Name: Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Live-Cell-Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus. Diese Methode ermöglicht die direkte Beobachtung von Phänotypänderungen auf Einzelzellebene.

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Wir danken unseren Labormitgliedern für ihre Kommentare zu diesem Artikel. Diese Arbeit wurde durch ein Start-up-Stipendium der University of South Florida (PE) finanziert.

1. Allgemeine Wachstumsbedingungen
<ol><li>Impfen 2 ml des geeigneten Wachstumsmediums mit Antibiotika (falls erforderlich) mit einer einzigen Kolonie der Stämme abgebildet werden. Inkubieren Sie diese Samenkulturen über Nacht bei 22 °C in einem Schüttelbrutzentrum. HINWEIS: Die in diesem Artikel verwendeten spezifischen bakteriellen Wachstumsbedingungen finden Sie unter dem Abschnitt repräsentative Ergebnisse.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Nachtkulturen 1:20 in frischen Medien in einem 125 ml Kolben, ergänzen Sie sie mit Antibiotika (falls erforderlich).</li>
	<li>Kultur(en) bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bis zur mittelogarithmischen Phase (OD600 = 0,5) wachsen. HINWEIS: Induktoren oder Inhibitoren könnten in der entsprechenden Wachstumsphase direkt zur Wachstumskultur(n) hinzugefügt werden.</li>
	<li>Erntezellen unter gewünschten Kulturbedingungen für die Mikroskopieprobenvorbereitung, wie im folgenden Abschnitt beschrieben.</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie 1% Agarose vor, indem Sie 0,25 g molekularbiologische Qualität, niedrige EEO, Agarose mit entweder 25 ml Wachstumsmedium mit geeigneten Antibiotika (falls erforderlich) für Zeitraffermikroskopie oder steriles Wasser ergänzt kombinieren. Erhitzen Sie die Mischung mit Hilfe einer Mikrowelle für ca. 30 s und gießen Sie sie in eine sterile 100 mm x 15 mm Petrischale und lassen Sie sie erstarren.</li>
	<li>Nehmen Sie je nach Bedarf ein Aliquot der Zellkultur von 5–50 L und färben Sie sie. Flecken Zellen mit geeigneten Farbstoffen in diesem Stadium (z. B. fluoreszierender Farbstoff FM4-64 (Membranfleck) für ein Experiment hinzufügen(Abbildung 1)).<ol>
<li>Pipette eine 5 l Aliquot der Kulturprobe oder gebeizt Probe auf den Boden einer 35 mm Glasbodenkulturschale abgebildet werden (mit 14 mm Mikrobrunnendurchmesser und unbeschichteten Nr. 1.5 Coverslip; siehe Tabelle der Materialien). VORSICHT: Verwenden Sie nicht poly-L-Lysin beschichtete Abdeckungen, insbesondere für die Zeitraffermikroskopie, da sie unterschiedliche Wachstumsmuster induzieren könnten (wir haben dies auch bei Poly-D-Lysin beobachtet; Daten nicht gezeigt) und/oder die Proteindynamik beeinflussen6.</li>
		<li>Um die Verwendung von Farbstoffen zu minimieren, färben Sie die Zellsuspension 3–4 l (geerntet bei OD600 = 0,5; ca. 2,7 x 107 und 3,4 x 107 für B. subtilis bzw. S. aureus pro 1 ml Kultur) direkt auf der Glasbodenschale.</li>
		<li>Legen Sie eine vorgeschnittene Agaroseplatte (11 mm Durchmesser oder beliebige reine Größe) auf die Oberseite der Probe, um den Bereich des Deckels zu überlappen; mit dem offenen Ende eines sterilen Rohres oder einer Rasierklinge schneiden) und tippen Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Agaroseplatte flach gegen den Deckelschlupf liegt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Anzahl der Zellen im Sichtfeld nach der Bildgebung (siehe folgenden Abschnitt) nicht wünschenswert ist, passen Sie die Zelldichte der Probe durch Verdünnung oder Konzentration durch Zentrifugation an und ändern Sie das Verhältnis der Zellen in der Probe mit dem Wachstumsmedium/Puffer bei Bedarf. ANMERKUNG: Um die vom Kulturmedium ausgehtde Autofluoreszenz zu minimieren, können Zellen im Puffer gewaschen (z. B. in standard1x Phosphatpuffer-Saline) und vor der Bildgebung in angemessener Puffermenge resuspendiert werden. Es ist möglich, dass in diesem Schritt kleinere Zellen oder Vesikel nach der Zentrifugation nicht zurückgehalten werden und somit verloren gehen.</li>
