Name: In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie ein In-vitro-Assay die Interaktion zwischen Tumorzellen und Makrophagen untersucht. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Makrophagen-Rekrutierung durch konditioniertes Medium und unterstützt die Entwicklung personalisierter Krebstherapien.

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Grant Support: Z. An received support from Alex es Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 and Program for Breakthrough Biomedical Research, which is partially funded by the Sandler Foundation. W. Weiss wurde durch NIH-Stipendien R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103 unterstützt; Die Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; und den Stuhl Evelyn und Mattie Anderson.

1. Mittlere Vorbereitung
<ol><li>
Vorbereitung des serumfreien Stammzellmediums
	<ol>
<li>Die 50x B27-Ergänzung, den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF, 20 g/ml in 10 mM Essigsäure mit 0,1% BSA) und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF, 20 g/ml in 10 mM Essigsäure mit 0,1% BSA) auftauen.</li>
		<li>Fügen Sie 500 l EGF (Endkonzentration 20 ng/ml), 500 l FGF (Endkonzentration 20 ng/ml), 10 ml 50x B27 bis 500 ml Dulbeccos modifizierte Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) und 5 ml mit 100x Penicillin/Streptomycin (Penrep/Strep). Invertieren Sie die Flasche 4-6 mal zu mischen, Filter sterilisieren durch eine 500 ml 0,1 m Filtrationsbecher. Die Flasche markieren und bei 4 °C lagern. HINWEIS: Das Medium ist gut für bis zu einem Monat bei 4 °C zu verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereiten des Kulturmediums MV-4-11: 50 ml fetales Rinderserum (FBS) zu 500 ml von Iscovees modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) hinzufügen. Invertieren Sie die Flasche 4-6 mal zu mischen, Filter sterilisieren durch eine 500 ml 0,1 m Filtrationsbecher. Die Flasche markieren und bei 4 °C lagern. HINWEIS: Das Medium ist gut für bis zu einem Monat bei 4 °C zu verwenden.</li>
	<li>Vorbereiten des Tumorzellerhaltungsmediums: Fügen Sie 50 ml FBS zu 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu. Invertieren Sie die Flasche 4-6 mal zu mischen, Filter sterilisieren durch eine 500 ml 0,1 m Filtrationsbecher. Die Flasche markieren und bei 4 °C lagern. HINWEIS: Das Medium ist gut für bis zu einem Monat bei 4 °C zu verwenden.</li>
</ol>2. Zellvorbereitung
Tag 1:
<ol><li>Auftauen von Tumorzellen</li>
	<li>Erwärmen Sie das Tumorzellerhaltungsmedium (wie in Schritt 1.3 beschrieben) in einem 37 °C Wasserbad für 20 min.</li>
	<li>Nehmen Sie die gefrorenen Zellen U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII und U87:EGFR+EGFRvIII aus dem flüssigen Stickstofftank. Die Zellen im 37 °C-Wasserbad 2 min auftauen. VORSICHT: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Zellen aus dem flüssigen Stickstofftank nehmen. Tragen Sie bei Bedarf Handschuhe mit Wärmeschutz und Schutzbrille.</li>
	<li>Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab.</li>
	<li>Sprühen Sie die kryogenen Durchstechflaschen mit Zellen und die mittlere Flasche mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.</li>
	<li>Pipette 5 ml Tumorzellerhaltungsmedium in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr. Invertieren Sie die Röhre mit Tumorzellen 4-6 mal zu mischen. Alle Zellen in das 15 ml Zentrifugenrohr pipette. Invertieren Sie das Zentrifugenrohr 4-6 mal zu mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 10 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS). Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 12 ml Tumorzell-Erhaltungsmedium (wie in Schritt 1.3 beschrieben). Pipette nach oben und unten 3-5 mal zu mischen. Übertragen Sie die Zellen in einen T75-Zellkulturkolben.</li>
