Name: Fluoreszierend markierte Bakterien als Tracer, um neuartige Wege des organischen Kohlenstoffflusses in aquatischen Ökosystemen zu enthüllen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Erfahren Sie, wie fluorescierend markierte Bakterien als Tracer zur Quantifizierung von Grazing-Raten aquatischer Prädatoren dienen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Kohlenstoff- und Energieflüssen in mikrobiellen Nahrungsnetzen auf Einzelzellebene.

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Diese Studie wurde von der Tschechischen Wissenschaftsstiftung im Rahmen des Forschungsstipendiums 13-00243S bzw. 19-16554S unterstützt, das an K. S. bzw. D. S. verliehen wurde. Dieser Artikel wurde auch durch das Projekt "Biomanipulation als Instrument zur Verbesserung der Wasserqualität von Staudämmen" (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417) unterstützt, das aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung im Rahmen des Operationellen Programms Forschung, Entwicklung finanziert wird. und Bildung.

1. Probensammlung
<ol><li>
Sammlung von Reservoir-Wasser-Probe: die erste Fallstudie (Exp I; niedrigere natürliche in situ Raubtier und Beute Fülle System)<ol>
<li>Sammeln Sie Wasserproben von der gewünschten Stelle in geeigneter Tiefe. Bewahren Sie die Proben in einem temperaturgeregelten Kühler auf, der bei In-situ-Temperatur gefüllt wird (Vermeidung von Temperaturschock; es ist zu beachten, dass die Aufnahmeraten von Protisten temperaturabhängig sind) während des Transports zum Labor. ANMERKUNG: Unsere Probenahme wurde im meso-eutrophen Canyon-förmigen Reservoir von Mov durchgeführt (Südböhmen, Volumen 34,5 x 106 m3, maximale Tiefe 43 m, mittlere Retentionszeit 100 Tage, dimictic). Die Probenahmestelle befand sich in einer Tiefe von 30 m in der Nähe des Staudamms. Eine gemischte Probe in einer Tiefe von 0,5 m wurde von einem 2-l Friedinger Sampler gesammelt.</li>
		<li>Fahren Sie so schnell wie möglich mit Abschnitt 1.2 fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammlung von Flüssigkeit aus den Fallen fleischfressender Utricularia-Reflexa-Pflanzen: die zweite Fallstudie (Exp II; ein System mit hoher Raubtier- und Beutemenge, extrem geringes Probenvolumen)<ol>
<li>Schütteln Sie die Pflanzen vorsichtig unter Wasser, entfernen Sie sie aus dem Anbaubehälter und legen Sie sie auf saugfähiges Material, um überschüssiges Wasser aufzunehmen. Je nach Robustheit der Pflanzen und Größe der Fallen wählen Sie 8-10 Pflanzenpersonen.</li>
		<li>Teilen Sie jeden Trieb in etwa gleiche Teile auf, indem Sie Blattknoten zählen, die Fangorgane tragen. Jedes Triebsegment dient dazu, gemischte Proben zu sammeln, die junge, mittlere und alte Fallen darstellen.</li>
		<li>Befestigen Sie eine dünne Glaskapillare und eine Eppendorf-Durchstechflasche zur Probenentnahme an einer Peristaltikpumpe. Setzen Sie die Kapillarspitze in die Fallöffnung ein. Mit der Vakuumpumpe saugen Sie die gesamte Flüssigkeit aus jeder Falle heraus, bis für jede Fallalterskategorie 900 x 100 l Fallenflüssigkeit gesammelt werden.</li>
		<li>Verwenden Sie für Protistan-Weideexperimente dreifache Subsamples von 200 l der gepoolten Fallenflüssigkeit. Verarbeiten Sie diese sofort, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Bewahren Sie die verbleibenden 300 l der Probe für alle anderen Analysen der in der Flüssigkeit lebenden mikrobiellen Komponenten auf, wie unten beschrieben (Abschnitt 2).</li>
		<li>Fahren Sie sofort mit Abschnitt 2 fort.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixierung der gesammelten Proben
<ol><li>Exp I und II: Fix wasser/trap fluid sub-proben für die bakterielle Aufzählung (Abschnitt 4; ca. 20 ml bzw.) mit Formaldehyd für mindestens 1 h, um eine 2% Endvolumen-Volumen-Volumenkonzentration in jeder Probe zu erhalten. HINWEIS: Behandeln Sie Formaldehyd ausschließlich in der Dunstabzugshaube und tragen Sie bei der Manipulation von Proben jederzeit Handschuhe.</li>
</ol>3. Probenfiltration
<ol><li>Probenverdünnung (Exp I): Für die Wasserproben des Reservoirs ist keine Verdünnung erforderlich. (Exp II): Verdünnen Sie die Trap-Flüssigkeitsprobe 10x-100x mit partikelfreiem MQ-Wasser, um eine geeignete Verteilung der Zielmikroben auf Filteroberflächen zu erreichen, bevor sie über die Epifluoreszenzmikroskopie gezählt werden.</li>
	<li>Filtern Sie 1-2 ml (Exp I) des Reservoirwassers oder 10-30 l (Exp II) der Unterprobe der Trapflüssigkeit für die bakterielle Zählung auf schwarze Filter mit einer Porengröße von 0,2 m, wobei ein Filtertrichter (25 mm Durchmesser) verwendet wird.</li>
	<li>Die Filter mit DAPI (4',6-diamidino-2'-phenylindole dihydrochlorid, 0,2% Endkonzentration) für 4 min färben. HINWEIS: Vermeiden Sie Haut- und Arbeitsflächenkontamination und tragen Sie Handschuhe.</li>
	<li>Legen Sie den Filter mit konzentrierten Mikroben auf einen Tropfen Tauchöl (für die Fluoreszenzmikroskopie) auf einem Mikroskopschlitten. Legen Sie einen weiteren Öltropfen auf die Mitte des Filters und decken Sie mit einem Deckel, um sicherzustellen, dass das Öl gleichmäßig verteilt ist.</li>
