Name: Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Inokulation von Metarhizium-Blastosporen und die Hämolymphegewinnung bei Rhipicephalus microplus für Immunologie- und Pathologiestudien. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zecken-Immunantworten.

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Diese Studie wurde zum Teil von der Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) aus Brasilien, Finanzcode 001, finanziert. CAPES vergab ein Doktorandenstipendium für A.F. Marciano. Wir danken dem Nationalen Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq) Brasiliens für die Bereitstellung von Promotionsstipendien für J. Fiorotti. Diese Forschung wurde auch durch Stipendien der Carlos Chagas Filho Foundation for Research of the State of Rio de Janeiro (FAPERJ) und CNPq unterstützt. V.R.E.P. Bittencourt ist CNPq-Forscher.

Zecken, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, stammen aus einer künstlichen Kolonie, die an der Federal Rural University of Rio de Janeiro betrieben wird und deren Methoden vom Ethikausschuss für die Verwendung von Vertebraten-Tieren genehmigt wurden (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Zick engmaschte Weibchen
<ol><li>Nach der Zeckenauflösung, waschen Sie engreibige Weibchen mit Leitungswasser und tauchen Sie sie in 0,5% (v/v) Natriumhypochlorit-Lösung für 3 min in einem 500 ml Glasbecher-Empfänger, für die Kutikelhygiene (Abbildung 1), dann trocknen Sie alle Weibchen mit sterilen Papierhandtüchern (Abbildung Abbildung 2).</li>
	<li>Teilen Sie die Weibchen in homogenen Gruppen auf (mit je 20 Weibchen): Eine Gruppe ohne jegliche Behandlung, eine Kontrollgruppe geimpft mit 5 μL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan Monooleat wässrige Lösung (v/v), und eine Infekt-Gruppe geimpft mit 5 μL bei 1,0 x 10 7 Blastospores mL-1. NOTE: Für die Lautstärke und Hämozytenkonzentration wurden nur unbehandelte Zecken verwendet. Drei Nachbildungen jeder Gruppe wurden durchgeführt.</li>
</ol>2. Pathogene Impfung zwischen dem Skutum und dem Kapitulum
NOTE: In der vorliegenden Studie wurden entomopathogene Pilzaufhängungen als Beispiel herangezogen.
<ol><li>Suspend Pilzblöcke in 1 mL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan wässrige Lösung (v/v) und passen Sie sich auf eine Endkonzentration von 1,0 x 107 Blastospores mL-1. Fügen Sie einen Aliquot von 5 μL Metarhizium-Blastosporen (Abbildung 3) an die Oberfläche einer Kunststoffparaffinfolie. Hinweis: Die Aufhängung von Metarhizium blastospores wurde mit einer Neubauer ́s Kammereingestellt. Um den Impfprozess zu beschleunigen, können mehrere Blasen auf die Kunststoffparaffin-Folienfläche gesetzt werden, die jeweils 5 μL entsprechen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine ultrafeine Insulinspritze von 1 mL und eine 0,3 mm-Nadel, um die Aufhängung zu ziehen und in die Zecke zu impfen. Denken Sie daran, die ganze Luft aus der Spritze zu nehmen, bevor Sie sie verwenden.</li>
	<li>Enoculate 5 μL der Pilzaufhängung in die Zeckenweibchen zwischen dem Sutum und dem Kapital. Inoculate Weibchen aus der Kontrollgruppe mit 5 μL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan monooleat wässrige Lösung (v/v) ohne Pilz. Hinweis: Nach dem Einsetzen der Nadel kann auf dem Foramen ein kleines Volumen an Hämatymphe vorhanden sein. Achten Sie darauf, die Luft nicht zu impfen.</li>
</ol>3. Inokulation der entomopathogenen Pilze zwischen dem Beinthoch und dem Körper der Zecke
<ol><li>Inoculate Weibchen mit Pilzfederung (5 μL bei 1,0 x 107 Blastospores mL-1) zwischen dem Beinzehen und dem Körper des Weibchens, mit einer 1 mL ultrafeinen Insulinspritze, die mit einer 0,3 mm-Nadel gekoppelt ist. Inoculate Weibchen aus der Kontrollgruppe mit 5 μL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan monooleat wässrige Lösung (v/v). Hinweis: Wenn die Impfung zwischen dem Beinzehen und dem Körper des Zeckenweibchens durchgeführt wird, kann nach dem Einsetzen der Nadel ein kleines Volumen an Hämatolymphe auf dem Zehen vorhanden sein. Achten Sie darauf, die Luft nicht zu impfen.</li>
