Name: Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Verwendung des dualen Reporter-Systems BIRFLU zur Live-Bildgebung von Influenza A-Virus-Infektionen in Mäusen. Diese Methode ermöglicht simultane in vitro und in vivo Analysen zur Untersuchung viraler Dynamik und antiviraler Wirksamkeit.

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Die Forschung zum Influenzavirus im LABOR LM-S wird teilweise durch das New York Influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C) finanziert, ein Mitglied des NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS) Contract No. HHSN272201400005C (NYICE) und vom Department of Defense (DoD) Peer Reviewed Medical Research Program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Forscher haben sich auf rekombinante Reporter-exezierende Viren als lebenswichtige molekulare Werkzeuge verlassen, um das aktuelle Verständnis von Virusreplikation und Pathogenese zu verstehen und zu erweitern26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. Die am häufigsten bevorzugten Reportergene sind Luziferasen und fluoreszierende Proteine, hauptsächlich aufgrund der technologischen Fortschritte bei der Identifizierung, Entwicklung verbesserter Varianten und Detektion durch Bildgebungstechnologien43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Rekombinante Reporterviren werden häufig verwendet, um virologische Assays zu beschleunigen, die Dynamik von Viren in vitro und in vivo zu untersuchen und die Wirksamkeit derzeit zugelassener oder neuer Impfstoff- und Therapieansätze zu testen26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Leider beschränkten sich im Fall von IAV frühere Studien auf die Expression eines einzelnen Reportergens, was die Art der Studie behindert, die durchgeführt werden könnte 26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. Um diese Einschränkung zu vermeiden, haben wir einen replikationskompetenten Bi-Reporter IAV generiert, der eine Nluc-Luziferase und ein Venusfluoreszenzprotein (BIRFLU) ausdrückt.
In diesem Bericht beschreiben wir die In-vitro-Charakterisierung von BIRFLU und die experimentellen Ansätze, MIT BIRFLU virale Infektionen in vivo mit Hilfe eines Mausmodells der IAV-Infektion zu verfolgen. BIRFLU Nluc und Venus Expression korreliert mit viralen Titern. Darüber hinaus blieb BIRFLU stabil und drückte weiterhin beide Reportergene aus, nachdem sie aus der Lunge infizierter Mäuse geborgen worden waren. Dieser Ansatz bietet Forschern eine ausgezeichnete Gelegenheit, IAV in kultivierten Zellen und in Tiermodellen zu untersuchen, einschließlich der Identifizierung und Entwicklung neuer therapeutischer Alternativen zur Behandlung von IAV-Infektionen.
Obwohl BIRFLU mit dem Backbone von PR8 generiert wurde, könnten andere rekombinante IAV mit unterschiedlichen Typen-, Subtype- oder Viralstamm-Backbones mit demselben experimentellen Ansatz generiert werden. Ebenso haben wir in diesem Bericht die experimentellen Verfahren für die Verwendung von BIRFLU in einem Mausmodell von IAV beschrieben. BIRFLU könnte jedoch eine wertvolle Technologie zur Bewertung von IAV-Infektionen in anderen Tiermodellen sein.