	<li>Fügen Sie Wasser mit einer Pipette (5 L Tropfen) in den Raum innerhalb der Kulturschale (um den Deckel) hinzu, um das Trocknen des Agarose-Pads zu verhindern und um die Feuchtigkeit während der Bildaufnahme, insbesondere bei Zeitrafferexperimenten, aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Lassen Sie Kulturgerichte auf die Temperatur in der Inkubationskammer ausdemadien, einem vom Hersteller bereitgestellten eingebauten opaken Fach des Mikroskops für 15–20 min. HINWEIS: Schalten Sie das Heizelement ein und stellen Sie die Inkubationskammer einige Stunden vor der Bildgebung auf eine gewünschte Temperatur ein. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Hardware auf die neue Temperatur stabilisiert. Für eine längere Zeitraffer-Bildgebung legen Sie einen Becher oder Kolben mit Wasser in die Mikroskopkammer, weg vom Arbeitsbereich, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.</li>
</ol>3. Imaging
<ol><li>Schalten Sie am Tag des Experiments das Mikroskopsystem ein. Starten Sie die Bildverarbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien), indem Sie auf das entsprechende Symbol auf dem Desktop klicken. Initialisieren Sie das Mikroskop, indem Sie im Startdialogfeld der Software auf die Option Mikroskop initialisieren (Mit einem Mikroskop dargestellt) klicken. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv mit der Grobeinstellung des Mikroskops vor der Initialisierung vollständig abgesenkt wird. HINWEIS: Nach der Initialisierung sollten zusätzlich zum Startmenü drei zusätzliche Dialogfelder angezeigt werden: resolve3D, Datenerfassung und Filtermonitor.</li>
	<li>Legen Sie einen Tropfen von 1,517 (Refractive Index) Öl auf das 100x Öl Immersion Objektiv vom Hersteller geliefert (Numerische Blende = 1,4, Arbeitsabstand = 0,12 mm; siehe Tabelle der Materialien). HINWEIS: Es ist wichtig, das geeignete Tauchöl für die Temperatur zu wählen, bei der die Bildgebung durchgeführt wird.</li>
	<li>Die Glasbodenschale mit Probe in das Metallgehäuse (Sarg) legen und vorsichtig in die Bühnenklemme schieben.</li>
	<li>Verwenden Sie den groben Verstellknopf, um das Ziel zu erhöhen, bis das Öl mit dem Glasboden der Schale in Kontakt tritt. Verwenden Sie das Augenstück und den Feinverstellknopf, um die Probe in den Fokus zu rücken. Sobald die Zellen im Fokus sind, drehen Sie den Knopf vom Augenstück in den Kameramodus, indem Sie den Auswahlschalter auf der Vorderseite des Mikroskopkörpers nach links bewegen.</li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Experimentieren mit der Imaging-Software. Wählen Sie im resolve3D-Fenster das Design-/Ausführungsexperimentsymbol aus, das von einem Kolben dargestellt wird. Ein neues Dialogfeld mit dem Titel design/run experiment.<ol>
<li>Legen Sie die Anzahl der Z-Stacks und die Probendicke mithilfe des Entwurfs fest und schneiden Sie dann die Registerkarte im Dialogfeld Entwurf/Ausführung von Experimenten ab. HINWEIS: Für die Experimente im repräsentativen Ergebnisbereich wurden 17 Z-Stacks im 200-nm-Intervall für Standbilder und vier Z-Stacks im Abstand von 200 nm für die Zeitraffermikroskopie verwendet.</li>
		<li>Um die Dicke der Zellen in der Probe zu messen, passen Sie die Z-Ebene manuell inkrementell an, indem Sie die Auf- und Abwärtspfeile im Dialogfeld resolve3D verwenden. Markieren Sie, wo die Zellen a-focus als obere und untere Grenze für die Bildaufnahme gehen. Importieren Sie diese Informationen, bevor Sie das Experiment ausführen.</li>
