Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools
21. August 2019
Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.
Wir haben ein definiertes, reproduzierbares und langjähriges Protokoll für die kleine RNA-Sequenzierung und zur Analyse normalisierter Lesevorgänge mit Open-Source-Bioinformatik-Tools entwickelt. Die Hauptvorteile unserer Strategie sind, dass sie microRNAs durch Gelreinigung genau sammelt und dass die Bioinformatik-Analyse unabhängig davon angewendet werden kann, wie die microRNAs gesammelt werden. Die hohe Durchsatzsequenzierung von microRNAs kann Einblicke in Krankheitsmechanismen, die Verarbeitung von microRNAs und die genaue Quantifizierung von Gentherapieansätzen, die kleine RNAs liefern, aufzeigen.
Achten Sie darauf, in einer RNase freien Umgebung zu arbeiten und alle RNA-Produkte während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten. Die Visualisierung der Gelschneideschritte hilft den Betrachtern, die richtige Größe der Produkte zu ermitteln, die für nachgelagerte Anwendungen erforderlich sind. Kombinieren Sie für drei Prime-Adaptor-Ligation11 Mikroliter RNA mit 1,5 MikroliterAT-freiem 10X T4RNA-Ligase-Reaktionspuffer, einem Mikroliter Polyethylenglykol und 0,5 Mikrolitern dreier Hauptlinker.
Erhitzen Sie die Proben bei 95 Grad Celsius auf einem Thermocycler für 30 bis 40 Sekunden, gefolgt von einer Abkühlung auf Eis für eine Minute. Fügen Sie einen Mikroliter T4RNA Ligase zwei hinzu und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Während die Proben inkubieren, gießen Sie ein 15%polyacyrilamidgel zwischen 0,8 Millimeter getrennten Glasplatten in einen Kunststoffguss und legen Sie einen Kamm ein.
Wenn das Gel erstarrt ist, 0,5 5X TBE in den Tank und Pipette kräftig hinzufügen, um die Brunnen von Restharnstoff zu waschen. Nachdem Sie das Polyacrylamid-Gel 25 Minuten lang bei 375 Volt vorlaufen lassen, laden Sie die Proben und lassen Sie dabei mindestens eine Spur zwischen jeder Probe zurück. Laden Sie 20 Mikroliter von mindestens zwei Sätzen von Markern in einem asymmetrischen Muster, um die Gelausrichtung zu verfolgen und das Gel mit konstanten 375 Volt auszuführen.
Nach 15 Minuten auf konstante 425 Volt für den Rest des Laufs erhöhen und das Gel für etwa zwei Stunden laufen. Verwenden Sie am Ende des Laufs einen Plattenabscheider, um das Gel von den Glasplatten zu entfernen und das Gel auf einen Kunststoffseitenschutz zu legen. Fünf Mikroliter Ethidiumbromid in 500 Mikroliter destilliertem Wasser verdünnen und den Farbstoff auf die Markerspuren direkt über dem oberen hellblauen Marker geben.
Als nächstes verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um die Gele von der oberen zur unteren Markierung in jeder Spur unter ultraviolettem Licht zu schneiden und die Stücke auf ein vier mal vier Zentimeter großes Quadrat Labordichtungsfolie zu übertragen. Schneiden Sie das Gel mit etwa drei Schnitten horizontal und zwei Schnitten vertikal, um 12 kleine Quadrate zu produzieren. 400 Mikroliter 0,3 Mol-Natriumchlorid auf den Dichtfilm geben und die Gelstücke in 1,5 Milliliter silikonisierte Röhren leiten.
Die Proben auf einem Nutator bei vier Grad Celsius über Nacht aufmachen. Am nächsten Morgen 400 Mikroliter jedes Überstandes in neue Schläuche übertragen. Fügen Sie einen Milliliter 100% Ethanol und einen Mikroliter von 15 Milligramm pro Milliliter Glykogen Co-Gefälltmirat pro Tube.
Dann lagern Sie die Rohre bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde. Für fünf Hauptlinker-Ligation, drehen Sie zuerst die aufgetauten Proben und setzen Sie die Pellets in Wasser wieder aus. Als nächstes fügen Sie 0,5 Mikroliter von 100 Mikromolaren fünf Prime Linker, einen Mikroliter T4RNA Ligase Puffer, einen Mikroliter von 10 Millimolar ATP und ein Mikroliter Polyethylenglykol zu jeder Probe hinzu.