	<li>An dieser Stelle, vorzugsweise Prozessproben sofort, oder alternativ, lagern Sie sie im Gefrierschrank (-20 °C) für mehrere Wochen bis Monate bis zu einer weiteren Analyse.</li>
</ol>4. Aufzählung der Bakterienzahlen auf den Filtern
<ol><li>Platzieren Sie den Schlitten unter das Epifluoreszenzmikroskop (mit dem Filtersatz, der dem Fluorchrom-DAPI entspricht). Legen Sie ein 10 x 10 Zählgitter in eines der Okularen. Verschieben Sie die Folie in eine zufällige Position.</li>
	<li>Quantifizieren Sie Bakterienzellen (blaue Fluoreszenz) im Bereich des Zählgitters (unter der Vergrößerung 1000x). Schließen Sie in die Zählungen die Zellen ein, die den linken und oberen Rand des Zählrasters kreuzen, während diejenigen, die sich über den rechten und unteren Rand befinden, ausgeschlossen sind.</li>
	<li>Wechseln Sie zu einer anderen zufälligen Position und wiederholen Sie die Aufzählung auf mindestens 10-15 Zählrastern, die insgesamt 500 Zellen zählen.</li>
	<li>Erstellen Sie einen Umrechnungsfaktor für ein gegebenes Mikroskop und eine Vergrößerung, basierend auf dem Wissen über das Verhältnis der Fläche eines Rasters zur gesamten effektiven Filtrationsfläche des Filters. Teilen Sie dann die Gesamtzahl der Zellen, die durch die Anzahl der gezählten Gitter gezählt werden, wodurch eine durchschnittliche Anzahl von Bakterien pro Raster ergibt.</li>
	<li>Multiplizieren Sie den letztgenannten Parameter mit dem ermittelten Umrechnungsfaktor und normalisieren Sie die resultierende Anzahl pro ml einer Probe (abhängig vom Volumen der gefilterten Probe), um die gesamte bakterielle Häufigkeit pro ml zu erhalten.</li>
</ol>5. Bestimmung der Protistan-Fülle
<ol><li>Befestigen Sie die Wasserproben (Exp I) oder Trap-Flüssigkeit (Exp II) mit Glutaraldehyd (1% Endkonzentration, besser geeignet für Proben mit dem Vorhandensein von Chlorophyll enthaltenden Partikeln, die Tage bis Wochen nach der Fixierung verarbeitet werden) oder Formol-Thiosulfat-Dekofarbierungstechnik unten angegeben. HINWEIS: Beide Konservierungstechniken verhindern die Verunglimpfung des aufgenommenen Materials aus Nahrungsvakuumen von Protisten8.</li>
	<li>Fügen Sie in Bezug auf die Formol-Thiosulfat-Dekofarbierungstechnik 100 l/1 l der Lugol-Lösung in 20 ml/200 l der Unterprobe Wasser/Trap-Flüssigkeit (Exp I/Exp II) hinzu.</li>
	<li>Folgen Sie sofort mit der Zugabe von 0,5 ml/50 l Borat-gepuffertes Formalin dann 20 l/2 l l von 3% Natriumthiosulfat (Exp I/Exp II). HINWEIS: Das Natriumthiosulfat entfärbt die gelbe Farbe von Lugol, um die Beobachtung von Zellen unter dem Epifluoreszenzmikroskop8zu ermöglichen.</li>
	<li>Filtern Sie ein bekanntes Probenvolumen (abhängig von der Anzahl der Zielprotisten) auf 1 m Poren-große Schwarze-Polycarbonat-Filter.</li>
	<li>Schätzen Sie die Anzahl der protistischen Arten ist durch Zählen von mindestens 200 Zellen unter Vergrößerung 600x mit dem Zählgitter (siehe oben).</li>
	<li>Reduzieren Sie das Volumen der Probe unter einem Vakuum im Filtrationstrichter durch niedriges Vakuum auf ca. 2 ml. Dann lassen Sie den Unterdruck los und fügen Sie das DAPI-Fluorchrom (4',6-Diamidino-2-Phenylindole-Dihydrochlorid13, 0,2% Endkonzentration) für 2 min hinzu.</li>
</ol>6. Bestimmung der Gemeinschaftsstruktur von Zilien in Planktonproben
HINWEIS: Ciliate Gemeinschaften in Süßwasser-Lebensräume sind sehr vielfältig14,15,16,18, und ihre mikroskopische Bestimmung ist eine Herausforderung. Die Sortierung der Ziliengruppen in funktionelle Gilden10,14,16,17 ermöglicht eine detailliertere Analyse verschiedener Ziliengruppen als pelagische Bakterivoren.
<ol><li>Bewerten Sie die Ciliate-Community-Struktur, indem Sie Folgendes kombinieren:<ol>
<li>DAPI-gefleckte Proben in der Epifluoreszenzmikroskopie (zur Lokalisierung der Ziliatzellen mit heller Fluoreszenz von Makro- und Mikrokernen unterschiedlicher Größe und Morphologie) kombiniert mit der Aufnahme fluoreszierend markierter Bakterien (FLB8; für Details, siehe unten), die Fähigkeit von Ziliaten verfolgen, sich von Bakterien zu ernähren.</li>
		<li>Live-Probenbeobachtung in ausgewählten Fällen17,19. Weitere Einzelheiten zu den oben genannten Ansätzen und Kriterien für die Gruppierung von Zilien in verschiedene taxonomische Kategorien finden Sie in früheren Veröffentlichungen16,17. ANMERKUNG: Zitierte Studien haben gezeigt, dass unter den Zilien, Omnivoren arten aus Stichotrichia (Genera Halteria und Pelagohalteria)und Oligotrichia (nämlich Rimostrombidium spp.) die wichtigsten pelagischen Verbraucher von Bakterioplankton in einer überwiegenden Mehrheit der Süßwasserlebensräume10,17,18.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Schätzung der Zilien-Weideraten