</ol>4. Dorsal Hämatolymphensammlung
<ol><li>Verwenden Sie den Gummiteil eines geflügelten Infusionssets, ein 0,3 mm Kapillarrohr und eine gefilterte Spitze, um die Hämatolymphensammlung durchzuführen.</li>
	<li>Die Rückenhaut mit einer 0,3 mm-Nadel stören.</li>
	<li>Nach der Störung, steuern Sie sanften Druck auf den vorderen Teil des Zeckenkörpers. Beobachten Sie ein fast durchsichtiges Ziehen aus der Störungsstelle. Sammeln Sie die Hämatymphe, indem Sie die Flüssigkeit durch die Filterspitze saugen, die mit dem Gummiteil eines geflügelten Infusionssatzes gekoppelt ist, und einem 0,3 mm Kapillarrohr. Hinweis: Drücken Sie den Körper der Zecke während der Immobilisierung nicht kaum, da dies den Mittelgut stören und die Hämatymphe verunreinigen kann. Warten Sie, bis sanfter Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination ausstoßen kann.</li>
</ol>5. Häkolymphensammlung aus dem Zeckenbein
<ol><li>Die Zecke spülen, ein Stück von einem Vorderbein mit einer Schere schneiden. Hinweis: Ein oder mehrere Beine können geschnitten werden, ebenso wie das gleiche Bein kann mehr als einmal geschnitten werden.</li>
	<li>Tragen Sie sanften Druck auf das hintere Körperteil der Zecke auf. Beobachten Sie eine durchsichtige Flüssigkeitsblase, die auf der geschnittenen Stelle auftaucht, und sammeln Sie sie mit dem Kapillarrohr, wie in Schritt 4.3 beschrieben. Hinweis: Drücken Sie den Körper der Zecke während der Immobilisierung nicht kaum, da dies den Mittelgut stören und die Hämatymphe verunreinigen kann. Warten Sie, bis sanfter Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination ausstoßen kann.</li>
</ol>6. Häkolymphverarbeitung
<ol><li>Nach der Hämatolymphentnahme in 1,5 mL-Mikroröhren, die zuvor mit 30 μL-Protease-Cocktail und 82 μL Salzpuffer gefüllt waren, ablegen. Halten Sie die Mikroröhren auf Eis während der gesamten Hämatolymphensammlung.</li>
	<li>Zentrifugenproben (500 x g für 3 min bei 4 ° C). Nach der Hämatolymphzentrifugation wird sich ein weiches Pellet von Hämozyten bilden. Hinweis: Für die Hämatolymph-Quantifizierung, Quantifizieren Sie das Hämatolymphvolumen, das durch Zählen des Gesamtvolumens innerhalb des Mikrorohrs und Diskontierung des Volumens von Protease-Cocktail und Salzpuffer gewonnen wird.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Supernatant (zellfreie Hämomulymphe). Sanft die Zellen in der auf pH 7,0-7,2 angepassten Low-15-Kultur von Leibovitz wiederbeleben. Quantifizieren Sie Hämozyten, indem Sie 10 μL wiederbelebter Hämozyten in einer Neubauer-Kammer platzieren.</li>
</ol>7. Hämozyten-Probenahme Diavorbereitung
<ol><li>Schneiden Sie das Vorderbein der Zecke mit einer Schere.</li>
	<li>Tragen Sie sanften Druck auf das hintere Körperteil der Zecke auf. Beobachten Sie eine transparente Flüssigkeitsblase, die auf der geschnittenen Stelle auftaucht.</li>
	<li>Tragen Sie die Hämatolymphentropfen direkt auf saubere Mikroskop-Dias auf, danach verwenden Sie die entsprechenden Methoden, um die Zellen zu verfärben.<ol>
<li>Um die Hämozyten mit Giemsa zu färben, die Hämatymphe auf der Rutsche 30 min lufttrocken zu halten, sie bei Raumtemperatur mit Methanol für 3 min zu fixieren und in der Giemsa-Lösung (1:9 Verhältnis der Pufferlösung von Sorensen, pH 7,2) für 30 min bei Raumtemperatur zu verfärben. Waschen Sie die Dias mit fließendem Wasser, um den Überschuss an Farbstoff zu entfernen, die Rutsche lufttrocknen und die Zellen mit 400x in einem optischen Mikroskop zu bewerten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Nachahmung von Krankheitserregern ist nützlich, wenn die Studie darauf abzielt, die In-vivo-Wirkung von Mikroorganismen in experimentellen Arthropodenmodellen zu untersuchen, da sie sicherstellt, dass sich der Erreger im Inneren des Wirts befindet. Die Technik kann auch auf Impfungen wie RNA-Interferenzen (RNAi) angewendet werden. Die Inokulation zwischen dem Skutum und dem Kapitulum wird als leichter zu erbringen angesehen, schädigt aber häufig das Organ von Gené,wasdie Lebensfähigkeit<sup cl...