		<li>Um Phototoxizität und Photobleichungen während der Zeitraffer-Bildgebung zu minimieren, reduzieren Sie die Anzahl der Z-Stacks und wählen Sie die Mittelebene der Zellen für die Bildaufnahme.</li>
	</ol></li>
	<li>Wählen Sie den entsprechenden Filtersatz für das Experiment mithilfe des Entwurfs und dann der Registerkarte Kanäle im Dialogfeld Design/Ausführen von Experimenten aus (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).<ol>
<li>Wählen Sie außerdem eine Referenz für die Erfassung von POL/DIC-Informationen aus. Passen Sie die prozentuale Übertragung (Lichtintensität) und die Dauer der Belichtung für einzelne Kanäle an, die vor der Bildgebung ausgewählt wurden, indem Sie die entsprechenden Optionen im Dialogfeld resolve3D auswählen. HINWEIS: In einem Testfeld, das für den Versuchstest nicht berücksichtigt wird, können diese Einstellungen ermitteln, ob die ausgewählten Parameter aussagekräftige Fluoreszenzdaten erhalten, ohne ein schwaches Signal zu verpassen oder zu übersät. Importieren Sie dann diese Parameter für die Versuchseinrichtung.</li>
	</ol></li>
	<li>Öffnen Sie die Punkteliste, indem Sie im Dialogfeld resolve3D die Schaltfläche Punkteliste auswählen. Ein neues Dialogfeld mit dem Titel Punkteliste. Markieren Sie mehrere Sichtfelder, die im Experiment verwendet werden sollen, indem Sie mithilfe der Mikroskopstufensteuerung geeignete Sichtfelder finden und die Markierungspunktoption im Dialogfeld Punkteliste auswählen. HINWEIS: Ein Austauschpunkt muss jedes Mal ausgewählt werden, wenn das Mikroskop auf einen Punkt in der Punkteliste neu fokussiert wird. Dies kann geschehen, indem Sie das Mikroskop auf den entsprechenden Punkt in der Liste fokussieren und dann die Schaltfläche "Punkt ersetzen" auswählen. Es ist wichtig, den analogen groben/feinen Einstellknopf beim Umfokussieren nicht zu berühren; verwenden Sie nur die Software, um den Fokus anzupassen.</li>
	<li>Legen Sie Zeitrafferparameter fest, indem Sie zuerst die Entwurfs- und dann die Registerkarte Zeitraffer im Dialogfeld Design/Ausführen von Experimenten auswählen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zeitraffer. Geben Sie die entsprechenden Zeitrafferparameter in Bezug auf Zeitrafferbilder/Gesamtzeit ein.</li>
	<li>Legen Sie Punkte fest, die aus der Punkteliste abgebildet werden sollen, indem Sie zuerst das Design auswählen und dann die Registerkarte "Punkte" im Dialogfeld Design/Ausführen von Experimenten. Wählen Sie die Option "Listenpunkte" aus, und geben Sie Punkte ein, die in das textfeld getrennt durch Kommas oder Bindestriche abgebildet werden sollen, wenn es sich um eine vollständige Sequenz handelt.</li>
	<li>Bearbeiten Sie vor Beginn eines Experiments Dateinamen und Dateispeicherorte mithilfe der Registerkarte Ausführen im Dialogfeld Entwurf/Ausführung. Der Speicherort der Datei kann geändert werden, indem Sie die Schaltfläche "Einstellungen" auswählen, den Datenordner auswählen und dann den entsprechenden Ordner auswählen oder einen neuen Ordner erstellen. Ändern Sie Dateinamen, indem Sie den neuen Dateinamen in das Textfeld Bilddateiname eingeben.</li>
	<li>Beginnen Sie das Experiment, indem Sie die Wiedergabeschaltfläche im Dialogfeld "Experiment beginnen" auswählen. HINWEIS: Überprüfen Sie für Zeitraffer kontinuierlich den Fokus auf jedes Sichtfeld während des Gesamten DesExperiments mithilfe der DIC-Einstellung (um unnötiges Photobleichen zu vermeiden) und die Informationen in der Punkteliste neu zu fokussieren und zu aktualisieren, da Zellen im Laufe der Zeit tendenziell aus dem Fokus geraten.</li>
</ol>4. Bildverarbeitung
<ol><li>Öffnen Sie die gewünschten Raw-Bilddateien (R3D) für die Generierung von Figuren. HINWEIS: Kürzlich gespeicherte Dateien können über die Schaltfläche Datenordner im Startdialogfeld der Imaging-Software gefunden werden.</li>
