Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools
21. August 2019
Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.
Wir haben ein definiertes, reproduzierbares und langjähriges Protokoll für die kleine RNA-Sequenzierung und zur Analyse normalisierter Lesevorgänge mit Open-Source-Bioinformatik-Tools entwickelt. Die Hauptvorteile unserer Strategie sind, dass sie microRNAs durch Gelreinigung genau sammelt und dass die Bioinformatik-Analyse unabhängig davon angewendet werden kann, wie die microRNAs gesammelt werden. Die hohe Durchsatzsequenzierung von microRNAs kann Einblicke in Krankheitsmechanismen, die Verarbeitung von microRNAs und die genaue Quantifizierung von Gentherapieansätzen, die kleine RNAs liefern, aufzeigen.
Achten Sie darauf, in einer RNase freien Umgebung zu arbeiten und alle RNA-Produkte während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten. Die Visualisierung der Gelschneideschritte hilft den Betrachtern, die richtige Größe der Produkte zu ermitteln, die für nachgelagerte Anwendungen erforderlich sind. Kombinieren Sie für drei Prime-Adaptor-Ligation11 Mikroliter RNA mit 1,5 MikroliterAT-freiem 10X T4RNA-Ligase-Reaktionspuffer, einem Mikroliter Polyethylenglykol und 0,5 Mikrolitern dreier Hauptlinker.
Erhitzen Sie die Proben bei 95 Grad Celsius auf einem Thermocycler für 30 bis 40 Sekunden, gefolgt von einer Abkühlung auf Eis für eine Minute. Fügen Sie einen Mikroliter T4RNA Ligase zwei hinzu und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Während die Proben inkubieren, gießen Sie ein 15%polyacyrilamidgel zwischen 0,8 Millimeter getrennten Glasplatten in einen Kunststoffguss und legen Sie einen Kamm ein.
Wenn das Gel erstarrt ist, 0,5 5X TBE in den Tank und Pipette kräftig hinzufügen, um die Brunnen von Restharnstoff zu waschen. Nachdem Sie das Polyacrylamid-Gel 25 Minuten lang bei 375 Volt vorlaufen lassen, laden Sie die Proben und lassen Sie dabei mindestens eine Spur zwischen jeder Probe zurück. Laden Sie 20 Mikroliter von mindestens zwei Sätzen von Markern in einem asymmetrischen Muster, um die Gelausrichtung zu verfolgen und das Gel mit konstanten 375 Volt auszuführen.
Nach 15 Minuten auf konstante 425 Volt für den Rest des Laufs erhöhen und das Gel für etwa zwei Stunden laufen. Verwenden Sie am Ende des Laufs einen Plattenabscheider, um das Gel von den Glasplatten zu entfernen und das Gel auf einen Kunststoffseitenschutz zu legen. Fünf Mikroliter Ethidiumbromid in 500 Mikroliter destilliertem Wasser verdünnen und den Farbstoff auf die Markerspuren direkt über dem oberen hellblauen Marker geben.
Als nächstes verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um die Gele von der oberen zur unteren Markierung in jeder Spur unter ultraviolettem Licht zu schneiden und die Stücke auf ein vier mal vier Zentimeter großes Quadrat Labordichtungsfolie zu übertragen. Schneiden Sie das Gel mit etwa drei Schnitten horizontal und zwei Schnitten vertikal, um 12 kleine Quadrate zu produzieren. 400 Mikroliter 0,3 Mol-Natriumchlorid auf den Dichtfilm geben und die Gelstücke in 1,5 Milliliter silikonisierte Röhren leiten.
Die Proben auf einem Nutator bei vier Grad Celsius über Nacht aufmachen. Am nächsten Morgen 400 Mikroliter jedes Überstandes in neue Schläuche übertragen. Fügen Sie einen Milliliter 100% Ethanol und einen Mikroliter von 15 Milligramm pro Milliliter Glykogen Co-Gefälltmirat pro Tube.