Das Influenza-A-Virus (IAV) ist ein einsträngiges, negativ-seimstiges RNA-Virus der Familie Orthomyxoviridae aus der Familie der Orthomyxoviridae1,2,3. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt die Zahl der Grippetoten auf 3-5 Millionen jährlich und mehr als 250.000 Todesfälle durch Grippe weltweit4,5,6. Zu den Gruppen, die besonders anfällig für Influenza sind, gehören ältere Menschen, immungeschwächte Personen und Kinder7,8,9,10,11. Obwohl Impfstoffe verfügbar sind und die häufigste und wirksamste Intervention gegen Virusinfektionen darstellen, ist IAV in der Lage, sich schnell zu entwickeln und vorbestehende Immunität zu entgehen3,12,13, 14 , 15. Das Wiederauftauchen eines Pandemie-H1N1-Stamms im Jahr 2009 und das Aufkommen pathogener IAV wiederholt die ständige Bedrohung der menschlichen Gesundheit weltweit4,16.
Während einer Epidemie oder Pandemie ist es entscheidend, die Pathogenität und Übertragbarkeit neu isolierter Viren schnell zu bestimmen. Derzeit verfügbare Techniken zum Erkennen des Virus sind zeitaufwändig und erfordern manchmal die Verwendung von mühsamen Ansätzen, die den Abschluss dieser Analysen verzögern können17,18,19,20. Darüber hinaus sind die derzeitigen viralen Assays schwer zu skalieren, was im Falle eines Ausbruchs erforderlich sein könnte. Schließlich wird die Verwendung validierter Tiermodelle von Infektionen, wie Mäuse, Meerschweinchen und Frettchen, routinemäßig verwendet und ist für die Untersuchung von Influenza-Infektionen, Immunreaktionen und der Wirksamkeit neuer Impfstoffe und/oder antiviraler Medikamente von entscheidender Bedeutung. Diese Modelle sind jedoch aufgrund der Unfähigkeit, die virale Dynamik in Echtzeit zu beobachten, restriktiv; Dies beschränkt die Studien auf die statische Bildgebung von Virusinfektionen21,22,23,24,25. Tiere, die in diesen Assays verwendet werden, werden auch eingeschläfert, um die Viruslast zu bestimmen, wodurch die Anzahl der Tiere, die für die Vervollständigung dieser Studien erforderlich sind, erhöht wird26. Um all diese Einschränkungen zu umgehen, verlassen sich viele Forscher auf den Einsatz rekombinanter Replikations-kompetenter, reporter-ausdrückender IAVs, die in der Lage sind, virologische Tests zu beschleunigen und die Viruslast und -verbreitung in vivo in Echtzeit zu erkennen26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Wichtig ist, dass diese Reporter-exezierenden IAVs in der Lage sind, ähnlich wie Wildtyp (WT) IAVs in der Zellkultur und in Tiermodellen der Infektion33,42zu replizieren.
Fluoreszierende und biolumineszierende Proteine sind zwei Reportersysteme, die von Forschern aufgrund ihrer Empfindlichkeit, Stabilität und Benutzerfreundlichkeit häufig verwendet werden. Darüber hinaus gibt es enorme Unterstützung und Weiterentwicklung in fluoreszierenden und biolumineszenten Proteindetektionstechnologien43,44,45,46,47,48 . Fluoreszierende Proteine und Luziferase haben unterschiedliche Eigenschaften, die sie leuchten lassen, insbesondere unterschiedlich in der Art und Weise, wie aufgeregte Zustände erzeugt werden und wie Emittance erkannt wird43,44,45, 46,47,48. Fluoreszierende Proteine werden zuerst durch absorbierende Energie angeregt, die anschließend als Licht bei einer anderen Wellenlänge freigesetzt wird, wenn die Moleküle auf einen niedrigeren Energiezustand abnehmen43. Auf der anderen Seite wird die Biolumineszenz aus einer chemischen exothermen Reaktion abgeleitet, die ein Substrat, Sauerstoff und manchmal ATP beinhaltet, um Licht zu erzeugen45. Aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften dieser beiden Arten von Reporterproteinen ist eines je nach Studie vielleicht vorteilhafter als das andere. Während fluoreszierende Proteine weit verbreitet sind, um die zelluläre Lokalisation zu beobachten28,41, haben ihre In-vivo-Signale eine unzureichende Intensität und werden oft durch Autofluoreszenz in lebenden Geweben verdeckt49. Daher verlassen sich die Forscher auf Luziferasen, um die virale Dynamik in lebenden Organismen zu bewerten, obwohl fluoreszierende Proteine für ex vivo-Studien50,51,52,53bevorzugt werden können. Im Gegensatz zu fluoreszierenden Proteinen sind Luziferasen für In-vivo-Studien bequemer und in nicht-invasiven Ansätzen eher anwendbar26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. Letztendlich müssen die Forscher auf der Grundlage der Art der Studie zwischen der Verwendung eines fluoreszierenden oder eines luziferase-Reporterproteins als Auslese wählen, das ihre Studie einem Kompromiss von Funktionalitäten und Empfindlichkeiten unterwirft, und schränkt die Nützlichkeit der rekombinanten Reporterviren ein. Darüber hinaus bestehen Bedenken hinsichtlich der Korrelation zwischen der Expression verschiedener Reportergene unter Verwendung von Fluoreszenz- oder Luziferasesystemen und der Virusreplikation oder -verbreitung, die die Interpretation der mit Reporter-ausdrückende IAVs.
Wir haben diese Einschränkung überwunden, indem wir einen rekombinanten Replikations-kompetenten Bi-Reporter IAV (BIRFLU) erzeugt haben, der sowohl für ein fluoreszierendes als auch für ein Luziferase-Protein im selben viralen Genom kodiert55 (Abbildung 1). Hier wurde NanoLuc luciferase (Nluc), ein kleines und helles biolumineszierendes Protein48, vor der Hemagglutinin (HA)-Sequenz in das virale HA-Segment der Influenza A/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Darüber hinaus wurde Venus, ein häufig verwendetes monomeres fluoreszierendes Protein, in das nicht-strukturelle (NS) virale Segment32,33,36,41,55eingeführt. Da BIRFLU sowohl für fluoreszierende als auch für luziferase Reportergene kodiert, kann entweder das Reporterproteinsignal als Auslese verwendet werden, um die Virusreplikation und -verbreitung in vitro oder in vivo55zu bestimmen. Weitere Informationen zur Erzeugung und In-vitro- oder In-vivo-Charakterisierung von BIRFLU finden Sie in unserer aktuellen Publikation55. BIRFLU kann verwendet werden, um die Wirksamkeit antiviraler Medikamente oder neutralisierender Antikörper über einen neuartigen fluoreszierenden und biolumineszenten Mikroneutralisationstest zu testen55. Darüber hinaus kann BIRFLU auch verwendet werden, um die virale Dynamik in einem Mausmodell der Infektion55zu bewerten. In diesem Manuskript beschreiben wir die Verfahren zur Charakterisierung von BIRFLU55 in vitro und wie die BIRFLU-Infektion bei Mäusen mit In-vivo-Lumineszenz-Bildgebungssystemen zum Nachweis von Nluc in vivo oder von Venus ex vivo untersucht wird.
Die Kombination modernster Techniken in der Molekularbiologie, Tierforschung und bildgebenden Technologien bietet Forschern die einzigartige Möglichkeit, BIRFLU für die IAV-Forschung zu nutzen, einschließlich der Untersuchung von Virus-Host-Wechselwirkungen, der Dynamik von Virusinfektionen; Entwicklung neuartiger Impfstoffansätze zur therapeutischen Behandlung von IAV-Infektionen oder die mögliche Verwendung von IAV als Impfstoffvektor für die Behandlung anderer Krankheitserregerinfektionen.