	<li>Führen Sie das Dekonvolution-Programm aus, um das nicht fokussierte Fluoreszenzlicht7,8zu entfernen, um eine dekonvolvede D3D-Bilddatei zu erzeugen. Wählen Sie die Registerkarte Prozess im Dialogfeld "Start" aus, und wählen Sie dann deconvolveaus. Ein neues Dialogfeld mit dem Titel deconvolvewird angezeigt.<ol>
<li>Legen Sie die Dekonvolution-Parameter fest, indem Sie die entsprechende Bildnummer (in der oberen linken Ecke jeder Bilddatei) auf die Eingabe im Dialogfeld Dekonvolution ziehen. Aktivieren Sie im Dialogfeld Dekonvolution die Schaltfläche "Weitere Optionen", und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen "Zuschneiderahmen", nachdem Sie das Kontrollkästchen verarbeitet haben (sonst können die Bilder nicht über die entsprechende DIC-Datei überlagert werden).</li>
		<li>Klicken Sie im Dialogfeld Dekonvolution auf die Schaltfläche "Do it", um die Rohbilddatei zu dekonvolvenieren. HINWEIS: Die Dekonvolution-Parameter können entsprechend der Anleitung des Softwareherstellers für gewünschte Ergebnisse angepasst werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie bei Bedarf manuelle Hintergrundrauschensubtraktion und Helligkeits-/Kontrastanpassung in einem oder allen Wellenlängenkanälen (Farbe) durch. Wählen Sie dazu die Kontrasteinstellungstaste in der dekonvolvedbildnen Bilddatei aus.</li>
	<li>Speichern Sie das Bild als TIFF-Datei, indem Sie zuerst die Dateioption oben im D3D-Dialogfeld auswählen. Wählen Sie dann Speichern als TIFF aus, identifizieren und wählen Sie geeignete Z-Stacks (die sich im Fokus befinden), wählen Sie gewünschte Filtersätze aus oder deaktivieren Sie diese.</li>
	<li>Führen Sie die Datenquantifizierung mit einer vom Hersteller bereitgestellten Software oder frei verfügbaren Programmen wie ImageJ5durch.<ol>
<li>Klicken Sie für die Quantifizierung der Zellengröße auf die Werkzeugregisterkarte in der entsprechenden D3D-Bilddatei, und wählen Sie dann die Option Entfernungen messen aus. Messen Sie Die Entfernungen, indem Sie Start- und Endpunkte in der gewünschten Bilddatei mit der Maus durch linksklicks auswählen. HINWEIS: Es ist am besten, das Bild während der Quantifizierung der Zellengröße zu vergrößern.</li>
		<li>Verwenden Sie für die Fluoreszenzsignalquantifizierung die Dateninspektor-Option unter der Werkzeugregisterkarte der entsprechenden D3D-Bilddatei. HINWEIS: Es ist am besten, das Bild zu vergrößern und nur relevante Filter ausgewählt zu haben, wenn die Fluoreszenzsignalquantifizierung abgeschlossen wird.</li>
		<li>Um das Fluoreszenzsignal zu quantifizieren, zeichnen Sie ein Feld mit der Option Spalte/Zeile, die auf eine bestimmte Dimension festgelegt ist. Wählen Sie einen Bereich mit signal aus, der quantifiziert werden soll, und zeichnen Sie den Wert auf. Messen Sie das Hintergrundsignal, indem Sie das gleiche Größenfeld verwenden, um einen Bereich direkt außerhalb der Zellen auszuwählen. Subtrahieren Sie den Hintergrundwert von dem Wert, der vom Fluoreszenzsignal in der Zelle aufgezeichnet wurde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li>
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<li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splitsville%3A+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Mikroskopie ist nach wie vor eine tragende Säule in Studien über mikrobielle Organismen. Angesichts ihrer Mikron-Zellgröße stützten sich Einzelzell-Level-Studien traditionell auf Elektronenmikroskopie (EM). Obwohl EM in den letzten Jahren zu einer recht leistungsfähigen Technik geworden ist, hat es neben dem eingeschränkten Benutzerzugriff16seine eigenen intrinsischen Einschränkungen. Verbesserungen in fluoreszenzmikroskopischen Techniken und die Entwicklung verschiedener Fluoreszenzsonden, wi...

