In-vitro-Transkriptions- und Translationsmischung ausbreitet und den gesamten Bereich des Arrays ohne Blasen abdeckt. Tragen Sie die kleinen runden Hafendichtungen auf beide Ports auf.90 Minuten bei 30 Grad Celsius zur Proteinexpression inkubieren, gefolgt von 30 Minuten bei 15 Grad Celsius zur Immobilisierung des Abfrageproteins. Dann entfernen Sie die Dichtung, waschen Sie die Dias dreimal für jeweils fünf Minuten in 15 Milliliter TBST mit Milch, und blockieren Sie in der gleichen Lösung für eine Stunde. Für den Nachweis der Proteine auf dem Array, entfernen Sie die TBST mit Milch, legen Sie die Dias auf eine Gitterplatte, und wenden Sie 600 Mikroliter primärer Antikörper, Maus Anti-Flag, verdünnt ein bis zweihundert, und 1x TBST mit 5% Milch ergänzt.Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Dias mit 50 Millilitern 1x TBST und 5% Milch auf dem Schaukelschüttler dreimal für jeweils fünf Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang für den sekundären Antikörper.Nachdem die einstündige Inkubation vorbei ist, waschen Sie die Dias mit 1x TBST dreimal für jeweils fünf Minuten auf den Schaukelschüttler. Dann spülen Sie die Dias schnell mit reinem Reinstwasser ab und trocknen Sie mit Druckluft. Die Dias können gescannt werden.Um die Phosphatase- und DNase-Behandlung durchzuführen, waschen und blockieren Sie die exprimierten Dias mit TBST, ergänzt mit 3%BSA, wie im Manuskript beschrieben. Dann legen Sie die Dias auf eine Gitterplatte und tragen 200 Mikroliter Phosphatase-DNase-Lösung auf. Legen Sie einen Mikroarray-Abdeckungsschlupf auf die Oberseite, um Verdunstung zu vermeiden.Bei 30 Grad Celsius für eine Stunde und 30 Minuten im Ofen brüten. Dann rutschen Sie mit 1x TBST und 0,2 Mol Natriumchlorid auf dem Schaukelschüttler dreimal für jeweils fünf Minuten. Um die medikamentöse Behandlung und Kinase-Reaktion durchzuführen, legen Sie die Dias auf die Gitterplatte und wenden Sie 200 Mikroliter Der Wirkstoffkinaselösung auf.Legen Sie einen Deckelschlupf auf die Oberseite, um Verdunstung zu vermeiden. Eine Stunde bei 30 Grad Celsius im Ofen brüten. Der Schlüssel zu reproduzierbaren Daten ist die konsistente Inkubationszeit über Folien hinweg.Dies ist besonders wichtig während der Kinase-Reaktion. Die für die Verarbeitung der einzelnen Folien erforderliche Zeit sollte berücksichtigt werden. Danach rutschen Sie dreimal für jeweils fünf Minuten mit 1x TBST und 0,2 Molnatriumchlorid auf den Schaukelschüttler.Wiederholen Sie den Proteinnachweis unter Verwendung als primärer Antikörper phosphotyrosin Antikörper verdünnt ein bis 100 in TBST, ergänzt mit 3%rinderserum albumin. Verwenden Sie 1x TBST und 3%rinderserumalbumin zum Waschen nach der Inkubation mit primärem Antikörper und TBST für Waschungen nach Inkubationen mit sekundärem Antikörper. Waschen und trocknen wie bisher.Laden Sie die Mikroarrays zur Bildaufnahme in das Diahaltermagazin. Laden Sie das Magazin in den Microarray-Scanner ein. Scannen Sie alle Mikroarrays mit den optimierten Einstellungen und denken Sie daran, die automatische Verstärkung auszuschalten, wenn Sie Bilder über Experimente hinweg vergleichen.Übertragen Sie die Bilder in eine Quantifizierungssoftware, richten Sie das Raster an den Spots aus und quantifizieren Sie die Signalintensität jedes Features auf dem Mikroarray. Fahren Sie mit der statistischen Analyse fort. In dieser Studie zeigte das Mikroarray, dass die Mehrheit der Flecken, die komplementäre DNA enthalten, erfolgreich nachweisbare Proteinmengen aufweisen.NAPPA-Kinase-Mikroarrays zeigten eine gute Reproduzierbarkeit unter Dias, wobei die Korrelation der Proteindarstellungsniveaus unter verschiedenen Druckchargen höher als 0,88 war. Repräsentative Ergebnisse der Kinase-Aktivität in NAPPA-Kinase-Arrays zeigten einen hohen Gehalt an Proteinphosphorylierung nach expression. Der Vergleich zwischen Mikroarrays, bei denen die Phosphorylierungswerte direkt nach der Phosphatase-Behandlung und nach 60 Minuten Autophosphorylierungsreaktion gemessen wurden, deutet auf das Vorhandensein aktiver Proteinkiinasen auf dem Array hin.Bei NAPPA-Kinase-Arrays zeigte Imatinib eine signifikante Verringerung der ABL1- und BCR-ABL1-Aktivität, während andere Kinasen weitgehend unbeeinflusst blieben. Die Kinase-Aktivität normalisierte sich gegen das dephosphorylierte Array und stellte als Prozentsatz der Positivkontrolle Mikroarray sprägpunktte selektive Hemmung von Imatinib zu ABL1 und BCR-ABL1. Typische Ergebnisse für das Ibrutinib-Screening zeigten, dass die Kinase-Aktivität der Nicht-relevanten Kinase ABL1 nicht beeinflusst ist.BTK kanonisches Ziel und ERBB4 potenzielles neues Ziel, zeigte reduzierte Aktivität in Gegenwart von Ibrutinib. Die Daten deuten darauf hin, dass ERBB4 durch Ibrutinib dosisspezifisch gehemmt werden kann. Der Erfolg von Protein-Mikroarray-Screenings hängt stark von der Qualität des Mikroarrays selbst ab.Mehrere positive und negative Kontrollfunktionen sollten verwendet werden, um eine ordnungsgemäße Datenanalyse zu ermöglichen. NAPPA-Kinase-Assay ist eine Screening-Plattform, und als solche sollten die erhaltenen Daten in Follow-up-Assays validiert werden, die In-vitro-Kinase-Assays oder zellbasierte Assays umfassen können. Da unser Protokoll mit cDNA beginnt, kann jede Kinasemutation oder -variation leicht in das Mikroarray integriert und mit hohem Durchsatz untersucht werden.Bei der Herstellung der Anionenaustauscherharzschlämme und Platten wird die Verwendung von Masken empfohlen, um eine mögliche Einatmung der Harzpartikel zu verhindern.