	<li>Wachsen Sie die Zellen in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2. Stellen Sie das Tumorzellenpflegemedium wieder in den 4 °C-Kühlschrank.</li>
</ol>Tag 2:
<ol start="2"><li>Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Ändern Sie das Medium bei Bedarf. Zellen sollten in einer Monolayer in kultur wachsen.</li>
</ol>Tag 3:
<ol start="3"><li>Auftauen von MV-4-11-Zellen
	<ol>
<li>Erwärmen Sie das Kulturmedium MV-4-11 (wie in Schritt 1.2 beschrieben) in einem 37 °C-Wasserbad für 20 min. HINWEIS: MV-4-11 kann je nach Bedarf der spezifischen Studie in primäre Makrophagen oder andere Makrophagenzellenlinien geändert werden.</li>
		<li>Nehmen Sie die gefrorenen MV-4-11-Zellen aus dem flüssigen Stickstofftank. Die Zellen in einem 37 °C-Wasserbad 2 min auftauen. ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Zellen aus dem flüssigen Stickstofftank nehmen. Tragen Sie bei Bedarf Handschuhe mit Wärmeschutz und Schutzbrille.</li>
		<li>Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab.</li>
		<li>Sprühen Sie die kryogenen Durchstechflaschen mit Zellen und die mittlere Flasche mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.</li>
		<li>Pipette 5 ml MV-4-11 Kulturmedium (wie in Schritt 1.2 beschrieben) in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr. Invertieren Sie die Röhre mit Tumorzellen 4-6 mal zu mischen. Alle Zellen in das 15 ml Zentrifugenrohr pipette. Invertieren Sie das Zentrifugenrohr 4-6 mal zu mischen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen in 10 ml PBS und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
		<li>Unterbrechen Sie die Zellen in 12 ml des MV-4-11-Kulturmediums (wie in Schritt 1.2 beschrieben). Sanft Pipette nach oben und unten 3-5 mal zu mischen. Übertragen Sie die Zellen in einen T75-Zellkulturkolben.</li>
		<li>Wachsen Sie die Zellen in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Spaltung von Tumorzellen
	<ol>
<li>Erwärmen Sie das serumfreie Stammzellmedium (wie in Schritt 1.1 beschrieben) in einem 37 °C-Wasserbad 20 min.</li>
		<li>Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab. Nehmen Sie die Lösung der Zellablösung aus dem Kühlschrank. Sprühen Sie die Flaschen der Mittel- und Zellablösung mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube. HINWEIS: Die Lösung der Accutase-Zellablösung nicht vorerwärmen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Tumorzellkultur aus dem Inkubator in die Gewebekulturhaube. Aspirieren Sie das Medium, fügen Sie 2 ml Zellablösung in den Kolben. HINWEIS: Das Spülen mit PBS vor dem Hinzufügen von Accutase ist hier optional.</li>
		<li>Stellen Sie den Kolben in die Kapuze. Prüfen Sie, ob sich die Tumorzellen jede Minute aufrunden. Sobald sich die Tumorzellen aufrunden, tippen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um den Zellen zu helfen, sich vom Kolben zu lösen.</li>
		<li>8 ml serumfreies Stammzellmedium in den Kolben, Pipette 3 Mal nach oben und unten zum Mischen und übertragen die Zellen in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen in 10 ml PBS. Pipette nach oben und unten 3-5 mal zu mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand. HINWEIS: Dieser Schritt ist optional.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen in 10 ml serumfreiem Stammzellmedium (wie in Schritt 1.1 beschrieben) wieder aus. Pipette nach oben und unten 3-5 mal zu mischen. Nehmen Sie 10 l der Zellen und mischen Sie sie mit 10 l Trypan Blue-Lösung. Pipette 10 l des Gemischs in den Zählschlitten, quantifizieren lebende Zellzahl mit einem automatischen Zellzähler.</li>