<ol><li>Berechnen Sie die Aufnahmeraten von Zilien auf Bakterien auf der Grundlage von Veränderungen in der durchschnittlichen Anzahl von Tracer [d.h. FLB8 pro Zilit im Zusammenhang mit der Zeit der Inkubation (5-15 min)] und Tracer Menge an FLB hinzugefügt, wobei höchstens 5%-15% der gesamten Bakterien.</li>
	<li>Um die Aufnahmeraten zwischen verschiedenen Protistan-Arten zu vergleichen, normalisieren Sie die Aufnahmeraten als Anzahl der Bakterien pro Zilit pro Stunde, wobei Berechnungen auf der Grundlage der tatsächlichen Inkubationszeit und des Anteils des Tracers FLB hinzugefügt werden. ANMERKUNG: Das allgemeine Schema der ANWENDUNG der FLB-Methode zur Schätzung sowohl zell- als auch artspezifischer und massenhäliger Bakterbakterienraten in natürlichen Proben ist in Abbildung 1dargestellt.</li>
	<li>Herstellung von FLB aus Bakterienstämmen, die in einer Süßwasserumgebung heimisch sind8<ol>
<li>Wählen Sie eine geeignete Größe (mittleres Zellvolumen = MCV) und Morphologie von Bakterien, so dass sie effektiv die typischen Größen von Bakterioplankton/Bakterienzellen im untersuchten aquatischen System imitieren. HINWEIS: Für Exp I wurde eine Mischung aus isolierten Stämmen aus dem Studienort der Gattung Limnohabitans und Polynucleobacter verwendet (d. h. typisch, reichlich Bakterioplankton in Seen und Teichen)20. Einzelheiten zur Morphologie und Größe der Stämme finden Sie in früheren Publikationen3,17,18,21.</li>
		<li>Ernten Sie Bakterienzellen aus der Kultur durch Zentrifugation (5.000 x g) für 15 min in der frühen stationären Phase und mischen Sie sie in einem numerischen Verhältnis, das MCV - SD der Zellen in der Mischung ergibt, die der typischen MCV von Bakterien an der gewählten Stelle entspricht.</li>
		<li>Die Pellets in 10 ml phosphatgepufferter Saline (PBS; pH = 9) aussetzen.</li>
		<li>2 mg des gelbgrünen Fluoreszenzfarbstoffs 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl)-Aminofluorescein (DTAF, bindet an Proteine) in die Zellsuspension im Phosphat-Salzin-Puffer geben und in einem 60 °C-Wasserbad für 2 h brüten.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie nach der Inkubation die Zellen nach unten, dekantieren Sie die DTAF-Lösung und waschen und zentrifugieren 3x mit PBS.</li>
		<li>Nach der letzten Wäsche die Zellen in 20 mldes PP i-Saline-Puffers wieder aufhängen.</li>
		<li>Die FLB-Aufhängung und Pipette 1,5 ml in 2 ml Kryo-Fläschchen vortex, dann gefroren(bei -20 °C) im PP i-Salin-Puffer bis zum Gebrauch.</li>
		<li>Vorfilter PPi-saline Puffer durch einen 0,2 m Polycarbonatfilter für den nächsten Schritt.</li>
		<li>Zur Bestimmung der FLB-Konzentration einen kleinen Aliquot (in der Regel 20-40 l) auf 2 ml partikelfreienPP-I-Salz-Pufferübertragen, bei 30 W für mehrere 2 s Bursts beschallen und auf 0,2 m Polycarbonat-Schwarzfilter zur Aufzählung über Epifluoreszenz filtern Mikroskopie (1.000X Vergrößerung) unter optischen Filtereinstellungen für DTAF (448 nm/520-540 nm).</li>
	</ol></li>
	<li>Tracer-Technik zur Schätzung von Zilien-Bacterivory<ol>
<li>Für Weideexperimente in natürlichen planktonischen Lebensräumen 300 ml Proben in gut geschnittene 1 L-Flaschen geben und bei In-situ-Temperatur 15 min inkubieren (damit sich Protisten vom Handhabungsschock erholen können).</li>
		<li>Fügen Sie FLB-Tracer hinzu, um 5%-15% der gesamten Bakterien zu machen, wobei die Mengen je nach Jahreszeit und Wassertemperatur hinzugefügt werden. ANMERKUNG: Es gibt ein sehr breites, saisonabhängiges Spektrum in ziliten artenspezifischen Aufnahmeraten, die mehrere Größenordnungen umfassen (d. h. von 101-104 Bakterien zililiat-1 pro Stunde)10,16, 17,18,22,23,24.</li>
		<li>In Zeiten des verstärkten Auftretens von Zilien mit hohen Aufnahmeraten (in der Regel im Sommer) führen Sie auch eine parallele Inkubation mit sehr geringen FLB-Zusätzen durch, die nur 2%-4% der Gesamtbakterien ausmachen, um eine übermäßige Belastung von Ziliolen durch Tracer FLB zu vermeiden (siehe Beispiele in Abbildung 2).</li>
		<li>Zilien-/Planktonproben mit FLB für 5-15 min inkubieren.</li>
		<li>Es gibt zwei Möglichkeiten zur Probenfixierung, um die Zeutung des aufgenommenen Materials aus Nahrungsvakuumen von Protisten zu verhindern8. Beenden Sie die Inkubationen durch Zugabe von 1% Glutaraldehyd (Endkonzentration, die besser für Proben mit Chlorophyll-haltigen Partikeln, wie Algen, geeignet ist). Alternativ können Sie die Lösung von Lugol mit 100 l/10 l in eine Unterprobe von 20 ml/200 l Wasser/Trap-Flüssigkeit verwenden, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml/10 l Borat-gepuffertem Formalin und dann 200 l/2 l von 3 % Natriumthiosulfat (Exp I/Exp II).</li>
	</ol></li>
	<li>Nach Zugabe des Fixativs lassen Sie die Proben mindestens 1 h im Dunkeln bei 4 °C ruhen, um eine gründliche Konservierung der Zilitzellen zu gewährleisten.</li>
	<li>Nehmen Sie natürliche Plankton-Subsamples von 4-30 ml/10-30 l (Exp I/Exp II; das Volumen hängt von der Ciliath-Fülle ab) und Färben mit DAPI (Endkonzentration 0,2% wt/vol; für Details siehe Schritt 3.2 oben).</li>