Erhitzen Sie die Reaktionen bei 90 Grad Celsius für 30 Sekunden, bevor Sie sie auf Eis legen. Dann fügen Sie einen Mikroliter T4RNA Ligase eins zu jeder Röhre und inkubieren die Reaktionen bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Für die umgekehrte Transkription die Proben per Zentrifugation sammeln und das luftgetrocknete Pellet in 8,25 Mikroliter nukleasefreiem Wasser wieder aufhängen.
Fügen Sie 0,5 Mikroliter 100 Mikromolar Reverse Transkriptase Primer und fünf Mikroliter 2X Reverse Transkriptase Reaktionsmischung aus einem komplementären DNA-Synthese-Kit. Nach drei Minuten bei 42 Grad Celsius 1,5 Mikroliter 10-faches Reverse-Transkriptase-Enzym zu jeder Probe für eine 30-minütige Inkubation bei 42 Grad Celsius in einem Thermocycler hinzufügen. Nach der Neutralisation eine PCR-Reaktion mit 29,5 Mikroliter Wasser, fünf Mikroliter 10X Taq Puffer, einem Mikroliter Nukleosidtriphosphat, zwei Mikrolitern 25 Mikromolaren-Vorwärtsprimer, zwei Mikroliter 25 Mikromollar-Reverseprimer, 0,5 Mikroliter Taq-Polymerase und 10 Mikroliter der umgekehrten transkribierten komplementären DNA vorbereiten.
Führen Sie dann zwei PCR-Reaktionen aus. Für die Agarose-Gel-Reinigung bereiten Sie ein 4%Agarose-Gel mit niedrigschmelzender Agarose vor und laden Sie 40 Mikroliter oder mehr des PCR-Produkts mit Ladefarbstoff und 100 Basispaar- und 25 Basispaar-Größenmarkern auf das Gel. Nach dem Ausführen des Gels schneiden Sie das Band über dem 125 Basispaarband und verwenden Sie ein Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Schütteln, um das Gelband im Puffer bei Raumtemperatur aufzulösen, bevor Sie die entsprechende Ausrüstung verwenden, um die endgültige Sequenzbibliothek zu quantifizieren. Verwenden Sie dann die entsprechenden OpenSource-Bioinformatik-Tools, um die Sequenzdaten zu analysieren. In dieser repräsentativen PCR-Reaktion auf Niedrigschmelz-Agarorose-Gel kann die Erfassung des richtigen geklonten Produkts im Vergleich zum erhaltenen Linker-Linker-Produkt und ungesättigten im Vergleich zu gesättigten Proben beobachtet werden.
Nach der Ausrichtung an menschlichen microRNA-Haarnadeln kann eine starke Übereinstimmung zwischen den microRNA-Lesezahlen in jeder Replikation beobachtet werden. Insgesamt wurden 306 microRNA-Arten mit der größten Anzahl von Lesekarten auf microRNA 122 nachgewiesen. Es ist wichtig, daran zu denken, die Gele in der entsprechenden Größe zu schneiden, um eine genaue Wiederherstellung der microRNAs zu ermöglichen.
Nach der Sequenzierung der microRNAs können Anwender eine Bioinformatik-Analyse anwenden, um die Verteilung von microRNAs in ihrem Gewebe von Interesse zu charakterisieren. Diese Technik wurde verwendet, um zu identifizieren, wie microRNAs verarbeitet werden und welche Sätze von microRNAs bei bestimmten Krebsarten verändert werden. Achten Sie darauf, beim Umgang mit dem Ethidiumbromid und beim Betrachten der Gele unter ultraviolettem Licht Vorsicht walten zu lassen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung kleiner RNAs und zur Anreicherung von Mikro-RNAs für die Hochdurchsatzsequenzierung vor. Außerdem werden die Verarbeitung der Sequenzreads und die Alignierung an Mikro-RNAs mithilfe quelloffener bioinformatischer Werkzeuge beschrieben.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Bioinformatik
Hintergrund
- Mikro-RNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Genregulation.
- Die Hochdurchsatzsequenzierung liefert Erkenntnisse über Krankheitsmechanismen.
- Eine genaue Quantifizierung von kleinen RNAs ist für die Gentherapie unerlässlich.
- Protokolle müssen rnasefreie Umgebungen sicherstellen, um eine RNA-Degradation zu verhindern.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines reproduzierbaren Protokolls für die kleine RNA-Sequenzierung.
- Analyse normalisierter Reads mithilfe von Open-Source-Werkzeugen.