Die Rinderzecke, Rhipicephalus microplus,ist ein Hämatophait-Ektoparasit mit enormen negativen Auswirkungen auf die Tiere in tropischen Gebieten. Diese Zecke ist der Vektor von Krankheitserregern wie Babesiabovis, Babesia bigeminaund Anaplasma marginale , die in Kombination mit den direkten Hämorschäden, die Milch-und Fleischproduktion, Anämie und schließlich den Tod reduzieren können. Die Verluste, die durch diesen Ektoparasiten verursachtwurden, wurden in Brasilien jährlich auf 3,24 Milliarden Dollar geschätzt. Nachhaltige Methoden werden gefordert und der Einsatz von entomopathogenen Wirkstoffen gilt als vielversprechende Alternative, um den Einsatz von chemischen Akarziden 2,3,4zu reduzieren.
Entomopathogene Pilze, wie Metarhizium spp., sind natürliche Feinde von Arthropoden einschließlich Zecken, und einige Isolate können als Biocontroller verwendet werden. Diese Erreger infizieren den Wirt aktiv durch die Kutikel und kolonisieren ihren Körper2,5,6. Im Zuge der Entwicklung der Infektion werden zelluläre und humorale Reaktionen durch das Zeckenimmunsystem vermittelt. Die Analyse der Zecke Hämata wird als ein nützliches Werkzeug zur Bewertung der Immunreaktionen nach der Herausforderung mit Krankheitserregern7,8berichtet.
Arthropods Immunantwort ist in humorale und zelluläre Reaktionen unterteilt. Die humorale Reaktion beinhaltet Hämoroperationen und die Produktion von antimikrobiellen Proteins-/Peptiden, während die zelluläre Immunantwort durch die Hämozyten erfolgt. Diese Zellen sind in der Hämatymphe von allen Arthropoden vorhanden und werden berichtet, um eine ausdrucksstarke Rolle in Studien mit angeborenen Immunantwort9 zuentwickeln, da es direkt mit der Phagozytose und Verkapselung. Demnach können Studien über Hämozyten helfen, den Todesweg zu untersuchen und Prozesse wie Autophagie, Apoptose und Nekrose zu verstehen. Bei einigen Wirbellosen als Zweiventile sieht sich die Sammlung der Hämozyten mit Einschränkungen konfrontiert, wie Zellstörungen, niedrigem Hemolymphvolumen und geringer Konzentration der wiedergewonnenen Zellen10. Sehr häufig, je nach angewandter Methodik, wird eine reduzierte Konzentration der Zellen erreicht, die sich direkt auf die Quantifizierung und Analyse der Zellen auswirkt.
Die Anzahl der Hämozyten, die in der Hämatymphe zirkulieren, ist unter den verschiedenen Arthropoden variabel und kann sich in der gleichen Art aufgrund verschiedener physiologischer Stadien wie Geschlecht, Alter und Entwicklungsstufe 11 des Arthropods verändern. Hanzyten können auch an einigen Organen haften und kurz nach dem Infektionsprozess 11 in den Kreislaufentlassenwerden. Dennoch werden die meisten Studien mit Insekten beschäftigt, während Zecken in Bezug auf ihre Physiologie und Pathologie weniger erforscht sind. Trotz der Paarungs-Impfung und Hämatolymphentnahme in Zecken sind weniger verwendet Techniken, die Etablierung von Standardmethoden hilft bei der Entwicklung von genaueren Studien.
Ziel der vorliegenden Studie war es, die am häufigsten verwendeten Methoden zur Hämatolymphentnahme und Impfung von Krankheitserregern in R. Microplus-Zecken zu vergleichen und dabei die Wirksamkeit bei der Hämatolymphenerfassung und der Hämozytenkonzentration zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Alkalische Hypochloritlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1727</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Synth</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>Weichkautschuk</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Fleck</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48900-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillare</td><td>CTechGlass</td><td>CT95-02</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze (Nadel)</td><td>BD</td><td>Artikelnummer:&nbsp; 324910</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014512</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Kulturmedium von Leibovitz&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Kasvi</td><td>K5-7105</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen</td><td>MARKE</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014593</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Kammer&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K5-0111</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr></tbody></table>