	<li>Durchqueren Sie 1 'm schwarz Filter und inspizieren Sie über die Epifluoreszenzmikroskopie, um Ziliarate zu zählen (600x Vergrößerung) und die Anzahl der aufgenommenen FLB-Tracer (meist bei 1000-facher Vergrößerung) aufzuzählen, wie in früheren Veröffentlichungen2,17 . Proben innerhalb von 7 Tagen nach konservierungsnehmen.</li>
	<li>Um die gesamte protozoanische/artspezifische Beweidung zu schätzen, multiplizieren Sie die durchschnittlichen Aufnahmeraten aller Zilien oder nur der Zilienarten, wie sie durch in situ-Überfluss nachgewiesen werden.</li>
	<li>Das Beispiel für die Berechnung der Aufnahmeraten pro Zelle aus In-situ-Daten aus dem Wasserreservoir von Mov wird wie folgt beschrieben:<ol>
<li>Angenommen, die bakterielle Konzentration beträgt 3,55 x 106 Bakterien/ml und Tracer FLB hinzugefügt ist 0,25 x 106 FLB/ml, was eine Summe von 3,8 x 106 Bakterien/ml der gesamten bakteriellen Partikel ergibt (natürliche Bakterien + FLB = 100% der Beutepartikel) phagotrophischen Protisten in der natürlichen Probe zur Verfügung stehen. HINWEIS: Die hinzugefügten FLB-Tracer machen somit 6,58 % (ein Projekt von 0,25/0,038) der gesamten bakteriellen Partikel aus. Die durchschnittliche Anzahl der FLB pro Halteria sp. beträgt 6,2 FLB in 5 min Inkubationen.</li>
		<li>Um die Aufnahme pro Stunde zu normalisieren, verwenden Sie die folgende Berechnung: (6,2 x 12)/(6.58/100) = 1131 Bakterien pro Halteria-Zelle/h. ANMERKUNG: Weitere Beispiele für die Verteilung einzelner Aufnahmeraten von Halteria sp., die unter variablen Wassertemperaturen, Mengen (in Prozent) des Tracer FLB und unterschiedlicheinkubationszeiten mit FLB nachgewiesen wurden, finden Sie in Abbildung 3.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Zingel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliates+are+the+dominant+grazers+on+pico-+and+nanoplankton+in+a+shallow%2C+naturally+highly+eutrophic+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake.</a> Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).</li>
<li>Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliate+epibionts+associated+with+crustacean+zooplankton+in+german+lakes%3A+distribution%2C+motility%2C+and+bacterivory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory.</a> Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).</li>
<li>Sirová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunters+or+gardeners%3F+Linking+community+structure+and+function+of+trap-associated+microbes+to+the+nutrient+acquisition+strategy+of+a+carnivorous+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant.</a> Microbiome. 6, 225(2018).</li>
<li>Šimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+traits+of+a+zoochlorellae-bearing+Tetrahymena+sp.+%28Ciliophora%29+living+in+traps+of+the+carnivorous+aquatic+plant+Utricularia+reflexa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).</li>
<li>Pitsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+Tetrahymena+utriculariae+n.+sp.+%28Ciliophora%2C+Oligohymenophorea%29+with+its+endosymbiotic+algae+%28Micractinium+sp.%29%2C+living+in+the+feeding+traps+of+a+carnivorous+aquatic+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).</li>
<li>Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+tracing+in+ecology%3A+Method+comparison+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Diet tracing in ecology: Method comparison and selection.</a> Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).</li>
<li>Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+methods+for+estimating+phago-mixotrophy+in+nanophytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton.</a> Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Dolan, J. D., Šimek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+ingested+matter+in+Strombidium+sulcatum%2C+a+marine+ciliate+%28Oligotrichida%29%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida).</a> Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).</li>
<li>Massana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grazing+rates+and+functional+diversity+of+uncultured+heterotrophic+flagellates%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates.</a> The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).</li>
<li>Grujčić, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptophyta+as+major+freshwater+bacterivores+in+experiments+with+manipulated+bacterial+prey%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey.</a> The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Entschlüsselung der trophischen Interaktion in aquatischen Systemen ist immer eine Herausforderung28, vor allem auf der Nano-Plankton-Skala mit Protisten und ihre Beute, Bakterien. Wenn es um Nährstoffaufnahmewege und Quantifizierung geht, ist die Anwendung von Methoden, die erfolgreich auf höheren trophischen Ebenen eingesetzt werden, aufgrund der hohen Komplexität biotischer Wechselwirkungen weniger möglich. Dazu gehören beispielsweise stabile Isotopenkennzeichnungsansätze. Dieses Protokoll ...