Der Bereich der bakteriellen Zellbiologie wurde durch die jüngsten Fortschritte in den Mikroskopietechniken1,2deutlich verbessert. Unter anderem sind Mikroskope, die in der Lage sind, Zeitrafferfluoreszenzmikroskopieexperimente durchzuführen, ein wertvolles Werkzeug. Die Forscher können verschiedene physiologische Ereignisse in Echtzeit mit fluoreszierenden Proteinen wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP) basierende Transkriptions- und Translationalreporterfusionen, fluoreszierende D-Aminosäuren (FDAA)3überwachen oder andere Flecken zur Kennzeichnung der Zellwand, Membran und DNA verwenden. Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Fluoreszenzmikroskopie bei mikrobiellen Zellbiologen nach wie vor beliebt ist. Neben der einfachen Darstellung der Endphänotypen könnte die Bereitstellung von Informationen darüber, wie die beobachteten Phänotypen mittels Zeitraffermikroskopie entstehen, den Befunden einen signifikanten Mehrwert verleihen und potenziell Hinweise darauf liefern, welche zellulären Prozesse von potenziellen Wirkstoffkandidaten ins Visier genommen werden4.
Die Protokolle zur Durchführung hochauflösender Bildgebung mit einem vollmotorisierten, invertierten Weitfeldfluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle)finden Sie in diesem Artikel. Diese Protokolle könnten an die Anforderungen anderer Fluoreszenzmikroskope angepasst werden, die in der Lage sind, Zeitraffermikroskopie durchzuführen. Obwohl die hier diskutierte Software der spezifischen vom Hersteller gelieferten Software entspricht, wie in der Tabelle der Materialienangegeben, verfügen Software, die üblicherweise von anderen Mikroskopherstellern geliefert wird, oder das frei verfügbare ImageJ5über gleichwertige Werkzeuge zur Analyse von Mikroskopiedaten. Für Bedingungen, bei denen Zeitraffer nicht förderlich ist, könnten Zeit-Kurs-Experimente durchgeführt werden, wie in diesem Artikel beschrieben. Die hier beschriebenen Protokolle bieten einen detaillierten Leitfaden zur Untersuchung der phänotypischen Veränderungen bei zwei verschiedenen Bakterienarten: B. subtilis und S. aureus. Siehe Tabelle 1 für verwendete Stämme.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>Molekularbiologie - Low EEO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1755-10</td><td>Dioxanfrei</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Customized Olympus IX-71 Inverses Mikroskopstativ; Kundenspezifischer Beleuchtungsturm und Durchlichtbeleuchtungsmodul. Objektive: PLAPON 60X (N.A. 1,42, WD 0,15 mm); OLY 100X ÖL (N.A. 1,4, WD 0,12 mm); DIC Prism Nomarski für 100X Objektiv; CoolSnap HQ2 Kamera; SSI-Montage 7-farbig; Klimakontrollkammer - undurchsichtig.</td></tr><tr><td>PC190723</td><td>MilliporeSigma</td><td>3445805MG</td><td>FtsZ-Inhibitor</td></tr><tr><td>SoftWorx</td><td>GE</td><td></td><td>Vom Hersteller bereitgestellte Bildgebungssoftware</td></tr></tbody></table>