die sammlung der häkolymphe und die inokulation von metarhizium-blastospores in rhipicephalus microplus ticks towards pathology studies

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Zecken sind obligatorische hämatopophagöse Ektoparasiten und Rhipicephalus microplus hat eine große Bedeutung in der Veterinärmedizin, weil es Anämie, Gewichtsverlust, Abwertung des Gelders der Tiere verursacht und auch als Vektor von mehreren Krankheitserregern wirken kann. Aufgrund der exorbitanten Kosten für die Kontrolle dieser Parasiten, der Umweltschäden, die durch den unangemessenen Einsatz chemischer Akarzide verursacht werden, und der erhöhten Resistenz gegen traditionelle Parasitizide, der alternativen Kontrolle von Zecken, durch den Einsatz von Entomopathogene Pilze etwa wurden als interessanter Ansatz angesehen. Dennoch haben nur wenige Studien gezeigt, wie das Immunsystem der Zecke gegen diese Entomopathogene wirkt. Daher zeigt dieses Protokoll zwei Methoden, die zur Entomopathogen-Impfung in engormierte Frauen verwendet werden, und zwei Techniken, die für die Hämatolymphentnahme und die Ernte von Hämozyten verwendet werden. Die Inokulation von Krankheitserregern an der Beineinfügung in den Körper der Zecke ermöglicht die Bewertung von weiblichen biologischen Parametern im Gegensatz zur Impfung zwischen dem Sutum und dem Kapitulum, die häufig das Organ von Gené schädigt. Die Dorsal-Hämatymphe gab eine höhere Erholung als die Sammlung durch die Beine. Einige Einschränkungen der Zeckenhemolymphentnahme und-verarbeitung sind i) hohe Raten der Hämozyten-Störung, ii) Hämatolymphkontamination mit gestörtem Midgut, und iii) niedrige Hämatolymphen-Volumen-Erholung. Wenn die Hämatymphe durch den Beinschnitt gesammelt wird, braucht die Hämatymphe Zeit, um sich an der Beinöffnung zu sammeln, was den Gerinnungsprozess begünstigt. Darüber hinaus werden im Vergleich zur Rückensammlung weniger Hämozyten in der Sammlung durch das Bein gewonnen, obwohl die erste Methode als leichter durchzuführen gilt. Das Verständnis der Immunantwort in Zecken durch entomopathogene Wirkstoffe vermittelt hilft, ihre Pathogenese zu enthüllen und neue Ziele für die Zeckenkontrolle zu entwickeln. Die hier beschriebenen Impfprozesse erfordern sehr geringe technologische Ressourcen und können nicht nur zur Exposition von Zecken für pathogene Mikroorganismen eingesetzt werden. In ähnlicher Weise kann die Sammlung von Zeckenhemolymphe den ersten Schritt für viele physiologische Studien darstellen.

