A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TE^definitely) in Cancers

Angesichts der Tatsache, dass TEdeff-Krebse ein wichtiger Wegbereiter gegen die Immuntherapie sind, ist unser pharmakologisches Modell ein vorteilhaftes Werkzeug, da es die weit verbreiteten transkriptions- und epigenetischen Defekte, die bei solchen Krebsarten beobachtet wurden, angemessen imitiert und es ermöglicht, diese nicht-genetischen Anomalien zu untersuchen, neue Erkenntnisse zu gewinnen, neue Verwendungen für bestehende Medikamente zu finden oder neue Strategien gegen solche Krebsarten zu finden. Dies ist ein einfach zu etablierendes und verallgemeinerbares Modell zur Untersuchung von Transkriptionsdehnungsdefekten bei Krebserkrankungen, die es ermöglichen, Tumor-Immun-Wechselwirkungen sowohl in vitro als auch in vivo zu untersuchen. Diese Methode kann auch auf menschliche Karzinomlinien angewendet werden.

Wir haben dies kurzfristig auf T47D und CAL51 getestet, was zu ähnlichen TEdeff-ähnlichen Eigenschaften führt. Das Protokoll, das wir hier beschreiben, gibt ein grundlegendes Framework, um die bekannten Variablen zu minimieren, die für die Generierung von TEdeff-ähnlichen Funktionen durch chronische CDK9-Hemmung entscheidend sind. Jedoch, Vorsicht ist zu beachten, um die genaue subletle Dosis von Flavopiridol für andere murine Linien zu optimieren.

Die Auswirkungen der Variation der Zellbeschichtungsdichte, Kulturbedingungen, Zytokinstimulation Bedingungen können für verschiedene Zellmurinlinien variieren. Beginnen Sie mit der Extraktion polyA-positiver RNA aus der Hälfte der zuvor ribosomalen RNA-erschöpften Proben mit Oligo dT-Magnetperlen. Die Perlen in der Durchstechflasche durch Wirbeln für 30 Sekunden wieder aufhängen und 200 Mikroliter der Perlen in ein Rohr übertragen.

Fügen Sie ein gleiches Volumen des Bindungspuffers hinzu, und mischen Sie den Inhalt. Legen Sie das Rohr für eine Minute in einen Magneten und entsorgen Sie den Überstand. Entfernen Sie dann das Rohr vom Magneten, und setzen Sie die gewaschenen Perlen in 100 Mikroliter Bindungspuffer wieder auf.

Stellen Sie das Volumen der ribosomalen RNA-erschöpften Probe auf 100 Mikroliter mit 10-Millimolar Tris-HCl bei pH 7,5 ein. Fügen Sie der Probe 100 Mikroliter Bindungspuffer hinzu. Erhitzen Sie das Gemisch zwei Minuten lang auf 65 Grad Celsius, um sekundäre RNA-Strukturen zu stören, und legen Sie es dann sofort auf Eis.

Fügen Sie die 200 Mikroliter gesamter RNA zu den 100 Mikrolitern gewaschener Perlen hinzu und mischen Sie sie fünf Minuten lang gründlich auf einem Rotor. Legen Sie das Rohr für ein bis zwei Minuten auf den Magneten, entfernen Sie sorgfältig alle Überstand, dann entfernen Sie das Rohr vom Magneten, und fügen Sie 200 Mikroliter Waschpuffer hinzu. Mischen Sie die Probe vorsichtig, indem Sie ein paar Mal nach oben und unten pfeifen, das Rohr für eine Minute zum Magneten zurückbringen und den Überstand entfernen.

Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer, um die Reinheit und Konzentration der isolierten perlengebundenen mRNA zu messen. Verwenden Sie die restliche Hälfte der ribosomalen RNA-erschöpften Probe als Input für Protein-A-Säulen, um fünfprimippisierte RNAs mit monoklonalen 7-Methylguanosin-Antikörpern zu immunprezipieren. Waschen Sie das Protein A Magnetperlen aus dem RIP-Kit gemäß dem Herstellerprotokoll, um den Antikörper an die Perlen, den 7-Methylguanosin-Antikörper an die Inder, die in 100 Mikroliter Waschpuffer aus dem Kit aufgehängt sind, vorzubinden.

Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten, während Sie bei niedriger Geschwindigkeit rotieren. Zentrifugieren Sie dann die Rohre kurz und legen Sie sie auf den magnetischen Separator. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, nehmen Sie dann die Rohre aus dem magnetischen Separator, und setzen Sie die Perlen mit 500 Mikroliter Waschpuffer wieder auf.

Wirbeln Sie die Rohre, zentrifugieren Sie sie kurz, und legen Sie sie wieder auf den magnetischen Separator, und wieder entsorgen Sie den Überstand. Dann fügen Sie 120 Nanogramm ribosomale RNA-depleted RNA zu den antikörpergebundenen Perlen zusammen mit einem Mikroliter RNase-Hemmer hinzu und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 60 bis 90 Minuten mit leichter Rührung. Nach der Inkubation die Probe 10 Sekunden lang bei 300 mal g abdrehen und den Überstand mit der ungekapselten mRNA in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen.

Wiederholen Sie die Wäsche zwei weitere Male mit 100 Mikroliter Waschpuffer, und pool den gesammelten Überstand. Elute die gekappte mRNA aus den Perlen durch Zugabe von 300 Mikroliter HarnstofflysePuffer nach den Manuskriptrichtungen vorbereitet und erhitzen die Mischung auf 65 Grad Celsius für zwei bis drei Minuten. Kombinieren Sie 300 Mikroliter der eluierten Probe mit 300 Mikroliter Phenol: Chloroform:Isoamylalkohol, invertieren zu mischen, und lassen Sie für 10 Minuten.

Mischen Sie die Probe wieder und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang. Die obere Schicht vorsichtig in ein frisches Rohr werfen und die untere Schicht entsorgen. Fügen Sie 300 Mikroliter 2-Propanol und 30 Mikroliter drei-Molar-Natriumacetat in die Probe, invertieren Sie es ein paar Mal, und legen Sie es in minus 20 Grad Celsius für 20 Stunden.

Nach der Inkubation zentrieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Den Überstand vorsichtig entsorgen und das Pellet bei Raumtemperatur fünf Minuten trocknen. Setzen Sie das Pellet in nukleasefreiem Wasser wieder auf und messen Sie die Reinheit und Konzentration der RNA mit einem Spektralphotometer.

Isolieren Sie CD8-positive Zellen nach den Manuskriptrichtungen, und setzen Sie die Zellen dann im handelsüblichen magnetischen Trennsystempuffer wieder aus. Fügen Sie 100 Mikroliter Antikörpercocktail für jeden Milliliter Zellen hinzu und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Magnetperlen pro 100 Mikroliter Antikörpercocktail hinzu und lassen Sie die Zellen für weitere 15 Minuten auf Eis.

Nach der Inkubation sieben Milliliter magnetischen Trennpuffer zu den Zellen hinzufügen, drei bis vier Milliliter zu einem frischen Rohr aliquotieren und das Rohr fünf Minuten lang auf einem Magneten platzieren. Dekantieren Sie die Flüssigkeit mit den CD8-positiven Zellen zu einem frischen Rohr auf Eis. Dann fügen Sie die restlichen drei bis vier Milliliter Zellen zu den magnetischen Perlen hinzu und legen Sie die Röhre fünf Minuten lang auf den Magneten.

Decant die zweite Charge von CD8-positiven Zellen auf das Rohr mit der ersten Charge. Saatgut entwickelt anhaftende Fibroblasten SAMBOK-Zellen zusammen mit dem kostimulierenden Molekül bei 75.000 Zellen pro Brunnen in 24-Well-Platten, und kulturieren sie in einem 37-Grad-Celsius, 5% Kohlendioxid befeuchteten Inkubator. Waschen Sie nach 24 Stunden die APC-Monoschicht einmal mit dem modifizierten Dulbecco-Medium von Iscove und fügen Sie 0,5-mal 10 zu den sechs naiven Zellen in zwei Milliliter Medium hinzu, das entsprechend den Manuskriptanweisungen ergänzt wird.