Heterotrophe Prokaryoten sind eine wichtige biologische Komponente in aquatischen Systemen und machen einen signifikanten Anteil der Planktonbiomasse1,2,3aus. Faktoren, die ihren Überfluss, ihre Vielfalt und ihre Aktivität kontrollieren, sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle beim biogeochemischen Kreislauf (d. h. das Schicksal von organischem Kohlenstoff und anderen Nährstoffen und Energiefluss von Prokaryoten zu höheren trophischen Niveaus). Protozoen Weide ist einer dieser wichtigen Faktoren. Bacterivory von heterotrophen Nanoflagellaten und Ziliaraten erzwingt eine starke Kontrolle von oben nach unten über prokaryotische Fülle, Gemeinschaftsfunktion, Struktur, Vielfalt und sogar zelluläre Morphologie und Wachstumsrate bestimmter Bakteriengruppen4, 5,6. In einigen Systemen dienen Protisten als Hauptursache für die bakterielle Sterblichkeit6,7.
Der Standardansatz zur Bewertung von Protozoen-Bakterien, der seit einiger Zeit verwendet wird, beinhaltet die Verwendung fluoreszierend markierter Bakterien (FLB) als Beuteanaloga und Epifluoreszenzmikroskopie. Zellspezifische Aufnahmeraten können durch Quantifizierung der Anzahl der markierten Beutepartikel in Protistan-Lebensmittel-Vakuolen über einen ausgewählten Zeitverlauf bestimmt werden8. Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile. Tracer wird natürlichen Proben mit natürlichen Raubtier- und Beuteansammlungen hinzugefügt. Es gibt minimale Probenmanipulationen vor der Inkubation, minimale Probenänderung durch den hinzugefügten FLB-Tracer und Inkubationszeiten sind kurz, um sicherzustellen, dass unter nahezu in-situ-Bedingungen fundierte Ergebnisse erzielt werden. Alternativ können in Umgebungen mit geringer Anzahl bakterivorer Protisten oder Zooplankton (z. B. Offshore-Meeressysteme) die Verschwindenraten von FLB, die Proben in geringen Mengen (2%-3% Tracer) zugesetzt werden, über die Durchflusszytometrie langfristig nachgewiesen werden (12-24 h) Inkubationsexperimente. Dann werden die FlB-Zahlen am Anfangs- und Endpunkt (die Die Auswirkungen aller Bakterivoren integrieren) durch Strömungszytometrie quantifiziert (Details siehe vorherige Publikation9). Ein solcher Parameter stellt jedoch nur die aggregierten Bakteriumsraten dar, die nicht direkt auf bestimmte Protistan- und Zooplankton-Weidegruppen oder -arten zurückgeführt werden können.
Insgesamt kann die genaue und ökologische Quantifizierung der protistan-arten- oder morphotypspezifischen bakteriellen Sterblichkeitsraten in der aquatischen Umwelt eine Herausforderung darstellen. Einige Protisten sind selektive Weidetiere, und die Größe und Zellform des hinzugefügten FLB-Tracers kann die natürlichen Raten der Beuteaufnahme10,11verzerren. Darüber hinaus sind Protistan Aktivität und Stoffwechsel hochtemperaturempfindlich12; Daher muss die Menge des hinzugefügten FLB-Tracers für jeden einzelnen Probentyp sorgfältig manipuliert werden (nicht nur basierend auf der natürlichen Häufigkeit, Größe und Morphologie von Bakterien und vorherrschenden Arten von Bakterienfressern, sondern auch auf der Temperatur). Die meisten Studien konzentrieren sich auf Bulk Protistan Weideaktivität; die Bakterivory bestimmter Protistan-Arten haben jedoch oft einen viel höheren Informationswert und können vorzuziehen sein. In diesem Fall ist taxonomisches Wissen über die protistischen Arten, die in einer Probe vorhanden sind, und das Verständnis ihres Verhaltens erforderlich. Daher sind erhebliche Mengen an Zeit und Arbeit erforderlich, um solide Ergebnisse über artspezifische Bacterivory-Raten zu erhalten, die einer bestimmten Protistan-Gruppe oder -Art zuzuschreiben sind.
Trotz dieser Schwierigkeiten bleibt dieser Ansatz das derzeit am besten geeignete Instrument zur Bewertung von Protistan-Bacterivory in natürlichen Umgebungen. Hier wird eine umfassende, leicht verständliche Methode zur Verwendung von FLB als Tracer in aquatischen mikrobiellen Ökologiestudien vorgestellt. Alle genannten problematischen Aspekte des Ansatzes werden berücksichtigt und ein verbesserter Workflow beschrieben, mit zwei Experimenten aus kontrastierenden Umgebungen sowie kontrastierenden Zilienarten als Beispiele.
Die erste Fallstudie wurde in einer epiimnetischen Umgebung aus dem mesotrophischen Wasserreservoir von Mov in der Tschechischen Republik durchgeführt, das Weide- und Bakterienmengen zeigt, die mit den meisten Oberflächensüßwasserkörpern vergleichbar sind (vgl.5,7). Die zweite Fallstudie wurde in der hochspezifischen Umgebung in Fallen der aquatischen fleischfressenden Pflanze Utricularia reflexadurchgeführt, die eine extrem hohe Anzahl von beiden grasenden Mixotrophen(Tetrahymena utriculariae) beherbergt. und Bakterienzellen. Es werden Berechnungen der zellspezifischen Weideraten und der bakteriellen Bestandsbestände in beiden Stichprobentypen dargestellt. Anschließend wird eine Reihe ökologischer Interpretationen der Ergebnisse diskutiert und schließlich Beispiele für mögliche Folgestudien vorgeschlagen.