Dieser Artikel nähert sich der Impfung und Hämatolymphentnahme Methoden, die auf Zecken angewendet. Nach der Impfung zwischen dem BeinthOberschenkel und dem Körper der Zecke kann während des Prozesses etwas Flüssigkeit (Hämatolymphe) ausgeschieden werden; Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass bei Beendigung der Impfung keine Flüssigkeit oder Gewebe in der Nadelspitze oder an der Impfung vorhanden waren, so dass die Pilzfederung vollständig geimpft wurde. Wenn der Impfprozess korrekt dur...

Die Analyse der Zeckenhemolymphe stellt eine wichtige Quelle für Informationen darüber dar, wie einige Krankheitserreger verursachen und wie Zecken immunologisch auf diese Infektion reagieren. Die vorliegende Studie zeigt, wie man Pilzpropagiolen impfen und die Hämatymphe von Rhipicephalus microplus verzierten Weibchen sammeln kann.

Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Zecken sind hämatophagoe Ektoparasiten, Rhipicephalus microplus, im Volksmund bekannt als rinderzecken hat enorme negative wirtschaftliche Auswirkungen auf das Vieh in tropischen Gebieten. Darüber hinaus stimulieren zunehmende Sorgen über degradierte Umweltbedingungen und Sorgen um die öffentliche Gesundheit, die durch den unsachgemäßen Einsatz chemischer Akarizide und die zunehmende Resistenz von Zeckenpopulationen gegen traditionelle Parasiten verursacht werden, die Forschung über alternative Kontrollmethoden, wie die Verwendung von entomopathogenen Pilzen. Diese Entomopathogene infizieren aktiv Arthropodenwirte durch ihre Nagelhaut und besiedeln ihren Körper.Der Arthropode kann unterschiedliche Reaktionen auf die Pilzinfektion haben. Arthropoden Immunsystem ist in humorale und zelluläre Reaktionen unterteilt. Die humorale Reaktion beinhaltet HemagglutinationSprozess und Produktion von antimikrobiellen Molekülen, während Hämozyten die zelluläre Immunantwort vermitteln.Die meisten Studien über Arthropoden Immunantwort werden mit Insekten berichtet, während Zeckenreaktionen weniger erforscht bleiben. Auch Pathogen-Inokulation und Zeckenhämäule-Sammlung sind schlecht weit verbreitete Techniken notwendig, um die Immunantwort des Arthropoden besser zu verstehen. Dementsprechend wird in diesem Video die Techniken zur Verfilmung der Impfung, der Hämolympheund-Sammlung und -Verarbeitung verwendet.Da Zeckenhämozyten Ernte mit einigen Einschränkungen konfrontiert, wie Zellen Disruption, niedrigen Hämolymph-Wert erhalten, und niedrige Konzentration der wiedergewonnenen Zellen. Direkte Infizierung auf Zellenkonfiguration und -analyse. Nach dem Zeckensammeln, waschen engorged Weibchen.Verwenden Sie Leitungswasser und tauchen Sie sie in 0,5% Natriumhypochloritlösung für drei Minuten in einem 500 Milliliter Glasbecher Empfänger. Teilen Sie die Weibchen für die Nagelhauthygiene in homogene Gruppen mit jeweils 20 Weibchen auf. Es wurden drei Repliken jeder Gruppe durchgeführt.Metarhizium robertsii blastospores wurden im Impfprozess verwendet. Fügen Sie auf eine Flüssigkeit von fünf Mikroliter metarhizium blastospores Suspension an die Oberfläche einer Kunststoff-Paraffinfolie. Um