<table><tbody><tr><td>12-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td>Diese Software wird verwendet in 3.1.10 und 4.4.7</td></tr><tr><td>Bovin Albumin-Lösung (BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Lager bei 4 > C</td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Lagern bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Zellkulturschalen 100mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imaging System</td><td>BioRad</td><td></td><td>Dieses Instrument wird verwendet in 4.4.7</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C581-100</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinders</td><td>Thomas Scientific</td><td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Bei 4 > lagern; C</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>5 bis 7 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td>555</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td>Dieses Instrument wird für die In-vivo-Bildgebung verwendet (4.2 und 4.3)</td></tr><tr><td>IX81 Motorisiertes inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX81</td><td></td></tr><tr><td>Lebendes Bild 4.7.2 Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Dieses Instrument dient zur In-vivo-Bildgebung (4.2 und 4.3)</td></tr><tr><td>Lumicount</td><td>Packard</td><td></td><td>Dieses Gerät dient zur Quantifizierung der Luciferase-Aktivität (3.2.6)</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Epithelzellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Antikörper anti-NP Influenza A Virus HB-65</td><td>ATCC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>Bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagenz</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Dieses Reagenz wird zur Messung der Nluc-Aktivität verwendet. Bei -20 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Neutral Buffered Formalin 10%</td><td>EMD</td><td>65346-85</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>aufbewahren Nunc MicroWell 96-Well Mikrotiterplatten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td><td>Corning</td><td>30-00-CI</td><td>Bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Retiga 20000R Fast1394 Kamera</td><td>Qimaging</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Rot-konjugierte Anti-Maus-Kaninchen-Sekundärantikörper</td><td>Jackson</td><td>715-075-150</td><td>Lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Mit Tosylsulfonylphenylalanylchlormethylketon (TPCK) behandeltes Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>Bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>Vmax Store Kinetic plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein luziferasefluoreszierendes reporter-influenzavirus zur live-bildgebung und quantifizierung von virusinfektionen

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza-A-Viren (IAVs) verursachen Erkrankungen der menschlichen Atemwege, die mit erheblichen gesundheitlichen und wirtschaftlichen Folgen verbunden sind. Wie bei anderen Viren erfordert das Studium von IAV die Verwendung mühsamer sekundärer Ansätze, um das Vorhandensein des Virus in infizierten Zellen und/oder in Tiermodellen der Infektion zu erkennen. Diese Einschränkung wurde vor kurzem mit der Erzeugung von rekombinanten IAVs umgangen, die leicht rückverfolgbare fluoreszierende oder biolumineszierende (Luciferase) Reporterproteine exdrücken. Jedoch, Forscher wurden gezwungen, fluoreszierende oder luziferase Reporter Gene aufgrund der begrenzten Kapazität des IAV-Genoms für die Einbeziehung fremder Sequenzen zu wählen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir einen rekombinanten Replikations-kompetenten Bi-Reporter IAV (BIRFLU) generiert, der sowohl ein fluoreszierendes als auch ein luziferase Reporter-Gen stabil ausdrückt, um IAV-Infektionen in vitro und in vivo leicht zu verfolgen. Zu diesem Zweck wurden die viralen nichtstrukturellen (NS) und Hemagglutinin (HA) viralen Segmente der Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) modifiziert, um die fluoreszierende Venus bzw. die biolumineszierenden Nanoluzluc-Luziferase-Proteine zu kodieren. Hier beschreiben wir die Verwendung von BIRFLU in einem Mausmodell der IAV-Infektion und den Nachweis beider Reportergene mittels eines In-vivo-Bildgebungssystems. Insbesondere haben wir eine gute Korrelation zwischen den Ausdrücken von Reportern und der Virusreplikation beobachtet. Die Kombination modernster Techniken in der Molekularbiologie, Tierforschung und Bildgebungstechnologien bietet Forschern die einzigartige Möglichkeit, dieses Tool für die Grippeforschung zu nutzen, einschließlich der Untersuchung von Virus-Host-Wechselwirkungen und Virusinfektionen. Wichtig ist, dass die Möglichkeit, das virale Genom genetisch zu verändern, um zwei fremde Gene aus verschiedenen virusischen Segmenten auszudrücken, Möglichkeiten eröffnet, diesen Ansatz für folgende Möglichkeiten zu nutzen: (i) die Entwicklung neuartiger IAV-Impfstoffe, (ii) die Erzeugung rekombinanter IAVs, die kann als Impfstoffvektor für die Behandlung anderer infektionen menschlicher Erreger verwendet werden.