<table><tbody><tr><td>0,2-& Mikro; M Porengrößenfilter&nbsp;</td><td>SPI liefert, https://www.2spi.com/</td> <td>B0225-MB</td><td>Schwarz, Polycarbonat-Spurätz-Membranfilter, Durchmesser Approprit für verwendete</td></tr><tr><td>Filtergeräte 5-(4,6-Dichlortriazin-2-yl) Aminofluorescein (DTAF)</td><td></td>Automatische Pipetten jeder Marke <td></td><td></td></tr><tr><td>mit einstellbaren Volumina&nbsp;</td><td>Jede Marke, verschiedene Größen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>22 000 x g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Jede Marke, 2 mL Größe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&akut;,6-Diamidino-2&akut;-Phenylindoldihydrochlorid)</td><td>Jede Marke&nbsp;</td><td></td><td>1 mg ml-1</td></tr><tr><td>Epifloreszenzmikroskop</td><td>Vergrößerung von 400 x bis 1000 x</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Filter geeignet für die Betrachtung im DAPI- und DTAF-Bereich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zählgitter in einem der Okulare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtergerät</td><td>In der Regel mit einem Durchmesser von 25 mm&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Eine Marke für die Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Eine Marke für die Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl für die Mikroskopie</td><td>Spezifisches Öl mit geringer Fluoreszenz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lugol&akut; </td><td></td><td></td> Herstellen <td>Sie eine alkalische Lugol'-Lösung wie folgt: Lösung 1 - 10 g Kaliumiodid in 20 ml in MQ-Wasser auflösen, dann 5 g Jod hinzufügen. Lösung 2 - fügen Sie 5 g Natriumacetat hinzu&nbsp; auf 50 ml MQ Wasser. Fügen Sie die Lösung 2 zur Lösung 1 hinzu und mischen Sie gründlich</td></tr><tr><td>Methanol stabilisiertes Formalin</td><td>Jede für Mikroskopiezwecke</td><td></td><td></td>verfügbare Marke</tr><tr><td>Objektträger und Deckgläser</td><td>Jede Marke, die für Mikroskopiezwecke hergestellt wird&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MQ Wasser zum Verdünnen von Proben</td><td>Jede Marke &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; pH = 9)</td>Jede <td>Marke</td><td></td><td>0,05 M Na2HPO4-NaCl-Lösung, angepasst an pH 9</td></tr><tr><td>PPi-Kochsalzlösung</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>0,02 M Na4P2O7-NaCl-Lösung. 0,53 g Na4P2O7 zu 100 ml MQ Wasser plus 0,85 g NaCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Probenahmegerät&nbsp;</td><td>Geeignet für die Entnahme repräsentativer Stichproben&nbsp;</td><td></td><td>z.B. Friedinger-Probenehmer für Seeplankton</td></tr><tr><td>Natriumthiosulfatlösung</td> Jede <td>Marke</td><td></td> 3<td>%ige Lösung wird im Protokoll verwendet</td></tr><tr><td>Ultraschallator</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>30 W</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Jede Marke, die ein gründliches Mischen der gelösten Stoffe und Proben</td><td></td><td></td>ermöglicht</tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Jede Marke, die es ermöglicht, die Temperatur bei 60 μg zu halten; C</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszierend markierte bakterien als tracer, um neuartige wege des organischen kohlenstoffflusses in aquatischen Ökosystemen zu enthüllen