		<li>Stellen Sie die Zelldichte auf 2,5 x 105 Zellen/ml mit serumfreiem Stammzellmedium (wie in Schritt 1.1 beschrieben) und 2 ml der Zellen in jeden Brunnen einer 6-Well-Zellkulturplatte ein. Für jede Zellart 3 Brunnen (dreifache Probe). Zur gleichen Zeit, bereiten Sie 6 Brunnen mit 2 ml serumfreies Stammzellmedium nur (keine Zellen). HINWEIS: Diese Proben werden verwendet: 1) als Negativkontrollen und 2) zur Anpassung des konditionierten mittleren Volumens auf der Grundlage von Zellenzahlen.</li>
		<li>Legen Sie die 6-Well-Platten in einen 37°C-Inkubator mit 5% CO2 . Lassen Sie die Zellen für 24 h wachsen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. In Vitro Makrophagen Attraktion Assay
<ol><li>Aufbereitung konditionierter Medien
	<ol>
<li>Erwärmen Sie das Tumorzellerhaltungsmedium (wie in Schritt 1.3 beschrieben) in einem 37 °C Wasserbad für 20 min.</li>
		<li>Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab. Nehmen Sie die Lösung der Zellablösung aus dem Kühlschrank. Sprühen Sie die Flaschen des Mediums und die Zellablösung mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.</li>
		<li>Nehmen Sie die 6-Well-Platten aus dem Inkubator. Das konditionierte Medium sorgfältig in 15 ml sterile Zentrifugenrohre zerlegen. Die Rohre auf Eis legen. Pipette die Medien in den "Medien nur" gut in eine separate 15 ml sterile Zentrifuge Rohr. HINWEIS: Überprüfen Sie vor diesem Schritt unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen anheften. Ist dies nicht der Fall, kann man beschichtete Platten in Schritt 2.4.8 verwenden, um eine bessere Befestigung zu ermöglichen oder die schwimmenden Zellen in den Zählschritt einzubeziehen.</li>
		<li>Fügen Sie 0,5 ml Zellablösung in jeden Brunnen der 6-Well-Platte ein. Prüfen Sie, ob sich die Tumorzellen jede Minute aufrunden. Sobald sich die Tumorzellen aufrunden, tippen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte, um die Zellen zu lösen.</li>
		<li>Pipette 2,5 ml Tumorzellerhaltungsmedium in den Brunnen, Pipette 3 Mal nach oben und unten, um die Zellen zu mischen und in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr zu übertragen. Nehmen Sie 10 l der Zellen und mischen Sie sie mit 10 l Trypan Blue-Lösung. Pipette 10 l des Gemischs in den Zählschlitten und quantifizieren die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatischen Zellzähler.</li>
		<li>Passen Sie die Lautstärke des konditionierten Mediums anhand der Zellzahl mit dem serumfreien Stammzellmedium (37 °C Inkubation über Nacht) an die Zellenzahl an. Wenn Well A beispielsweise 3x so viele lebende Zellen hat wie der Brunnen mit der geringsten Anzahl von Zellen, verdünnen Sie seine konditionierten Medien 1:3. Dieser Schritt wird verwendet, um die Durchproliferationsrate der Zelle verursachten Unterschiede zu steuern. HINWEIS: Der Grund für die Verwendung eines serumfreien Stammzellmediums mit 37 °C Inkubation über Nacht ist die Kontrolle der möglichen Medienveränderung bei längerer 37 °C-Exposition.</li>
		<li>Filtern Sie das konditionierte Medium durch 0,45 m Filter. Setzen Sie die konditionierten Medien auf Eis. HINWEIS: Dieser Schritt entfernt Zellen und Zellablagerungen in den konditionierten Medien.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von MV-4-11-Zellen
	<ol>
<li>Erwärmen Sie das IMDM-Medium (ohne FBS) in einem 37 °C-Wasserbad für 20 min.</li>