Generierung und Charakterisierung von BIRFLU in vitro (Abbildung 1 und Abbildung 2)
Ein rekombinantes Replikations-kompetentes IAV, das zwei verschiedene Reportergene (BIRFLU) ausdrückt, wurde mit modernster Molekularbiologie und plasmidbasierten Reverse-Genetik-Techniken konstruiert (Abbildung 1). Hier haben wir uns entschieden, Nluc aufgrund mehrerer Vorteile gegenüber anderen Luziferasen zu verwenden, einschließlich seiner geringen Größe, ATP-Unabhängigkeit, größere Intensität und optimiertem Substrat48,60. Nluc wurde in das HA-Segment von IAV PR8 geklont, gefolgt vom Schweineteschovirus (PTV) 2A Dekolleté-Stelle (2A) vor dem offenen Leserahmen (ORF) von HA (Abbildung 1). Der ORF von HA enthielt stille Mutationen, um die ursprünglichen Verpackungssignale zu entfernen und eine mögliche Rekombination zu vermeiden. Das komplette HA-Verpackungssignal wurde vor Nluc hinzugefügt, um eine ordnungsgemäße Einbindung des modifizierten HA-Segments in die Virion- und Nluc- und HA-Expression aus demselben viralen RNA-Segment zu ermöglichen (Abbildung 1). Darüber hinaus wurde das fluoreszierende Protein Venus in ein modifiziertes IAV PR8 NS-Segment geklont, das die beiden viralen Proteine NS1 und NEP aus einem einzigen Transkript32,36,41,54, 57. Zu diesem Zweck wurde Venus mit dem C-Terminal von NS1 verschmolzen und der gesamte NEP ORF wurde flussabwärts der PTV 2A-Spaltungsstelle geklont, die zwischen den NS1-Venus- und NEP-Sequenzen platziert wurde (Abbildung 1). Letztlich wurden diese beiden modifizierten HA- und NS-Virusplasmidkonstrukte in Kombination mit dem Rest der IAV PR8-Reverse-Genetik-Plasmide verwendet, um BIRFLU zu erzeugen (Abbildung 1). Die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung von BIRFLU wurde bereits55beschrieben.
In Abbildung 2charakterisierten wir in vitro BIRFLU durch Bestimmung der Venus-, Nluc- und NP-Expressionsniveaus unter Verwendung von Fluoreszenz- und indirekten Immunfluoreszenzansätzen ( Abbildung2A,B). Konfluentmonolayer von MDCK-Zellen waren entweder mock-infiziert oder infiziert (MOI 0.1) mit WT- oder BIRFLU PR8-Viren und bei 18 h nach der Infektion wurde die Venusexpression direkt mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet (Abbildung 2A,B). Die Nluc- (Abbildung 2A) und die NP- (Abbildung 2B) -Expression wurden durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern visualisiert, die für jedes Protein spezifisch sind. Wie erwartet, Venus und Nluc Expression wurden nur in Zellen mit BIRFLU infiziert und nicht in Zellen mit WT PR8 Virus infiziert. Darüber hinaus ergab die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie die NP-Expression sowohl in WT- als auch in BIRFLU PR8-infizierten Zellen. In mockinfizierten Zellen wurde erwartungsgemäß kein Ausdruck von Venus, Nluc oder NP nachgewiesen (Abbildung A,B).
Zur Bewertung der Nluc-Expressionsniveaus in vitro wurden MDCK-Zellen (MOI 0,001) mit WT- oder BIRFLU-PR8-Viren infiziert und die Nluc-Aktivität in Gewebekulturüberständen wurde mit 24, 48, 72 und 96 h nach der Infektion bewertet (Abbildung2C). Nur Nluc Aktivität wurde in Gewebekultur Überstand von MDCK-Zellen mit BIRFLU infiziert nachgewiesen (Abbildung 2C). Die Nluc-Aktivität in den Gewebekulturüberständen wurde bereits 24 h nach der Infektion mit höheren Expressionswerten bei 96 h nach der Infektion nachgewiesen, höchstwahrscheinlich, weil die zytopathische Wirkung (CPE), die während der Virusinfektion induziert wurde, das Nluc-Protein zurückließ. in die Zelle. Um die Tauglichkeit von BIRFLU in kultivierten Zellen zu bewerten, wurde auch die Wachstumskinetik von WT- und BIRFLU PR8-Viren bewertet (Abbildung 2D) und das Vorhandensein von infektiösen Viren in Gewebekulturüberstand wurde durch Immunfokus-Assay bestimmt (Abbildung 2D ). Bemerkenswert ist, dass die BIRFLU-Replikationskinetik mit der des WT PR8-Virus vergleichbar war, obwohl die BIRFLU-Replikation etwas verzögert wurde und nicht die gleichen viralen Titer wie WT PR8 erreichte. BIRFLU konnte jedoch Titer von 5 x 107 PFU/ml erreichen (Abbildung 2D), was darauf hindeutet, dass die Expression von zwei Reportergenen im viralen Genom die BIRFLU-Replikation in MDCK-Zellen nicht signifikant beeinträchtigt.
Verfolgung der BIRFLU-Infektion bei Mäusen (Abbildung 3 und Abbildung 4)
Abbildung 3 ist ein schematisches Flussdiagramm zur Beurteilung der BIRFLU-Dynamik in einem Mausmodell der IAV-Infektion. Fünf bis sieben Wochen alte weibliche BALB/C-Mäuse wurden entweder mit 1x PBS oder intranaally mit 1 x 106 PFU birFLU infiziert. Nach 3 Tagen nach der Infektion wurden Mäuse mit Isofluran befruchtet und dann mit Nluc-Substrat retro-orbital injiziert. Alle Mäuse wurden sofort in das IVIS-Instrument gelegt und das Nluc-Signal wurde in vivo mit dem IVIS bewertet. Als nächstes wurden Mäuse eingeschläfert und die Lunge geerntet. Anschließend wurden die ausgeschnittenen Lungen ex vivo mit dem In-vivo-Imager analysiert, um die Fluoreszenzintensität über die Venusexpression zu bestimmen. Schließlich wurden die Lungen der Mäuse homogenisiert und virale Titter und Stabilität durch Plaque-Assay bestimmt. Plaques wurden durch die direkte Fluoreszenz der Venus, durch Immunfärbung mit Antikörpern speziell für Nluc und durch kristallviolette Färbung beurteilt.