Dann lagern Sie die Rohre bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde. Für fünf Hauptlinker-Ligation, drehen Sie zuerst die aufgetauten Proben und setzen Sie die Pellets in Wasser wieder aus. Als nächstes fügen Sie 0,5 Mikroliter von 100 Mikromolaren fünf Prime Linker, einen Mikroliter T4RNA Ligase Puffer, einen Mikroliter von 10 Millimolar ATP und ein Mikroliter Polyethylenglykol zu jeder Probe hinzu.
Erhitzen Sie die Reaktionen bei 90 Grad Celsius für 30 Sekunden, bevor Sie sie auf Eis legen. Dann fügen Sie einen Mikroliter T4RNA Ligase eins zu jeder Röhre und inkubieren die Reaktionen bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Für die umgekehrte Transkription die Proben per Zentrifugation sammeln und das luftgetrocknete Pellet in 8,25 Mikroliter nukleasefreiem Wasser wieder aufhängen.
Fügen Sie 0,5 Mikroliter 100 Mikromolar Reverse Transkriptase Primer und fünf Mikroliter 2X Reverse Transkriptase Reaktionsmischung aus einem komplementären DNA-Synthese-Kit. Nach drei Minuten bei 42 Grad Celsius 1,5 Mikroliter 10-faches Reverse-Transkriptase-Enzym zu jeder Probe für eine 30-minütige Inkubation bei 42 Grad Celsius in einem Thermocycler hinzufügen. Nach der Neutralisation eine PCR-Reaktion mit 29,5 Mikroliter Wasser, fünf Mikroliter 10X Taq Puffer, einem Mikroliter Nukleosidtriphosphat, zwei Mikrolitern 25 Mikromolaren-Vorwärtsprimer, zwei Mikroliter 25 Mikromollar-Reverseprimer, 0,5 Mikroliter Taq-Polymerase und 10 Mikroliter der umgekehrten transkribierten komplementären DNA vorbereiten.
Führen Sie dann zwei PCR-Reaktionen aus. Für die Agarose-Gel-Reinigung bereiten Sie ein 4%Agarose-Gel mit niedrigschmelzender Agarose vor und laden Sie 40 Mikroliter oder mehr des PCR-Produkts mit Ladefarbstoff und 100 Basispaar- und 25 Basispaar-Größenmarkern auf das Gel. Nach dem Ausführen des Gels schneiden Sie das Band über dem 125 Basispaarband und verwenden Sie ein Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Schütteln, um das Gelband im Puffer bei Raumtemperatur aufzulösen, bevor Sie die entsprechende Ausrüstung verwenden, um die endgültige Sequenzbibliothek zu quantifizieren. Verwenden Sie dann die entsprechenden OpenSource-Bioinformatik-Tools, um die Sequenzdaten zu analysieren. In dieser repräsentativen PCR-Reaktion auf Niedrigschmelz-Agarorose-Gel kann die Erfassung des richtigen geklonten Produkts im Vergleich zum erhaltenen Linker-Linker-Produkt und ungesättigten im Vergleich zu gesättigten Proben beobachtet werden.
Nach der Ausrichtung an menschlichen microRNA-Haarnadeln kann eine starke Übereinstimmung zwischen den microRNA-Lesezahlen in jeder Replikation beobachtet werden. Insgesamt wurden 306 microRNA-Arten mit der größten Anzahl von Lesekarten auf microRNA 122 nachgewiesen. Es ist wichtig, daran zu denken, die Gele in der entsprechenden Größe zu schneiden, um eine genaue Wiederherstellung der microRNAs zu ermöglichen.