den Impfprozess zu beschleunigen, können der Kunststoff-Paraffinfilmoberfläche mehrere Blasen hinzugefügt werden, jede Blase entspricht fünf Mikrolitern.Verwenden Sie eine ein Millimeter ultrafeine Insulinspritze und eine 0,3 Millimeter Nadel, um eine Suspension zu setzen und in die Zecke zu impfen. Denken Sie daran, die gesamte Luft aus der Spritze zu nehmen, bevor Sie sie verwenden. Impfen Sie 5 Mikroliter Pilzsuspension in die Zeckenhündin zwischen scutum und capitulum.Ein kleines Volumen von Hämolympium kann auf der Rahmung nach dem Nadelschnitt vorhanden sein. Achten Sie darauf, keine Luft zu impfen. Impfen Sie Weibchen mit Pilzsuspension zwischen dem Oberschenkel und dem Körper des Weibchens mit einer ein Milliliter ultrafeinen Insulinspritze, die an eine 0,3-Millimeter-Nadel gekoppelt ist.Wenn die Metarhizium blastospores Impfung zwischen dem Oberschenkel und dem Körper des Zeckenweibchens durchgeführt wird, kann nach dem Einsetzen der Nadel ein kleines Volumen hämäulend auf dem Oberschenkel vorhanden sein. Achten Sie darauf, keine Luft zu impfen. Verwenden Sie den Gummiteil einer geflügelten Infusion, die ein 0,3-Millionen-Meter-Kapillarrohr und eine Filterspitze für die Hemolymph-Sammlung verwendet.Stören Sie die weibliche dorsale Nagelhaut mit einer 0,3 Millimeter Nadel. Nach der Störung sanften Druck auf den anterialen Teil des Zeckenkörpers ausüben. Beobachten Sie eine nahezu transparente Flüssigkeit, die sich aus der Disruptionsstelle herausbündelt.Sammeln Sie die Hämolymphe, indem Sie die Flüssigkeit durch die Filterspitze saugen, die an einen Gummiteil eines geflügelten Infusionssets und ein 0,3-Millimeter-Kapillarrohr gekoppelt ist. Drücken Sie den Körper der Zecke während der Immobilisierung kaum, da dies das Mittelgut stören und die Hämolymphe kontaminieren kann. Warten Sie, bis der sanfte Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination vertreiben kann.Immobilisieren Sie die Zecke. Schneiden Sie ein Stück eines Vorderbeins. Ein oder mehrere Beine können geschnitten werden, und das gleiche Bein kann mehr als einmal geschnitten werden.Tragen Sie sanften Druck auf den hinteren Körperteil der Zecke auf. Beobachten Sie, wie eine transparente Flüssigkeitsblase auf der geschnittenen Seite auftaucht und mit dem Kapillarrohr sammelt. Drücken Sie den Körper der Zecke nicht kaum, während der Mobilisierung, weil dies das Mittelgut stören und die Hämolymphe kontaminieren kann.Warten Sie, bis der sanfte Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination vertreiben kann. Nach der Hämolymphe-Sammlung in 1,5-Milliliter Mikrotube, die zuvor mit 30 Mikroliter Protease-Cocktail und 82 Mikroliter-Saline-Puffer gefüllt waren, hinterlegen. Halten Sie die Mikroröhren während der gesamten Hämolymph-Sammlung auf Eis.Zentrifugenproben und das weiche Pellet von Hämozyten werden nach der Hämolymphzentrifugation gebildet. Für die Hämolymphquantifizierung, quantifizieren Sie das Hämolymphvolumen erhalten, indem Sie das Gesamtvolumen innerhalb des Mikroröhrens und Diskontierung des Volumens von Protease-Cocktail und Saline-Puffer