Zuvor beschriebene replikationskompetente Reporter-exprimierende IAVs exprimieren ein einzelnes Reportergen, am häufigsten entweder ein fluoreszierendes oder ein biolumineszierendes Protein, als Ersatz für Virusinfektionen und Replikation. BIRFLU ist jedoch in der Lage, beide Arten von Reportergenen bei einer Virusinfektion auszudrücken. Um die Korrelation zwischen Biolumineszenz (In-vivo-Bildgebung) und Fluoreszenz (Ex-vivo-Bildgebung) nach BIRFLU-Infektion zu bewerten, wurden fünf- bis sieben Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse mit 1x PBS mockinfiziert oder mit BIRFLU (106 PFU) intranasal geimpft. . Die Nluc-Aktivität (Abbildung 4A) wurde durch Verabreichung von Nluc-Substrat, das nach einer Infektion nach einer In-vivo-Bildgebungsinstrument retro-orbital injiziert wurde, untersucht. Wir haben uns entschieden, die Biolumineszenz an Tag 3 zu bewerten, weil frühere Studien darauf hindeuteten, dass die IAV-Replikation, einschließlich PR8, Spitzen zwischen den Tagen 2 und 4 nach der Infektion24,54. Die Biolumineszenz wurde überwacht (Abbildung 4A, oben) und zur Berechnung des durchschnittlichen Gesamtflusses (Flux (log10 p/s) (Abbildung4A, unten). Wie vorhergesagt, zeigten Mäuse, die mit BIRFLU geimpft wurden, eine hohe Biolumineszenzaktivität, aber bei Mock-infizierten Mäusen wurde kein Signal nachgewiesen. Danach wurden die Lungen infizierter Mäuse geerntet und die Venusexpression mittels Ex-vivo-Bildgebung bewertet (Abbildung4B, oben). Darüber hinaus wurde die durchschnittliche Strahlungseffizienz der Fluoreszenz berechnet (Abbildung4B, unten). Die ausgeschnittenen Mäuselungen wurden auch homogenisiert, um die viralen Titter und die genetische Stabilität von BIRFLU in vivo zu bestimmen (Abbildung 4C,D). Die genetische Stabilität von BIRFLU wurde durch Plaque-Assay mit den viren isoliertaus Mäuselungen und fluoreszierender Mikroskopie (Venus, oben), Immunostainierung (Nluc, Middle) und kristallvioletter Färbung (unten) analysiert. BIRFLU, die sich aus Mäusen erholten, konnte Plaques bilden und drückt beide Reportergene stabil aus (Abbildung 4C). Insbesondere beobachteten wir eine gute Korrelation zwischen Biolumineszenz und Fluoreszenzsignalen mit Virusreplikation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der IAV PR8 WT- und BIRFLU-Virionenstruktur und der Genomsegmente. IAV sind von einem Lipid-Doppelschichtmittumsatous umgeben, das die beiden großen viralen Glykoproteine Hemagglutinin (HA; schwarz) und Neuraminidase (NA; blau) enthält. IAV enthalten acht einsträngige, negative RNA-Segmente (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M und NS). Jedes virale Segment enthält nicht-kodierende Regionen (NCR) an den Enden 3' und 5' (Black boxes). Auch am 3' und 5' Ende der viralen (v)RNAs sind die Verpackungssignale, die für die effiziente Kapselung von vRNAs in aufkeimende Virionen (weiße Boxen) verantwortlich sind. IAV PR8 HA und NS virale Segmente und Produkte sind schwarz indiziert. Sequenzen von Nluc, Venus und PTV 2A sind in roten, grünen bzw. gestreiften Boxen angegeben. Die schematische Darstellung der modifizierten HA- und NS-Segmente, die Nluc bzw. Venus in BIRFLU ausdrücken, sind ebenfalls angegeben. Diese Figur wurde von Nogales et al.55adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> Abbildung 2: In-vitro-Charakterisierung von BIRFLU. (A, B) Analyse der Proteinexpression durch direkte Fluoreszenz und Immunfluoreszenz. MDCK-Zellen wurden mit PR8-WT- oder BIRFLU-Viren infiziert (MOI 0.1). Infizierte Zellen wurden bei 18 h nach der Infektion fixiert, um die Venusexpression durch direkte fluoreszierende Mikroskopie direkt zu visualisieren und die Nluc -A) und virale NP -B) Expression mit spezifischen Antikörpern und indirekter Immunfluoreszenz zu visualisieren. Kerne wurden mit DAPI befleckt. Repräsentative Bilder (20-fache Vergrößerung) werden gezeigt. Skalenbalken = 100 m. (C, D) Wachstumskinetik von PR8 WT und BIRFLU. Nluc Activity (C) und virale Titer (D) in Gewebekultur Überstand aus MDCK-Zellen infiziert (MOI 0.001) mit WT und BIRFLU PR8 Viren wurden zu den angegebenen Zeiten nach der Infektion bewertet. Die Daten stellen das Mittel der SD von Triplicaten dar. Virale Titter wurden durch Immunfokus-Assay (FFU/mL) bestimmt. Gepunktete Linie bezeichnet die Nachweisgrenze (200 FFU/ml). Diese Figur wurde von Nogales et al.55adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> Abbildung 3: Schematische Darstellung für die Studie von BIRFLU bei Mäusen. Die Expression von Nluc- und Venus-Reportergenen wurde bei Mäusen untersucht, die mit 1 x 106 PFU birFLU mittels in vivo- oder ex vivo-Bildgebung infiziert waren. Kurz gesagt, am Tag 1, 5 bis 7 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden verspottet (1x PBS) oder mit 1 x 106 PFU birFLU intranasal geimpft. Am Tag 3 nach der Infektion wurden Mäuse leicht mit Isofluran anästhesiert und Nluc-Substrat wurde retro-orbital injiziert. Das Nluc-Signal