		<li>Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab. Sprühen Sie die mittlere Flasche mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.</li>
		<li>Nehmen Sie den Kolben der MV-4-11-Zellen in die Gewebekulturhaube. Pipette 10 ml Zellen in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr. Nehmen Sie 10 l Zellen und mischen Sie sie mit 10 l Trypan Blue-Lösung. Pipette 10 l des Gemischs in den Zählschlitten und quantifizieren die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatischen Zellzähler. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen in IMDM-Medium (ohne FBS) für eine endgültige Zelldichte von 1x106 Zellen/ml aus. HINWEIS: Die Zellenanzahl der hier verwendeten Makrophagen kann angepasst werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Transwell-Assay HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Schritt ein Zellmigrations-Assay-Kit oder kaufen Sie die Reagenzien und legen Sie sie separat ein. Wählen Sie für MV-4-11-Zellen Transwell-Einsätze mit einer Porengröße von 5 m. Um die Makrophagenmigration zu erkennen, quantifizieren Sie direkt die Anzahl der Makrophagen in der unteren Kammer oder verwenden Sie kolorimetrische/fluorimetrische Methoden. Hier zeigen wir den Test mit der kolorimetrischen Methode.<ol>
<li>Bringen Sie die 24-Well-Platte, den Einsatz und die Reagenzien auf Raumtemperatur.</li>
		<li>Fügen Sie 250 L MV-4-11-Zellen, die oben zubereitet werden, in jeden Einsatz ein.</li>
		<li>Fügen Sie 400 l nur konditioniertes Medium/Medium (bei Nachtinkubation bei 37 °C, diese Proben dienen als Negativkontrolle) zu den unteren Kammern der 24-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie für jede Tumorlinie oder -kontrolle dreifache Proben. Vermeiden Sie Blasen zwischen dem Einsatz und dem konditionierten Medium. Blasen hemmen Makrophagen daran, in die unteren Brunnen zu wandern.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platten in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2 für 4 h. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann eingestellt werden. Zellen, die in die unteren Kammern wandern, können unter dem Mikroskop gesehen werden.</li>
		<li>Tippen Sie vorsichtig auf den Einsatz an der Innenwand desselben Brunnens und entsorgen Sie den Einsatz. Da MV-4-11-Zellen in Suspension wachsen, ist hier keine Zellablösung oder Trypsin-Behandlung erforderlich.</li>
		<li>Die Zellen in den Brunnen 3 Mal vorsichtig pipette, um sie zu mischen. Übertragen Sie 225 l Zellsuspension auf eine schwarzwandige 96-Well-Platte, die für die Fluoreszenzmessung geeignet ist.</li>
		<li>Den CyQuant Farbstoff 1:75 mit 4x Lysepuffer verdünnen. Wirbel kurz und drehen Sie die Lösung. Fügen Sie jedem Bohrgut der 96-Well-Platte 75 l Lösung hinzu. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Fluoreszenz mit dem 480/520 nm Filterset mit einem Fluoreszenzplattenleser lesen.</li>
		<li>Analysieren Sie Daten, indem Sie das Leerzeichen subtrahieren und sich auf die Kontrolltumorzelllinie normalisieren.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+function+of+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origin and function of tumor-associated macrophages.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).</li>
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<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+IL6+and+PD-1%2FPD-L1+Signaling+Abrogates+Mutual+Regulation+of+Their+Immunosuppressive+Effects+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).</li>
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</ol>