live-cell fluoreszenzmikroskopie zur untersuchung subzellulärer proteinlokalisierung und zellmorphologie veränderungen in bakterien

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Untersuchungen von Faktoren, die die Zellteilung und die Zellform von Bakterien beeinflussen, werden häufig in Verbindung mit einer hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, da Beobachtungen auf Populationsebene möglicherweise nicht wirklich widerspiegeln, was auf einer einzelnen Zellebene geschieht. Die Zeitraffermikroskopie mit Live-Zellen ermöglicht es den Forschern, die Veränderungen in der Zellteilung oder Zellmorphologie zu überwachen, die wertvolle Erkenntnisse über die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen und den Zeitpunkt der Genexpression liefern, um möglicherweise bei der Beantwortung wichtiger biologischer Fragen zu helfen. Hier beschreiben wir unser Protokoll zur Überwachung phänotypischer Veränderungen bei Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus mit einem hochauflösenden Dekonvolutionmikroskop. Ziel dieses Berichts ist es, ein einfaches und klares Protokoll zu erstellen, das von anderen Forschern angenommen werden kann, die an der Durchführung von Fluoreszenzmikroskopieexperimenten interessiert sind, um verschiedene biologische Prozesse bei Bakterien und anderen Organismen zu untersuchen.

GpsB-Phänotypen Zuvor haben wir gezeigt, dass Sa-GpsB ein essentielles Protein ist, da die Erschöpfung von GpsB mit einer Antisense-RNA zu einer Zelllyse9führt. Hier beschreiben wir, wie die Entstehung verschiedener Zellteilungsphänotypen und Veränderungen in der Proteinlokalisierung mit dem in diesem Artikel beschriebenen Zeitraffermikroskopieprotokoll erfasst werden konnten. Zu diesem Zweck wurden die S. aureus-Stämme RB143 [SH1000 mit pEPSA5 (leerer Vektor)] und GGS...

Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierungsdynamik von Proteinen und zur Überwachung morphologischer Veränderungen mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.

Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Dieses Protokoll erleichtert die direkte Beobachtung verschiedener phänotierter Veränderungen auf Einzelzellebene und ermöglicht die kontinuierliche Überwachung der Proteinlokalisierung und des Timings der Genexpression. Der Hauptvorteil der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass sie eine einfache Methode zur Überwachung verschiedener biologischer Prozesse ist, wie z. B. Zellteilung und Zellmorphologieveränderungen in lebenden Zellen. Achten Sie darauf, dem Probenvorbereitungsprotokoll besondere Aufmerksamkeit zu schenken und die Mikroskopsoftware zu untersuchen, um die in diesem Protokoll aufgeführten Einstellungen und Optionen zu finden.Eine visuelle Darstellung dieses Protokolls ist von entscheidender Bedeutung, da es Benutzern ermöglicht, die wichtigen Schritte der Technik beim Einrichten ihrer eigenen Experimente zu beobachten und zu erlernen. Beginnen Sie mit der Kennzeichnung eines fünf bis 50-Mikroliter-Aliquotders der Zellkultur von Interesse mit einem geeigneten Membranfärbefarbstoff und fügen Sie fünf Mikroliter der gefärbten Bakterienzellen auf einen Deckelschlupf auf dem Boden einer 35-Milliliter-Glasbodenkulturschale hinzu. Legen Sie eine Agarose-Platte mit einem Durchmesser von 11 Millimetern über die Probe und tippen Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Platte flach gegenüber dem Deckelschlupf ist.Fügen Sie dann etwa fünf Mikroliter Wasser um den Deckelschlupf, um zu verhindern, dass das Agarose-Pad trocknet und die Kulturschale auf die Temperatur in der Inkubationskammer eines hochauflösenden Dekonvolutionmikroskops für 15 bis 20 Minuten ausdemaiert. Um die Probe abzubilden, verwenden Sie den groben Einstellungsfokusknopf, um sicherzustellen, dass das Objektiv vollständig abgesenkt wird, bevor Sie das Mikroskop innerhalb der Mikroskopsoftware initialisieren. Legen Sie einen Tropfen von 1.517 Brechungsindexöl in das 100-fache Öl-Immersionsziel und übertragen Sie die Glasbodenschale mit der Probe in den Metallgehäusesarg.Schieben Sie die Schale vorsichtig in die Bühnenklemme, und verwenden Sie den groben Verstellknopf, um das Ziel zu erhöhen, bis das Öl mit dem Glasboden der Schale in Kontakt tritt. Verwenden Sie das Okular und den Feinverstellknopf, um die Probe in den Fokus zu rücken, und wechseln Sie in den Kameramodus. Wählen Sie in der Bildverarbeitungssoftware im 3D-Fenster 3D auflösen das Symbol "Experiment entwerfen/ausführen" aus.Ein neues Dialogfeld mit dem Titel Design/Ausführen von Experimenten wird angezeigt. Öffnen Sie die Registerkarten Entwurf und Schnitt im Dialogfeld, um die Anzahl der Z-Stacks und die Probendicke festzulegen. Um die Dicke der Zellen in der Stichprobe zu messen, passen Sie die Z-Ebene mit den Auf- und Abwärtspfeilen im Dialogfeld 3D auflösen inkrementell an, sodass die Zellen als obere und untere Grenzwerte für die Bildaufnahme aus dem Fokus verschwinden.Nachdem Sie die prozentuale Übertragung der Lichtintensität und die Dauer der Belichtung für die einzelnen ausgewählten Kanäle im Dialogfeld 3D auflösen angepasst haben, klicken Sie auf Punkteliste, um die Punkteliste zu öffnen. Aktivieren Sie auf den Registerkarten Entwurf und Zeitraffer das Kontrollkästchen Zeitraffer und geben Sie die Zeitrafferparameter ein. Wählen Sie die Option "Listenbesuch" aus, und geben Sie die Punkte ein, die im Textfeld abgebildet werden sollen, indem Sie die Punkte durch Kommas oder Bindestriche für vollständige Sequenzen trennen.Bearbeiten Sie dann Dateinamen und Dateispeicherorte auf der Registerkarte Ausführen, und wählen Sie Wiedergabe im Dialogfeld Experiment beginnen aus, um das Experiment zu starten. Öffnen Sie am Ende der Analyse die RAW-Bilddateien, die für ein entsprechendes Dekonvolutionprogramm von Interesse sind, und wählen Sie die Registerkarte Prozess und Deconvolve aus. Führen Sie alle manuellen Hintergrundrauschensubtraktion und Helligkeitskontrastanpassung in einem oder allen Wellenlängenkanälen nach Bedarf durch, bevor Sie das Bild als TIFF-Datei speichern.Öffnen Sie zur Quantifizierung der Zelllänge die entschlüsselten Bilddateien im vom Hersteller bereitgestellten Software oder in freier Imaging-Software wie ImageJ, und öffnen Sie die Registerkarte Tool. Wählen Sie dann Entfernungen messen aus, und klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Start- und Endpunkte in der gewünschten Bilddatei, um die Zellenlänge zu messen. Wählen Sie für die Fluoreszenzsignalquantifizierung Data Inspector aus.Zeichnen Sie ein Feld mit der Option Spalte/Zeile auf die spezifische Dimension von Interesse, und wählen Sie den Bereich mit dem zu quantifizierenden Signal aus. Die Zugabe von Xylose zur Induzieren eines GGS 8-Stamms führt zu einem Phänotyp mit sechs Zellen. Während leere Vektorsteuerelemente den Kontrollzellen ähneln, die ohne Induktor gewachsen sind.Die Überproduktion von Staph aureus gpsB stört die Zellteilung in B.subtilis, gemessen an der Zeitraffermikroskopie und der Zelllängenquantifizierung. Darüber hinaus können die Lokalisationsmuster von FtsZ oder eines der mit diesem Protein assoziierten Proteine als Reporter verwendet werden, um neuartige antimikrobielle Verbindungen durch die Zeitraffer-Bildgebung und zelllängenquantifization zu untersuchen und/oder zu identifizieren. Achten Sie darauf, ein Öl mit dem entsprechenden Brechungsindex zu verwenden, da sich der Brechungsindex je nach der für die Abbildung verwendeten Temperatur ändern kann.Die Dekonvolution kann durchgeführt werden, wenn der Benutzer berührungslos rauschen möchte, und datenanalyse mit fluoreszierender Signalquantifizierung und Zelllängen- und Breitenmessungen können ebenfalls durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um einzelne Zelle Verhalten verschiedener Bakterien in der Zeit mit Hilfe automatisierter Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie zu überwachen. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien, wie die Mikroskopie-Aufnahmen zu analysieren.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere...