wurde direkt mittels In-vivo-Bildgebung bewertet. Unmittelbar nach der Bildgebung wurden Mäuse eingeschläfert und die Expression der Venus in der ganzen ausgeschnittenen Lunge mittels Ex-vivo-Bildgebung analysiert. Die zurückgewonnene Mäuselunge wurde homogenisiert, um die Virusreplikation und Stabilität durch Plaque-Assay zu bewerten. Pfeile zeigen Korrelation zwischen Fluoreszenz (Venus), Immunostainierung (Nluc) und kristallvioletter Färbung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> Abbildung 4: In-vivo-Biolumineszenz und Fluoreszenzexpression. Weibliche fünf bis sieben Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden verspottet (1x PBS) oder mit 1 x 106 PFU BIRFLU intranasal geimpft. Am Tag 3 nach der Infektion wurde die Nluc-Aktivität (A) in der ganzen Maus bestimmt. Repräsentative Bilder einer einzelnen Maus mit Einer Strahlungsskala (p/sec/cm2/sr). Die Strahlenwerte für die Biolumineszenz wurden quantisiert und der durchschnittliche Gesamtfluss wird angezeigt (Flux (Log10 p/s). Nach der Nluc-Bildgebung wurde die Lunge für die Ex-vivo-Bildgebung geerntet (B). Repräsentative Bilder aus der ganzen Lunge werden gezeigt. Um die Venusexpression zu quantifizieren, wurden die Mittelwerte der Interessengebiete (ROIs) von mockinfizierten Mäusen auf Lungen-Autofluoreszenz normalisiert und Faltenänderungen berechnet. Um die genetische Stabilität von BIRFLU in vivo zu analysieren, wurden Viren, die aus der Lungendeslunge von Mäusen gewonnen wurden, mittels Plaque-Assay mittels fluoreszierender Mikroskopie (Venus, oben), Immunostainierung (Nluc, Middle) und kristallvioletter Färbung (unten) (C) analysiert. Repräsentative Bilder von einer Maus werden angezeigt. Zur Bewertung der Virusreplikation wurden ganze Lungen nach der Bildgebung homogenisiert und zur Infizierung von MDCK-Zellen und zur Bestimmung von Virustitern mittels Plaque-Assay (PFU/mL) (D) verwendet. Pfeile zeigen Korrelation zwischen Fluoreszenz (Venus), Immunostainierung (Nluc) und kristallvioletter Färbung. Balken stellen den Mittelwert von Lungenvirus-Tittern dar. Diese Figur wurde von Logales et al.55adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gewebekultur Medien und Lösungen</td>
			<td>komposition</td>
			<td>lagerung</td>
			<td>benutzen</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Gewebekulturmedien: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 10 % Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin-L-Glutamin (PSG) (DMEM 10 % FBS 1% PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, 50 ml FBS und 5 ml 100x PSG.</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Wartung von MDCK-Zellen</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Medien nach der Infektion: DMEM 0.3% Bovine Albumin (BA), 1% PSG (DMEM 0.3 % BA 1% PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4,2 ml 35 % BA und 5 ml 100x PSG</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Wartung von MDCK-Zellen nach einer Virusinfektion</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Phosphat gepufferte Saline (PBS)</td>
			<td>80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. ddH2O bis 1 L hinzufügen. pH auf 7,3 einstellen</td>
			<td>zimmertemperatur</td>
			<td>So bereiten Sie 1x PBS vor</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x PBS</td>
			<td>10x PBS mit ddH2O verdünnen</td>
			<td>zimmertemperatur</td>
			<td>Waschzellen</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Infektionsmedien: 1x PBS, 0,3% BA, 1% Penicillin-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS).</td>
			<td>487 ml 1x PBS steril, 4,2 ml 35% BA und 5 ml 100x 1% PS(100 U/ml)</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Virale Infektionen</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Fixierungs-/Permeabilisationslösung: 4% Formaldehyd, 0,5% Triton X-100 in 1x PBS verdünnt.</td>
			<td>400 ml neutral gepuffertes Formalin 10%, 5 ml Triton X-100 und 595 ml 1x PBS</td>
			<td>zimmertemperatur</td>
			<td>Fixierung und Permeabilisierung von MDCK-Zellen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Blockierlösung: 2,5% Rinderserum Albumin (BSA) in 1x PBS.</td>
			<td>2,5 g BSA in 97,5 ml 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Blockierlösung für Immunfluoreszenz und Plaque-Assays.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antikörperverdünnungslösung (1% BSA in 1x PBS)</td>
			<td>1 g BSA in 99 ml 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Verdünnung von primär- und sekundären Antikörpern.</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1% kristallviolette Lösung</td>
			<td>1 g Kristallviolett in 400 ml Methanol. 600 ml ddH2O hinzufügen</td>
			<td>zimmertemperatur</td>
			<td>Färbung von MDCK-Zellen in Plaque-Assays.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tosylsulfonylphenylalanylchlormethylketon (TPCK)-behandeltes Trypsin</td>
			<td>Bereiten Sie eine 1.000x Stofflösung bei 1 mg/ml in ddH2O vor</td>
			<td>-20 °C</td>
			<td>Bei Virusinfektionen.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Gewebekulturmedien und -lösungen.