William A. Weiss ist Mitbegründer von StemSynergy Therapeutics. Zhenyi An hat nichts zu verraten.

In diesem Protokoll gibt es mehrere wichtige Schritte: 1) Auswahl der Transwell-Einfügung. Für die Zelllinie MV-4-11 funktionieren 5 m Transwell-Einsätze gut. Bei anderen Zelllinien, wie z. B. der häufig verwendeten Monozytenzelllinie THP-1, kann jedoch eine andere Porengröße besser funktionieren. 2) Da verschiedene Zelllinien mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wachsen, ist es wichtig, die Lautstärke der konditionierten Medien an die Zellenzahlen anzupassen. Dazu können zellfreie Medien, die unter den gleichen exper...

Makrophagen sind Immunzellen mit hoher phäkotypischer und funktioneller Heterogenität1. Sie spielen eine wichtige Rolle in den Wirtsabwehrsystemen, Gewebereparatur, Entwicklung und Tumorprogression1. TAMs sind Makrophagen in der Mikroumgebung von soliden Tumoren. Bestimmte TAMs können das Tumorwachstum fördern, indem sie t zellvermittelte zytotoxische Aktivität hemmen, die Tumormikroumgebung (TME) modulieren, Angiogenese, Invasion und Metastasierung fördern2,3,4, 5. TAMs gehören zu den häufigsten Zelltypen in der TME und eine höhere Anzahl von TAMs korreliert in der Regel mit schlechteren Patientenüberleben in vielen Arten von soliden Tumoren6. Die ausgeprägten genetischen Signaturen der Tumorzellen beeinflussen ihre Fähigkeit, Makrophagen zu rekrutieren. In GBM, einem aggressiven Hirntumor ohne Heilung, können Makrophagen bis zu der Hälfte der Tumormasse7ausmachen. Die Ko-Amplifikation des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seiner Abschneidemutung EGFRvIII wird häufig bei GBM beobachtet, was Tumorwachstumsvorteile8verleiht. Zellen, die EGFR und EGFRvIII mitexzieren, ziehen mehr Makrophagen an als Zellen, die EGFR oder EGFRvIII singly7exzieren.
Chemokine sind eine Familie von kleinen Zytokinen, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Immunzusammensetzung in der TME6,9spielen. Menschliche Zellen exprimieren mehr als 50 Zytokine10. Die Immuninfiltration in den Tumoren wird weitgehend durch die Wechselwirkung zwischen Zytokinen und Zytokinrezeptoren11realisiert. Jede Art von Immunzellen drückt unterschiedliche Chemokinrezeptoren/Chemokine aus und kann von Zellen rekrutiert werden, die bestimmte Chemokine/Chemokin-Rezeptoren sezernieren12. Krebszellen können die Expression bestimmter Chemokine erhöhen, um Immunzellen wie TAMs, regulatorische T-Zellen und myeloiden-abgeleiteten Suppressorzellen (MDSCs) zu rekrutieren6. Die Blockade von spezifischem Chemokin, das von den Tumoren sezerniert wird, kann ein vielversprechender Weg sein, um die Infiltration von Immunzellen in die Tumormasse zu hemmen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine In-vitro-Evaluierung der Tumor-Makrophagen-Interaktion ermöglicht, indem konditionierte Medien aus den Tumorzellen verwendet werden, die Chemokine und Makrophagenzelllinien enthalten.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mu; m Filterbecher</td><td>Thermo fisher</td><td>566-0010</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filtereinheit</td><td>Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipetten</td><td>Olympus Kunststoffe</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml sterile Zentrifugenröhrchen</td><td>Olympus Kunststoffe</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipettenspitze</td><td>ART molekulare Bioprodukte</td><td>2779-RI</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Aspirierpipette</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Teil von ECM507, oder kann separat erworben werden</td></tr><tr><td>4x Lysepuffer</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Teil von ECM507, oder kann separat erworben werden</td></tr><tr><td>5 &mu; m Transwell-Einsatz</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Teil von ECM507, oder kann separat erworben werden</td></tr><tr><td>75 cm2</td><td>Kolben Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Zelltechnologien</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant Dye</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Teil von ECM507, oder kann separat erworben werden</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Kugelschreiber</td><td>Strep Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Biorad</td><td>1450021</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro-assay zur untersuchung der tumor-makrophage-interaktion

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) machen einen großen Prozentsatz der Zellen in der Tumormasse für verschiedene Krebsarten aus. Glioblastom (GBM), ein bösartiger Hirntumor ohne Heilung, hat bis zu die Hälfte der Tumormasse TAMs. TAMs können pro-tumoral oder anti-tumoral sein, abhängig von der Aktivierung bestimmter Gene in den Zellen. Genetische Mutationen in den Tumoren können durch die Regulierung der Zytokinexpression die Rekrutierung von TAMs in die Tumormikroumgebung beeinflussen. Hier beschreiben wir einen quantitativen zellbasierten Assay zur Beurteilung der Makrophagenrekrutierung durch das konditionierte Medium aus den Tumorzellen. Dieser Test verwendet die menschliche Makrophagen-Zelllinie MV-4-11, um die Makrophagen-Anziehung durch das konditionierte Medium aus dem Glioblastom zu untersuchen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und geringe Variabilität ermöglicht. Die mit diesem Test generierten Daten können zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkung zwischen dem Tumor und der Tumormikroumgebung beitragen. Ähnliche Assay kann verwendet werden, um Interaktion zwischen den Tumorzellen und anderen Immunzellen zu bewerten, einschließlich T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK) Zellen.

Die Ergebnisse werden in der Regel über Balkendiagramme angezeigt (Beispiel in Abbildung 1). Stichproben mit hohen 480/520-Werten deuten darauf hin, dass die konditionierten Medien eine hohe Kapazität zur Rekrutierung von Makrophagen haben. Je nach experimentellem Bedarf können zusätzliche Kontrollen einbezogen werden. Zum Beispiel kann man neutralisierende Antikörper verwenden, um die konditionierten Medien zu behandeln, um die Makrophagen-Chemotaxis abzusch...