erhalten. Entfernen Sie vorsichtig die überstande zellfreie Hämolymphe und hängen Sie die Zellen vorsichtig wieder auf.Quantifizieren Sie die Hämozyten, indem Sie 10 Mikroliter re-suspended Hämozyten in der Neubauer-Kammer platzieren. Für Zellen wurde ein Kulturmedium verwendet. Schneiden Sie das Vorderbein der Zecke, wenden Sie sanften Druck auf den hinteren Körperteil der Zecke an, beobachten Sie eine transparente Flüssigkeitsblase, die auf der Schnittstelle auftaucht.Tragen Sie die Hämlymphtropfen direkt auf saubere Mikroskopschlitten auf. Danach verwenden Sie geeignete Methoden, um die Zellen zu färben. Die Impfung zwischen dem Oberschenkel und der Zeckenweibliche Körper kann auch Zecken innere Organe wie Midgut und die malpighian Tubuli beschädigen.Wenn die Zecke Midgut durch die Nadel bei der dorsalen Hämolymph-Sammlung gestört wird, ist die erhaltene Flüssigkeit rot, nicht transparent. Dies weist auf eine falsche Hämolympheinsammlung hin. In diesem Fall ist die Hämolympium zu entsorgen, da sie kontaminiert ist.Hämolymphkontamination kann auch beobachtet werden, wenn die Zecke auf natürliche Weise mit hohen Belastungen von Krankheitserregern infiziert ist, oder in den letzten Schritten nach dem Todprozess durch geimpfte Krankheitserreger verursacht. Das hemlymphe Volumen, das nach der dorsalen Sammlung erhalten wird, ist höher als das Volumen, das bei der Sammlung durch das Bein erhalten wird. Trotz der Leichtigkeit der Kontamination ist in der ersten Sammelmethode höher.Auch bei der Dorsal-Sammlung war die Hämozytenkonzentration deutlich höher. Wenn richtige Hämozyten Sammlung durchgeführt wird, kann ein guter Abstrich erhalten werden und es ist möglich, verschiedene Hämozyten nach der Färbung zu unterscheiden. Dieses Video lieferte Informationen über Methoden zur Impfung von Erregern, insbesondere entomopathogenen Pilzen, in Zecken und sammeln deren Hämolymphe.Die hier vorgestellten Techniken erfordern sehr geringe technologische Ressourcen in unseren klassischen Schritten für Studien über Zeckenphysiologie, Zeckenpathologie und Zeckenimmunantwort. Die korrekte Ernte der Arthropodenzellen und die zellfreie Hämolympium ist entscheidend, um zuverlässige Informationen für nachfolgende Studien zu ermöglichen. Aus diesem Grund ist es auch wichtig, sich der häufigsten Fehler bewusst zu sein, die bei der Ausführung dieser Techniken beobachtet werden.Darüber hinaus müssen die Vorschläge dieser Studie den geeigneteren Ort für die Hämolympium-Sammlung durch Verformung oder Schneiden der Beine unter Berücksichtigung des Unterschieds in der erhaltenen Menge und der Wahrscheinlichkeit einer Kontamination bestimmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Lyme-Borreliose Studien erfordern oft Generation von Zecken mit dem Erreger Borrelia burgdorferi, ein Prozess, der dauert in der Regel mehrere Wochen infiziert. Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basierte Zecken Infektion Verfahren, das innerhalb weniger Stunden erreicht werden kann. Wir zeigen auch einer Immunfluoreszenz-Methode zur in situ-Lokalisation von B. burgdorferi in Zecken.