Nach der Sequenzierung der microRNAs können Anwender eine Bioinformatik-Analyse anwenden, um die Verteilung von microRNAs in ihrem Gewebe von Interesse zu charakterisieren. Diese Technik wurde verwendet, um zu identifizieren, wie microRNAs verarbeitet werden und welche Sätze von microRNAs bei bestimmten Krebsarten verändert werden. Achten Sie darauf, beim Umgang mit dem Ethidiumbromid und beim Betrachten der Gele unter ultraviolettem Licht Vorsicht walten zu lassen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung kleiner RNAs und zur Anreicherung von MikroRNAs für die Hochdurchsatz-Sequenzierung vor. Es beschreibt auch die Verarbeitung von Sequenz-Reads und die Ausrichtung auf MikroRNAs unter Verwendung von Open-Source-Bioinformatik-Tools.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Bioinformatik
Hintergrund
- MikroRNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Genregulation.
- Hochdurchsatz-Sequenzierung liefert Einblicke in Krankheitsmechanismen.
- Eine genaue Quantifizierung kleiner RNAs ist für die Gentherapie unerlässlich.
- Protokolle müssen RNase-freie Umgebungen gewährleisten, um RNA-Degradation zu verhindern.
Zweck der Studie
- Ein reproduzierbares Protokoll für die Sequenzierung kleiner RNAs zu entwickeln.
- Normalisierte Reads mit Open-Source-Tools zu analysieren.
- Das Verständnis der MikroRNA-Verarbeitung und deren Auswirkungen auf Krankheiten zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Isolierung kleiner RNAs durch Gel-Reinigung.
- Vorbereitung von Proben für die Hochdurchsatz-Sequenzierung.
- Verwendung der Drei-Prime-Adapter-Ligation für RNA.
- Bioinformatik-Analyse von Sequenzierungsdaten.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll sammelt effektiv MikroRNAs.
- Bioinformatik-Tools können universell auf MikroRNA-Daten angewendet werden.
- Visuelle Hilfsmittel für das Gel-Schneiden verbessern die Klarheit des Protokolls.
- Einblicke in die Rolle von MikroRNAs in der Gentherapie werden hervorgehoben.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ist definiert und reproduzierbar.
- Es bietet eine zuverlässige Methode zur Analyse kleiner RNAs.
- Zukünftige Anwendungen können zu Fortschritten im Verständnis von Krankheitsmechanismen führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Accurate microRNA quantification enables target validation and biomarker discovery in therapeutic development. This pipeline supports mechanistic de-risking by linking expression changes to disease mechanisms and gene therapy outcomes. It provides predictive confidence for prioritizing RNA-based interventions in preclinical portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microRNA-mediated therapeutic hypotheses in disease models.
- Operational Value: Provides reproducible isolation of functional small RNAs for target pathway clarification.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through quantification of microRNA alterations in disease states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative microRNA expression data for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Delivers normalized read counts enabling reliable compound screening and hit validation.
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream biomarker screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects microRNA expression changes to disease relevance and therapeutic response in preclinical models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation via consistent bioinformatic analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying dysregulated microRNA sets in cancer and other diseases.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates small RNA isolation with open-source sequencing analysis to support discovery-to-preclinical workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through accurate microRNA quantification from tissue extracts.
- Screening: Enables assay readiness via gel-purified small RNA libraries compatible with high-throughput sequencing.
- Analytics: Provides normalized read counts and differential expression metrics for cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Links microRNA processing insights to disease mechanism understanding in cancer and gene therapy contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for small RNA analysis applicable across diverse sample collection methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through accurate microRNA quantification and differential expression analysis.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via RNase-free gel purification and open-source bioinformatics tools.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by linking microRNA profiles to disease mechanisms and therapeutic outcomes.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of RNA-based therapeutics based on validated microRNA biomarker signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and RNA handling to maintain sample integrity.
- Dependent on electrophoresis and gel extraction equipment for size-specific microRNA isolation.
- Necessitates cross-team standardization of bioinformatic pipelines for consistent microRNA alignment and quantification.
- Adaptation considerations include varying input tissue types and RNA quality affecting gel-based recovery efficiency.
- Practical limitations include reliance on precise gel cutting under UV light to recover correct microRNA size fractions.