Dieser Artikel stellt einen nützlichen In-vitro-Assay dar, um die Fähigkeit des konditionierten Mediums aus Tumorzellen zu bewerten, Makrophagen anzuziehen.

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Tumorassoziierte Makrophagen spielen eine wichtige Rolle in der Tumormikroumgebung. Verstehen, wie unterschiedliche genetische Mutationen in den Tumorzellen die Rekrutierung von Makrophagen beeinflussen, ist entscheidend für die Entwicklung einer personalisierten Behandlung für Krebspatienten. Dieser Assay bietet eine einfache und robuste Möglichkeit, die Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und Makrophagen in vitro zu bewerten.Dieser Test kann modifiziert werden, um die Wechselwirkungen zwischen den Tumorzellen und anderen Immunzellen in vitro zu bewerten. Um dieses Verfahren zu beginnen, erwärmen Sie das serumfreie Stammzellmedium, indem Sie es 20 Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius legen. Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie die besprühte Oberfläche mit Papiertüchern ab.Als nächstes die Flaschen der Medium- und Zellablösungslösung mit 70% Ethanol besprühen und mit Papiertüchern abwischen. Übertragen Sie die gereinigten Flaschen in die Gewebekulturhaube. Holen Sie die Tumorzelle ab und übertragen Sie sie in die Gewebekulturhaube.Das Medium ansaugen und die Zellen mit 10 MilliliterPBS waschen. Fügen Sie dann zwei Milliliter Zellablösung in den Kolben. Stellen Sie den Kolben in die Kapuze und überprüfen Sie jede Minute, ob die Tumorzellen aufgerundet sind.Sobald sich die Tumorzellen aufrunden, tippen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um den Zellen zu helfen, sich zu lösen. Danach pipette acht Milliliter serumfreies Zellmedium in den Kolben und Pipette auf und ab dreimal zu mischen. Diese Zellsuspension bei 200 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge geben.Aspirieren Sie den Überstand. Dann waschen Sie die Zellen in 10 Milliliter PBS, um sicherzustellen, dass Pipette auf und ab drei bis fünf Mal zu mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 10 Milliliter serumfreies Medium. Pipette auf und ab drei bis fünf Mal zu mischen. Mischen Sie 10 Mikroliter dieser Zellsuspension mit 10 Mikroliter Trypan Blue Lösung.Nächste Pipette 10 Mikroliter der Trypan Blue und Zellmischung in einem Zählschlitten, und verwenden Sie einen automatischen Zellzähler, um die lebende Zellzahl zu quantifizieren. Verwenden Sie das serumfreie Zellmedium, um die Zelldichte auf 2,5-mal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter anzupassen. Dann säen Sie zwei Milliliter der Zellen in jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Kulturplatte.Gleichzeitig sechs Brunnen mit nur zwei Milliliters serumfreiem Stammzellmedium zubereiten. Danach die Sechs-Brunnen-Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubieren. Sprühen Sie zunächst die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie die besprühte Oberfläche mit Papiertüchern ab.Als nächstes die Flaschen der Medium- und Zellablösungslösung mit 70% Ethanol besprühen und mit Papiertüchern abwischen. Übertragen Sie die gereinigten Flaschen in die Gewebekulturhaube. Danach holen Sie die Sechs-Well-Platten aus dem Inkubator.Die konditionierten Medien vorsichtig in 15 Milliliter sterile Zentrifugenrohre zerlegen und die Rohre auf Eis legen. Fügen Sie 0,5 Milliliter Zellablösung in jeden Brunnen der Sechs-Brunnen-Platten, und überprüfen Sie jede Minute, ob die Tumorzellen aufgerundet haben. Sobald sich die Tumorzellen aufrunden, tippen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte, um die Zellen zu lösen.Nächste Pipette 2,5 Milliliter Tumorzellerhaltung semedium in den Brunnen und Pipette auf und ab dreimal zu mischen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 Milliliter steriles Zentrifugenrohr. Mischen