Influenza-A-Viren (IAVs) sind ansteckende Atemwegserreger, die jährliche Epidemien und gelegentliche Pandemien verursachen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Verfolgung viraler Infektionen in vivo mit einer neuartigen rekombinanten Luziferase und fluoreszenz-exzierenden Bi-Reporter IAV (BIRFLU). Dieser Ansatz bietet Forschern ein ausgezeichnetes Werkzeug, um IAV in vivo zu studieren.

Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Forscher haben bisher rekombinante Influenzaviren erzeugt, die entweder fluoreszierende oder biolumineszierende Proteinreporter ausdrücken. Ein Teil unserer einzigen Expression von Reportergenen im Influenzavirus schränkt seine Verwendung in Experimenten stark ein. Unser Protokoll beschreibt die Verwendung von Bireporter-Influenza-Viren, die sowohl fluoresent als auch biolumineszierende Reportergene ausdrücken und damit ihre Begrenzung überwinden.Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung eines einzigen rekombinanten Influenzavirus für In-vitro- und In-vivo-Studien. Bei der Durchführung dieser Technik, schnelle Injektion von Luziferase Substrat und die richtige Planung der Mäuse Handhabung ist wichtig, weil das Substrat schnell metabolisiert wird. Auch die Rasur von Mäusen wird empfohlen, um den Nachweis von biolumineszierendem Signal zu verbessern.Um die Mäuse zu infizieren, beginnen Sie mit der Vorbereitung der BIRFLU in 1X PBS. Halten Sie das Virus auf Eis bis zur Impfung. Prüfen Sie, ob der Zehenkniffreflex fehlt, um sicherzustellen, dass die Maus beästhept ist, und impfen Sie ihn intranasal mit der vorbereiteten BIRFLU-Verdünnung.Stellen Sie sicher, dass alle Mäuse richtig atmen, bevor Sie sie in ihre Käfige zurückbringen. Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware, und drücken Sie Initialize, und legen Sie dann die Parameter fest, die für die Bildgebung verwendet werden. Um die mit BIRFLU infizierten Mäuse zu überwachen, rasieren Sie ihre Brust, um den Nachweis des biolumineszierenden Signals zu verbessern.Sobald die Mäuse anästhesiert sind, verwenden Sie eine 22-Messgerät-Nadel, um retro-orbital 100 Mikroliter Nluc-Luziferase-Substrat zu verabreichen, verdünnt ein bis zehn in PBS. Unmittelbar nach der Injektion die Tiere mit nach oben gerichteter Brust in die Isolationskammer geben. Legen Sie dann die Isolationskammer in das Bildgebungsinstrument, schließen Sie die Tür und erfassen Sie Bilder.Nach der Bildgebung kehren Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt haben. Verwenden Sie das ROI-Tool für die Bildgebungssoftware, um die erfassten Biolumineszenzdaten zu analysieren, indem Sie eine Region von Interesse und Klickmaß ausbilden. Um ex vivo Bildgebung der Mauslungen durchzuführen, sammeln Sie die Lunge gemäß den Manuskriptrichtungen, starten Sie die Bildaufnahmesoftware und legen Sie die Parameter für die Bildgebung fest.Sobald die Maschine initialisiert ist, legen Sie die Lunge in eine schwarze Hintergrundschale und stellen Sie sicher, dass die Gewebe voneinander getrennt sind. Führen Sie das Fach in den Bildträger ein, schließen Sie die Tür und erfassen Sie Bilder. Nach der Bildgebung entfernen Sie das Gewebe sofort und lagern Sie es bei vier Grad Celsius auf Eis, wenn die Proben am selben Tag verarbeitet werden.Wenn sie später verarbeitet werden, frieren Sie sie schnell in einer Röhre auf Trockeneis ein und lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius. Um die Bilder zu verarbeiten, wählen Sie das ROI-Tool aus, zeichnen Sie Interessenbereiche um jede einzelne Lunge und klicken Sie auf Maß. BIRFLU wurde in vitro durch die Bestimmung der Venus-, Nluc- und NP-Expressionsniveaus in infizierten Zellen charakterisiert.Venus- und Nluc-Expression werden nur in von BIRFLU infizierten Zellen nachgewiesen, während NP sowohl in Wildtyp-PR8- als auch in BIRFLU-infizierten Zellen exprimiert wird. In Mock-infizierten Zellen wird kein Ausdruck beobachtet. Darüber hinaus wurde die Nluc-Aktivität in Gewebekulturüberstandanten bei 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion gemessen.Es wird bereits 24 Stunden nach der Infektion erkannt, und die Ausdruckswerte erhöhen sich bei 96 Stunden. Es kann auch nachgewiesen werden, dass die Replikationskinetik von BIRFLU mit dem Wildtyp-PR8-Virus vergleichbar ist. BIRFLU hat die Fähigkeit, sowohl fluoreszierende als auch biolumineszierende Reportergene auszudrücken, und die Korrelation zwischen den beiden kann mit Hilfe von In-vivo- und Ex-vivo-Bildgebung einer Mauslunge beurteilt werden.Die Lunge von mit BIRFLU infizierten Mäusen zeigte eine hohe Biolumineszenz in vivo und Fluoreszenz ex vivo. Virale Titer und genetische Stabilität von BIRFLU in vivo wurden ebenfalls bestimmt. Plaque-Assays zu den Viren aus der Mauslunge zeigten, dass das Virus Plaques bilden und beide Reportergene ausdrücken kann.BIRFLU könnte auch verwendet werden, um die Wirksamkeit antiviraler und neutralisierender Antikörper gegen Influenza zu bewerten. Die Ergebnisse dieser Assays waren alle miteinander korreliert und sind schnell und einfach zu tun.