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Die Aufklärung trophischer Wechselwirkungen, wie Raubund und ihre Auswirkungen, ist eine häufige Aufgabe für viele Forscher in der Ökologie. Das Studium von mikrobiellen Gemeinschaften hat viele Einschränkungen, und die Bestimmung eines Raubtiers, Beute und Raubtierraten ist oft schwierig. Präsentiert wird hier eine optimierte Methode, die auf der Zugabe von fluoreszierend gekennzeichneter Beute als Tracer basiert, die eine zuverlässige Quantifizierung der Weideraten in aquatischen Raub-Eukaryoten und die Schätzung des Nährstofftransfers zu höheren trophischen Werten ermöglicht.

Beispiel Experiment Ich wurde in der Wasserreservoir von 'mov (Südböhmen, CZ) durchgeführt, die eine natürliche Stätte mit geringerer natürlicher in situ Raubtier und Beute Fülle ist. Repräsentative Daten werden für die Allesfresser-Zilienart Halteria grandinellagemeldet, die ein reichlich vorhandener und effizienter Weidevon Picoplanktonpartikeln (&lt;2 m) ist10,16,17,18 </...

Hier wird ein Protokoll für eine einzellige, epifluoreszenzmikroskopische Technik zur Quantifizierung der Weideraten in aquatischen Raub-Eukaryoten mit hoher Präzision und taxonomischer Auflösung vorgestellt.

Fluoreszierend markierte Bakterien als Tracer, um neuartige Wege des organischen Kohlenstoffflusses in aquatischen Ökosystemen zu enthüllen

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Dieser Ansatz ist wichtig, weil er es uns ermöglicht, Kohlenstoff- und Energieflüsse von Prokaryoten zu höheren trophischen Konzentrationen in mikrobiellen Nahrungsbahnen mit einer sehr hohen Auflösung zu visualisieren und zu schätzen. Dies ist die einzige derzeit verfügbare Technik, um zu bestimmen, welche protistischen Arten Bakterien vor Ort konsumieren, und gleichzeitig die Rate dieses Prozesses auf einer Einzelzellebene zu quantifizieren. Da Bakterien die einzigen signifikanten Mikroben sind, die gelösten organischen Kohlenstoff in partikelförmigen organischen Kohlenstoff verändern, bilden das Wissen der beteiligten Akteure und die Raten, mit denen dies geschieht, die Grundlage für das Verständnis aquatischer Ökosysteme im Allgemeinen. Wir empfehlen den Forschern dringend, sich mit ihrem Studiensystem vertraut zu machen, bevor sie Weideexperimente durchführen. Dies beinhaltet Licht und Epifluoreszenz der MikroskopieInspektion der Proben, und das Wissen über die wichtigsten Taxon vorhanden und ihre saisonale Dynamik. Demonstrieren das Verfahren wird Jitka Jezberov sein