Sie 10 Mikroliter Zellen mit 10 Mikroliter Trypan Blue Lösung, und übertragen Sie 10 Mikroliter dieser Mischung in den Zählschlitten.Verwenden Sie einen automatischen Zellzähler, um die Anzahl der lebenden Zellen zu quantifizieren, und verwenden Sie das serumfreie Stammzellmedium, das über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde, um die Lautstärke der konditionierten Medien an die Zellzahl anzupassen. Filtern Sie die konditionierten Medien durch 0,45 Mikrometer-Filter und legen Sie die konditionierten Medien auf Eis. Zunächst das IMDM-Medium in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten aufwärmen.Reinigen Sie die Gewebekulturhaube mit 70% Ethanol und reinigen Sie die Flasche des Mediums und transportieren Sie sie wie zuvor beschrieben in die Haube. Als nächstes übertragen Sie den Kolben der MV-4-11-Zellen in die Haube. Pipette 10 Milliliter Zellen in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr.Verwenden Sie Trypan Blue und einen automatischen Zellenzähler, um die Anzahl der lebenden Zellen wie zuvor beschrieben zu quantifizieren. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter PBS.Zentrifugieren Sie wieder bei 200 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in IMDM Medium bei einer endgültigen Zelldichte von einer Million Zellen pro Milliliter wieder aus. Bringen Sie zuerst die notwendigen Materialien auf Raumtemperatur.Fügen Sie 250 Mikroliter der vorbereiteten MV-4-11-Zellen zu jedem Einsatz hinzu. Als nächstes fügen Sie 400 Mikroliter entweder des konditionierten Mediums oder Mediums nur zu den unteren Kammern der 24-Well-Platte hinzu, um sicherzustellen, dass die Proben in dreifacher Ausfertigung hinzugefügt werden. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für vier Stunden inkubieren.Tippen Sie dann vorsichtig auf den Einsatz an der Innenwand desselben Brunnens und entsorgen Sie den Einsatz. Die Zellen in den Brunnen drei mal sanft nach oben und unten pipette, um sie zu mischen. Übertragen Sie 225 Mikroliter dieser Zellsuspension in die Brunnen einer schwarzwandigen 96-Well-Platte, die für die Fluoreszenzmessung geeignet ist.Anschließend den CyQUANT-Farbstoff mit 4x Lysepuffer im Verhältnis eins zu 75 verdünnen. Wirbel kurz und drehen Sie die Lösung. Übertragen Sie 75 Mikroliter dieser Lösung auf jeden Brunnen der 96-Well-Platte und brüten bei Raumtemperatur für 15 Minuten.Lesen Sie mit einem Fluoreszenzplattenleser die Fluoreszenz und analysieren Sie die im Textprotokoll beschriebenen Daten. In dieser Studie wird ein In-vitro-Assay verwendet, um die Tumormakrophagen-Wechselwirkung zu untersuchen. Proben mit hohen Fluoreszenzwerten deuten darauf hin, dass die konditionierten Medien eine hohe Kapazität zur Rekrutierung von Makrophagen haben.Je nach experimentellem Bedarf können zusätzliche Kontrollen einbezogen werden. Zum Beispiel kann man neutralisierende Antikörper verwenden, um die konditionierten Medien zu behandeln, um die Makrophagen-Chemotaxis abzuschaffen und die gleiche Weise durchzuführen. Man kann auch zusätzliche Chemokine zu den konditionierten Medien hinzufügen, die als positive Kontrolle dienen.Es ist wichtig, Zellzahlenunterschiede für diesen Test zu steuern, da verschiedene Zelltypen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wachsen können. In vivo Bestätigung der In-vitro-Ergebnisse sind entscheidend. Man kann Tumorzellen in Mäuse injizieren und die Tumoren mit Durchflusszytometrie, Immunostainierung und CyTOF analysieren, um die Ergebnisse zu bestätigen.

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Krebsforschung

In diesem Video untersuchen wir die Tumor-Makrophagen-Interaktion mit Hilfe eines fluoreszenzbasierten Transwell-Makrophagen-Interaktionsassays. Der Assay beinhaltet die Analyse der Migration von Makrophagen durch chemisch induzierte Chemotaxis.