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Die Sammlung von infizierten Zecke Hämolymphe, Speicheldrüsen, und Speichel ist wichtig, zu untersuchen, wie durch Zecken übertragene Erreger eine Krankheit verursachen. In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie man Hämolymphe und Speicheldrüsen von der Fütterung...

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Lyme-Borreliose ist die am häufigsten berichteten Vektor-übertragene Krankheit in Nordamerika. Der Erreger ist Borrelia burgdorferi Spirochäten Bakterium übermittelt durch Schildzecken. Übertragung und Erfassung von Infektionen in Tiermodellen durch die Verwendung von Zecken Fütterung, die wir hier beschreiben optimiert.

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Diese Methode zeigt, wie Erreger Invasion in Insektenzellen mit dreidimensionalen (3D) Modellen zu visualisieren. Hemocytes von Drosophila Larven infiziert wurden mit viralen oder bakteriellen Erregern, Ex Vivo oder in Vivo. Infizierte Hemocytes wurden dann fixiert und für die Bildgebung mit einem confocal Mikroskop und anschließende zelluläre 3D-Rekonstruktion befleckt.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein von lebensfähigen Mikrobiota in Tick Eingeweide mit einem modifizierten vollständig-hängen in-situ Hybridisierung Ansatz räumlich und zeitlich zu bewerten.

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von microRNAs aus Zeckenspeicheldrüsen und gereinigten extrazellulären Vesikeln. Dies ist ein universelles Verfahren, das häufig verwendete Reagenzien und Verbrauchsmaterialien kombiniert. Die Methode ermöglicht auch die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zecken, was zu hochwertigen microRNAs führt, die leicht sequenziert werden können.

Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Die Elektroporation ist eine schnelle, weit verbreitete Methode zur Einführung exogener DNA in die Gattung Rickettsia. Dieses Protokoll bietet eine nützliche Elektroporationsmethode für die Umwandlung von obligaten intrazellulären Bakterien in der Gattung Rickettsia.

Eine Elektroporationsmethode zur Transformation von Rickettsien spp. mit einem fluoreszierenden Protein-exprimierenden Shuttle-Vektor in Zeckenzelllinien

Wir beschreiben eine Methode, um quantifizierbare Hämolymphe effizient aus kleinen Arthropoden für die anschließende Analyse zu gewinnen.

Eine präzise und quantifizierbare Methode zur Hämolymphentnahme von kleinen Gliederfüßern

In diesem Artikel wird die Methodik für die Exposition des Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis für die klinische Forschung vorgestellt. Die Technik ist relativ einfach, für die freiwilligen Forscher tolerierbar und kann je nach experimentellem Bedarf modifiziert werden. Solche Forschungen am Menschen müssen im Rahmen klinischer Studienprotokolle durchgeführt werden, die von den zuständigen Zulassungsbehörden genehmigt wurden.

Ein Modell für die experimentelle Exposition von Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis Zecken

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entnahme von Speichel, Hämolymphe, Speicheldrüsen und Mitteldarm nach der Dissektion einer einzelnen gefütterten Zecke vor, um die gewebespezifische Lokalisierung von durch Zecken übertragenen Krankheitserregern zu untersuchen und das Verständnis der Vektorkompetenz und der Erreger-Mikrobiom-Wechselwirkungen zu verbessern.

Extraktion von Speichel, Hämolymphe, Speicheldrüsen und Mitteldarm aus einzelnen Zecken (Acari: Ixodidae)

Diese Methode beschreibt die Entwicklung eines in vitro durchgeführten Zeckenblutfütringssystems mit einer 3D-gedruckten Kammer und einer im Labor gefertigten Silikonmembran. Das System ermöglicht künstliche Fütterung von Zecken, ermöglicht eine einfache Probenahme in verschiedenen Fütterungsphasen und nutzt geringe Blutmengen und bietet ein unschätzbares Werkzeug zur Untersuchung von Ixodidenzecken.

Zeckenblut, das durch eine künstliche Membran in einer 3D-gedruckten Kammer in der Ixodid-Zeckenforschung fließt

Erfahren Sie die Inokulation von Metarhizium-Blastosporen und die Hämolymphegewinnung bei Rhipicephalus microplus für Immunologie- und Pathologiestudien. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zecken-Immunantworten.

Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies (Video) | JoVE Journal

Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies

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