a-luciferase-fluorescent-reporter-influenza-virus-for-live-imaging

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Mit Hilfe Luciferase und in vivo bildgebende Systeme (IVIS) als neuartiges Mittel gegen Krankheiten Endpunkte zu identifizieren, bevor klinische Entwicklungen auftreten. IVIS hat uns erlaubt, in Echtzeit visualisiert die Invasion der encephalitische Viren über mehrere Tage, eine genauere Krankheit Modell für zukünftige Studie. Es hat uns auch die Möglichkeit, die potenziellen Schutzfunktionen von Virostatika und Impfstoffen schneller als derzeit genutzt Tiermodellen zu identifizieren. Die...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Das Video zeigt den Luciferase-Assay, der zur Quantifizierung von Luciferase-markierten Proteinen verwendet wird. Der Assay verwendet ein künstlich hergestelltes Luciferase-Enzym, das aus einem großen Fragment besteht, das an das kleine Fragment bindet, das mit einem Protein von Interesse konjugiert ist. Die gebundenen Untereinheiten bilden ein aktives Enzym, das in Gegenwart des Substrats ein Lumineszenzsignal freisetzt. Dieses Signal wird dann mit einem Luminometer quantifiziert.

Der Luciferase-Assay: Ein Hochdurchsatz-Assay zur Messung von Lumineszenzsignalen mit Hilfe von Bioreportern auf Basis von Nanoluziferase-Systemen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Verfolgung von Virusinfektionen in Mausmodellen mit einem rekombinanten Luciferase- und Fluoreszenzprotein-exprimierenden bi-Reporter-Influenza-A-Virus. Diese Methode ermöglicht sowohl in vivo- als auch ex vivo-Studien, die es den Forschern ermöglichen, Einblicke in die virale Dynamik und die Auswirkungen von Interventionen zu gewinnen.

Ein Luziferase-fluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Verfolgung von Virusinfektionen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen. Nicht infizierte und virusinfizierte Zellen wurden mit mRNAs co-transfiziert, die für Glühwürmchen-Luziferase (Fluc) und Renilla-Luziferase (Rluc) ko-transfizieren, wobei die Fluc-mRNA eine 5'-Poly(A)-Leader-Sequenz enthielt. Nach dem Hinzufügen von biolumineszierenden Substraten zu lysierten Zellen messen Sie das Signal von beiden Luciferasen, um den translationalen Vorteil der Fluc...

Ein Luciferase-Reporter-Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen

Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Dieser Artikel stellt eine auf Hochdurchsatz-Luziferase-Expression basierende Methode zur Titration verschiedener RNA- und DNA-Viren mit automatisierten und manuellen Liquid Handlern vor.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Dieses Protokoll beschreibt die Dynamik von Virusinfektionen unter Verwendung von Luciferase- und Fluoreszenz-exprimierenden rekombinanten (r)SARS-CoV-2 und einem in vivo Bildgebungssystem (IVIS) in transgenen K18 hACE2-Mäusen, um den Bedarf an sekundären Ansätzen zu überwinden, die zur Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo erforderlich sind.

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

Erfahren Sie die Verwendung des dualen Reporter-Systems BIRFLU zur Live-Bildgebung von Influenza A-Virus-Infektionen in Mäusen. Diese Methode ermöglicht simultane in vitro und in vivo Analysen zur Untersuchung viraler Dynamik und antiviraler Wirksamkeit.

Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

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