Fluoreszenzbasierter Transwell-Makrophagen-Attraktionsassay: Eine In-vitro-Methode zur Untersuchung der Tumor-Makrophagen-Interaktion durch chemisch induzierte Chemotaxis

Um das bösartige Verhalten von Krebs zu verstehen, müssen genaue Modelle erstellt werden, wie Tumorzellen mit Komponenten der Tumormikroumgebung, wie z.B. Makrophagen, interagieren. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur Untersuchung der Interaktion von Glioblastomzellen mit tumorassoziierten Makrophagen und Mikroglia, bei denen die Wirkung auf die Glioblastominvasion bewertet wird.

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Makrophagen-phagozytische Aktivität gegen Krebszellen, insbesondere 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zellen, wurde in dieser Studie abgebildet. Das Modell der Kokultur von Lebenden Zellen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie erstellt und beobachtet. Diese Bewertung wurde mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware zur Entwicklung von Multipoint-Zeitraffervideos abget/die sich erstellt haben.

Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen

Hier präsentieren wir eine Methode mit durchlässigen Membranstützen, um die Untersuchung der berührungslosen Parakrinsignalisierung zu erleichtern, die von Tumorzellen verwendet wird, um die Immunantwort zu unterdrücken. Das System ist für die Untersuchung der Rolle von tumorsezerseten Faktoren bei der Dämpfung der Makrophagenaktivierung geeignet.

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die Interaktion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen mit einem Tumorsphäroid in einer dreidimensionalen (3D) Kollagen-I-Matrix zu untersuchen, mit der Möglichkeit, den Einfluss löslicher und physikalischer Eigenschaften der Mikroumgebung auf die Zellinvasion zu vergleichen.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Angesichts der begrenzten Xenotransplantat-Modelle, die zur Untersuchung von Interaktionen zwischen humanen CART- und myeloischen Zellen zur Verfügung stehen, haben wir in vitro und in vivo Modelle etabliert, um die Auswirkungen menschlicher Makrophagen auf CART-Zellen zu verstehen. Die Ergebnisse können möglicherweise verallgemeinert werden, um die Rolle von Makrophagen in der Tumormikroumgebung zu bewerten und Makrophagen-gezielte Immuntherapien zu testen.

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen myeloischen Zellen und CAR-T-Zellen in vitro und in vivo

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Anwendung von Rhodamin 123 zu identifizieren das mitochondriale Membranpotential (MMP) und CLIC4 Zuschlag-induzierte HN4 Zelle Apoptosis in-vitro-Studie. Unter gemeinsamen Fluoreszenzmikroskop und konfokale Laser scanning Fluoreszenzmikroskop war die Änderung des Echtzeit-die MMP aufgezeichnet.

Erkennung von Mitochondrien-Membran-Potential, CLIC4 Knockdown-induzierte HN4 Zelle Apoptosis In-vitro- Studie

Die Comet-Assay ist eine effiziente Methode um zu erkennen, dass DNA-Schäden einschließlich Einzel- und Doppelstrang-DNA bricht. Wir beschreiben basische und neutrale Comet Assays zur Messung der DNA-Schäden in den Krebszellen, die therapeutische Wirkung der Chemotherapie zu bewerten.

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

Dieses Protokoll beschreibt einen umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der verwendet werden könnten, um die Migration und Invasion Funktionen von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung unter Beibehaltung der Zelle Mikroumgebung zu quantifizieren. Dieser Test eignet sich für seltene und/oder empfindliche Zellen.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Dieser Beitrag stellt ein umfassendes Verfahren zur in Vitro zu bewerten, ob klassische Tumor-Angiogenese im Hämangioblastome (HBs) und ihre Rolle bei der HBs vorhanden ist. Die Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der HB-Neovaskularisation und deuten darauf hin, dass diese Form der Angiogenese nur einen ergänzenden Mechanismus in der HB-Neovaskularisation ist.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay

Erfahren Sie, wie ein In-vitro-Assay die Interaktion zwischen Tumorzellen und Makrophagen untersucht. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Makrophagen-Rekrutierung durch konditioniertes Medium und unterstützt die Entwicklung personalisierter Krebstherapien.

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

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