- Verbesserung des Verständnisses der microRNA-Prozessierung und ihrer Bedeutung bei Krankheiten.
Verwendete Methoden
- Isolierung von kleinen RNAs durch Gelelektrophorese-Reinigung.
- Vorbereitung von Proben für die Hochdurchsatzsequenzierung.
- Verwendung der Ligierung eines Drei-Prim-Adaptors an RNA.
- Bioinformatische Analyse der Sequenzierungsdaten.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll sammelt Mikro-RNAs effektiv ein.
- Bioinformatische Werkzeuge können universell auf Mikro-RNA-Daten angewendet werden.
- Visuelle Hilfsmittel für das Schneiden von Gele erhöhen die Klarheit des Protokolls.
- Erkenntnisse zu den Rollen von Mikro-RNAs in der Gentherapie werden hervorgehoben.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ist definiert und reproduzierbar.
- Es bietet eine zuverlässige Methode zur Analyse von kleinen RNAs.
- Zukünftige Anwendungen können zu Fortschritten im Verständnis von Krankheitsmechanismen führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung von Mikro-RNAs ermöglicht die Validierung von Zielstrukturen und die Entdeckung von Biomarkern in der Therapieentwicklung. Diese Pipeline unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem sie Expressionsänderungen mit Krankheitsmechanismen und Ergebnissen der Gentherapie verknüpft. Sie liefert eine vorhersagbare Sicherheit zur Priorisierung von RNA-basierten Interventionen in präklinischen Portfolioentscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung von mikro-RNA-vermittelten therapeutischen Hypothesen in Krankheitsmodellen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die reproduzierbare Isolierung funktioneller kleiner RNAs zur Klärung von Zielwegen.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch Quantifizierung von mikro-RNA-Veränderungen in Krankheitszuständen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Daten zur Mikro-RNA-Expression für die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays.
- Operationaler Wert: Liefert normalisierte Read-Zahlen, die eine zuverlässige Wirkstoff-Screening und Treffer-Validierung ermöglichen.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme für nachgeschaltete Biomarker-Screening-Workflows.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet Veränderungen der Mikro-RNA-Expression mit der Krankheitsrelevanz und therapeutischen Ansprechen in präklinischen Modellen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch konsistente bioinformatische Analyse.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem dysregulierte Mikro-RNA-Sets bei Krebs und anderen Erkrankungen identifiziert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode kombiniert die Isolierung von kleinen RNAs mit einer Open-Source-Sequenzierungsanalyse, um Workflows von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase zu unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt Hypothesenprüfungen und die Aufklärung von Signalwegen durch genaue Quantifizierung von Mikro-RNAs aus Gewebeproben.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch gelaufgereinigte kleine RNA-Bibliotheken, die mit Hochdurchsatzsequenzierung kompatibel sind.
- Analytik: Liefert normalisierte Sequenzlesezahlen und Metriken zur differenziellen Expression für den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen und zur Priorisierung von Zielstrukturen.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse zur Mikro-RNA-Prozessierung mit dem Verständnis von Krankheitsmechanismen im Kontext von Krebs und Gentherapie.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert ein wiederverwendbares Protokoll für die Analyse kleiner RNAs, das auf verschiedene Methoden der Probenentnahme anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch präzise Mikro-RNA-Quantifizierung und differentielle Expressionsanalyse.
- Operativer Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit mittels RNase-freier Gelelektrophorese und Open-Source-Bioinformatik-Tools.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch die Verknüpfung von Mikro-RNA-Profilen mit Krankheitsmechanismen und therapeutischen Wirkungen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von RNA-basierten Therapeutika basierend auf validierten mikro-RNA-Biomarker-Signaturen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Molekularbiologie und RNA-Handhabung, um die Probendurchgängigkeit zu gewährleisten.
- Abhängig von Elektrophorese- und Gelextraktionsgeräten zur größenselektiven Isolierung von Mikro-RNAs.
- Setzt eine standardisierte bioinformatische Analyse über Teamgrenzen hinweg voraus, um eine konsistente Alignierung und Quantifizierung von Mikro-RNAs zu ermöglichen.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind unterschiedliche Ausgangsgewebetypen und die RNA-Qualität, die die Wiederfindungsrate bei der Gelextraktion beeinflussen können.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die Notwendigkeit präzisen Schneidens im Gel unter UV-Licht, um die korrekten Größenfraktionen der Mikro-RNAs zu isolieren.