fluorescently-labeled-bacteria-as-tracer-to-reveal-novel-pathways

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Environmental Bakterioplankton sind mit einem Modell des gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC)-Verbindung und einer DNA Markierungsreagens, Bromdesoxyuridin (BrdU) inkubiert. Anschließend werden DOC-abbauenden Zellen aus dem Bulk-Community auf ihre erhöhte BrdU-Einbaus mittels Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) basiert getrennt. Diese Zellen werden dann durch nachfolgende molekulare Analysen identifiziert.

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling und anschließende Fluorescence Activated Cell Sorting für Kultur-unabhängige Identifizierung von gelöstem organischem Kohlenstoff abbauenden Bakterioplankton

Quelle: Pioli, R., et al., Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle Kapillaritäts-unterstützte Assemblierung. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Methode zum Einfangen einzelner fluoreszenzmarkierter Escherichia coli (E. coli)- Zellen in mikrofluidischen Fallen unter Verwendung einer kohlenstofffreien Suspension und eines kontrollierten Flusses, gefolgt von einer Nährstoffzugabe zur Auslösung des Wachstums und der Fluoreszenzbildgebung von Mikrokolonien.

Mikrofluidische Strukturierung und fluoreszenzbasierte Verfolgung des einzelligen Bakterienwachstums

Quelle: Chetrit, D., et al. Anwendung von Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronen-Tomographie zur Auflösung raumzeitlicher Merkmale des Sekretionssystems Legionella pneumophila dot/icm. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert die Herstellung und Bildgebung fluoreszierend markierter pathogener Bakterien. Agarose-Pads werden zunächst vorbereitet und in einem klebrigen Rahmen positioniert. Eine Suspension von genetisch veränderten Bakterien, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren,...

Probenvorbereitung und Bildgebung fluoreszenzmarkierter Bakterien

Ein auf lebenden Zellen basierendes Verfahren zur Beleuchtung von zellulären Vakuolen (Einschlüssen), die Chlamydien enthalten, wird beschrieben. Diese Strategie ermöglicht eine schnelle, automatisierte Bestimmung der Infektiosität von Chlamydien in Proben und kann zur quantitativen Untersuchung der Wachstumsdynamik des Einschlusses verwendet werden.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Whole-Cell-Assay mit Bioreporter Burkholderia sartisoli RP037-MCHe wurde entwickelt, um Bruchteile einer organischen Verunreinigung (dh fluoren) nach den aktiven Transport von Myzelien Überbrückungsluftgefüllten Poren in einer wasser ungesättigten Modellsystem für bakteriellen Abbau verfügbar zu detektieren.

Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten

Die Rolle des Sortiments (räumliche Trennung) in evolutionären Szenarien können mit einfachen mikrobiellen Systemen im Labor untersucht werden, die eine Anpassung der räumlichen Verteilung gesteuert ermöglichen. Durch eine Modifikation können die Gründer Zelldichte, verschiedene Sortiment Ebenen fluoreszenzmarkierte Bakterienstämme in der Kolonie Biofilme von Bacillus subtilis verwendet werden sichtbar gemacht .

Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Abschriften mit Fluoreszent-markierten DNA-Sonden für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Coli. SmFISH ist eine Visualisierungsmethode, die erlaubt die simultane Detektion, Lokalisierung und Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle in festen Einzelzellen.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

Dieses live-bakterielle Zellbildgebungsprotokoll ermöglicht die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen mehreren Bakterienarten auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit. Die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung jeder Bakterienart in Monokultur oder Kokultur, um Wechselwirkungen zwischen den Arten in bakteriengemeinschaften mit mehreren Arten, einschließlich individueller Zellbeweglichkeit und Lebensfähigkeit, zu untersuchen.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das den organweiten Nachweis pathogener Bakterien während der Infektion und die Quantifizierung der fluoreszierenden Reporteraktivitäten ermöglicht.

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Erfahren Sie, wie fluorescierend markierte Bakterien als Tracer zur Quantifizierung von Grazing-Raten aquatischer Prädatoren dienen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Kohlenstoff- und Energieflüssen in mikrobiellen Nahrungsnetzen auf Einzelzellebene.

Fluoreszierend markierte Bakterien als Tracer, um neuartige Wege des organischen Kohlenstoffflusses in aquatischen Ökosystemen zu enthüllen (Video) | JoVE Journal

Fluoreszierend markierte Bakterien als Tracer, um neuartige Wege des organischen Kohlenstoffflusses in aquatischen Ökosystemen zu enthüllen

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