Kultur die Zellen für 20 Stunden, dann sanft ernten die nicht haftenden OT-I-Zellen durch Dassammeln der Medien und Pelletdien der Zellen bei 191 mal g für zwei Minuten. Zählen Sie die Zellen und säen Sie sie im Verhältnis eins zu eins in einer Kokultur mit B16/F10, unbehandelten B16/F10-OVA- und B16/F10-OVA-Zellen, die mit Flavopiridol vorbehandelt sind. Kultur die Zellen für 20 Stunden in einem 37-Grad-Celsius, 5% Kohlendioxid befeuchteten Inkubator, dann entfernen Sie die OT-I CD8-positive Zellen, und waschen Sie die anhaftenden B16/F10-OVA Zellen in PBS.

Versuchen Sie, die drei Gruppen von angeschlossenen Zellen in 05%EDTA mit Trypsin für fünf Minuten zu versuchen, und pellet sie dann bei 191 mal g für fünf Minuten. Inkubieren Sie die geernteten B16/F10-OVA-Zellen in kalten PBS mit Lebensfähigkeitsfarbstoff und relevanten markierten Antikörpern und analysieren Sie dann die Lebensfähigkeit mit Durchflusszytometrie. Dieses Protokoll wurde verwendet, um ein Transkriptionsdehnungs-defektes Zellmodell zu etablieren, das einen tiefen Verlust der Phosphorylierung an der Serin-2-Position auf der C-Terminal-Repeat-Domäne der RNA-Polymerase II und eine signifikante Abnahme von H3K36me3 zeigt, die an der Definition von Exongrenzen und der Hemmung von entlaufenen kryptischen Transkriptionen beteiligt ist.

Die Zellen zeigen kritische mRNA-Verarbeitungsfehler mit zunehmenden Verhältnissen von unsachgemäß gekappten und nicht polyadenylierten mRNAs. Darüber hinaus werden in diesem Zellmodell spezifische Repressionen von wichtigen Entzündungssignalen und FasL-vermittelten Zelltod beobachtet. Ein explorativer Test, um zu testen, ob das Zellmodell Resistenz gegen zytotoxischet T-Zell-Attacke verleiht, zeigt, dass chronische Flavopiridol-induzierte Transkriptionsdehnungsdefekte ein Mittel zur Flucht vor einem Anti-Tumor-Immunangriff begeben können.

Flavopiridol-behandelte B16/F10-Zellen, die das OVA-Gen stabil überexpressionierten, waren nicht anfällig für CD8-positive zytotoxische T-Zellen, die eine selektive Toxizität gegenüber OVA-exemitten Zellen aufweisen. Zellen, die nicht mit Flavopiridol vorbehandelt wurden, erlitten einen schweren Zelltod, während die Eltern B16/F10, die das OVA-Antigen nicht ausdrücken, überlebten. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Reduktion des Trimethylierungsniveaus von Phosphoserin 2 und H3K36 bei der Behandlung mit 25-nanomolarem Flavopiridol keine Verringerung des Phopsho-STAT1- und des Phospho-NF-KappaB-Spiegels garantiert.

Jede Mauskarzinomlinie ist einzigartig, und JAK1 und CCNT1 können die Wirkung von Flavopiridol retten. Darüber hinaus kann dieses Modell in vivo verwendet werden, um die Resistenz von TEdeff-Krebs gegen angeborene und adaptive Anti-Tumor-Immunreaktionen zu überwachen. Zum Beispiel könnten Anti-Asialo-Behandlungen verwendet werden, um die Aktivität von NK-Zellen zu regulieren, und Immun-Checkpoint-Therapie könnte TEdeff Tumor-tragende Mäuse verabreicht werden.

Die tumorinfiltrierende Lymphozyten- oder TIL-Belastung ist ein Indikator für den Erfolg in der Immuntherapie. Unser Modell hat uns den Weg geebnet, um das Ausmaß der Aktivierung und Erschöpfung von TILs in der TEdeff-Krebs-Mikroumgebung sowohl vor als auch nach der Immuntherapie zu erforschen.