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Quelle: Brzozowski, R. S. et al. Live-Cell-Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der subzellulären Proteinlokalisierung und Veränderungen der Zellmorphologie bei Bakterien. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert die Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen, um morphologische Veränderungen in Echtzeit bei Bakterien zu visualisieren. Es beschreibt die Schritte, die für Bildgebung, Zeitrafferaufnahme und Dekonvolution erforderlich sind, um hochauflösende Bilder in Echtzeit zu erhalten.

Bildgebung morphologischer Veränderungen bei Bakterien mittels lebender Zellfluoreszenzmikroskopie

Das Video beschreibt die FLIM-FRET-Bildgebungstechnik zur Bestimmung der Protein-Protein-Interaktion in lebenden Bakterien, die zytoplasmatische Proteine exprimieren, die mit fluoreszierenden Proteinen, einem Donor-eGFP und einem Akzeptor mCherry markiert sind. Die kombinierte Technik ermöglicht auch die Quantifizierung der interagierenden Proteine.

FLIM-FRET-Bildgebung zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien

Ein auf lebenden Zellen basierendes Verfahren zur Beleuchtung von zellulären Vakuolen (Einschlüssen), die Chlamydien enthalten, wird beschrieben. Diese Strategie ermöglicht eine schnelle, automatisierte Bestimmung der Infektiosität von Chlamydien in Proben und kann zur quantitativen Untersuchung der Wachstumsdynamik des Einschlusses verwendet werden.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Bakterienzellen sind räumlich sehr organisiert. Um diese Organisation im Laufe der Zeit in den langsam wachsenden Myxococcus Xanthus Zellen zu folgen, wurde ein Setup für Fluoreszenz live Cell Imaging mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung über mehrere Generationen hinweg entwickelt. Mit dieser Methode konnte raumzeitliche Dynamik wichtige Proteine für Chromosom Segregation und Zellteilung bestimmt werden.

Fluoreszenz Live Cell Imaging der komplette Vegetative Zellzyklus von langsam wachsenden sozialen Bakterium Myxococcus xanthus

Dieses live-bakterielle Zellbildgebungsprotokoll ermöglicht die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen mehreren Bakterienarten auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit. Die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung jeder Bakterienart in Monokultur oder Kokultur, um Wechselwirkungen zwischen den Arten in bakteriengemeinschaften mit mehreren Arten, einschließlich individueller Zellbeweglichkeit und Lebensfähigkeit, zu untersuchen.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Erfahren Sie die Live-Cell-Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus. Diese Methode ermöglicht die direkte Beobachtung von Phänotypänderungen auf Einzelzellebene.

Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien (Video) | JoVE Journal

Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien

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