kinase-inhibitor-screening-in-self-assembled-human-protein-microarrays

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Video demonstrieren wir den amplifizierten lumineszierenden homogenen Proximity-Assay – einen Bead-basierten Proximity-Assay. Es verwendet homogen große Akzeptor- und Donorkügelchen, die mit zwei Proteinen immobilisiert sind, die dazu neigen, zu interagieren, um potenzielle kleine Moleküle zu screenen, die Proteininteraktionen hemmen.

Amplifizierter lumineszierender homogener Proximity-Assay: Ein bead-basierter Proximity-Assay zum Screening kleiner Moleküle, die Protein-Protein-Wechselwirkungen hemmen

Eine geführte Material-Screening Ansatz zur Sol-Gel abgeleiteten Protein-Microarrays mit dotierten eine aufstrebende Pin-Druckverfahren der Fertigung entwickeln beschrieben. Diese Methodik wird durch die Entwicklung von Acetylcholinesterase-und Multi-Kinase-Microarrays, die für eine kostengünstige Screening kleiner Moleküle verwendet werden aufgezeigt.

A Guided Materialien Screening-Ansatz für die Entwicklung von Quantitative Sol-Gel-Derived Protein Microarrays

Verwendung von Protein-Mikroarrays enthält fast die gesamte S. cerevisiae Proteom ist für schnelle unvoreingenommene Abfragetausende von Protein-Protein-Wechselwirkungen in parallel sondiert. Dieses Verfahren kann für die Protein-Kleinmolekül, posttranslationale Modifikation und andere Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

Peptid-Array-Screening ist ein Hochdurchsatz-Assay zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionsstellen. Dies ermöglicht die Kartierung mehrerer Wechselwirkungen eines Zielproteins und kann als Methode zur Identifizierung von Stellen für Inhibitoren dienen, die auf ein Protein abzielen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Screening und zur Analyse von Peptidarrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Die Proteinphosphorylierung ist ein zentrales Merkmal der Art und Weise, wie Zellen Informationen in ihrem extrazellulären Milieu interpretieren und darauf reagieren. Hier stellen wir ein Hochdurchsatz-Screening-Protokoll vor, bei dem Kinasen verwendet werden, die aus Säugetierzellen gereinigt wurden, um schnell Kinasen zu identifizieren, die ein oder mehrere Substrate von Interesse phosphorylieren.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening

Von Patienten stammende Xenotransplantate von Glioblastoma multiforme können mit Hilfe eines humanen 3D-Biogel-Kultursystems in lebende Mikrotumoren miniaturisiert werden. Dieser in vivo-ähnliche 3D-Tumorassay eignet sich für Drug-Response-Tests und molekulares Profiling, einschließlich kinomischer Analysen.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Antikörper-Arrays zu Veränderungen im Signalwege in verschiedenen zellulären Modellen zu identifizieren. Diese Veränderungen, verursacht durch Medikamente/Hypoxie/ultra-violet Licht/Strahlung oder durch Überexpression/Herabregulation/Knockouts, sind wichtig für die verschiedenen Krankheitsmodelle und können angeben, ob eine Therapie wirksam werden oder Mechanismen der Drogen identifizieren kann Widerstand.

Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschriften, zu bereichern und Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe z. B. eine Zelle lysate oder Gewebe Homogenat zu identifizieren. Diese Methode nutzt die einzigartigen Aspekte der CK2 Biologie für diesen Zweck.

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Erfahren Sie das NAPPA-basierte Hochdurchsatz-Screening von Kinase-Inhibitoren mit selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays. Diese Methode ermöglicht die vergleichende Analyse von Inhibitorwirkungen über mehrere Kinasen und deren Varianten hinweg.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

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