Name: Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie den Düngezustand in Arabidopsis durch Analyse der Spermienkernmorphologie bewerten. Diese Methode ermöglicht schnelle Datenerfassung für statistische Analysen zur Untersuchung unbekannter Fertilisationsfaktoren.

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Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) und durch die Förderung des Strategic Priority Research Promotion Program on Phytochemical Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japan) unterstützt.

1. Künstliche Bestäubung
HINWEIS: Vor Beginn des Prozesses ist ein Paar Nr. 5 Zangen erforderlich.
<ol><li>A. thaliana (Col-0) bei 22 °C unter einem 16-h-Licht-/8-h-Dunkelzyklus in einer Wachstumskammer anbauen. HINWEIS: Schneiden und entfernen Sie den ersten entwickelten Blütenstiel mit der Schere, um die Entwicklung von Achselknospen zu fördern. Kräftig wachsende Pflanzen (2-3 Wochen nach dem Schneiden des ersten Stiels; Pflanzenhöhe ca. 25 cm) sind für die Analyse geeignet.</li>
	<li>Entfernen Sie Sepal (Abbildung 1B), Blütenblatt (Abbildung 1C) und Stamen (Abbildung 1D) der Blütenknospen im Stadium 118 (Abbildung 1A) mit Nr. 5 Zangen. Bud mit Flecken von Blütenblättern an der Spitze zu sehen ist am besten. HINWEIS: Verwenden Sie eine geeignete weibliche Gamete-Marker-Linie. In diesem Protokoll haben wir eine Wild-Typ-Pflanze als weibliches Elternteil verwendet.</li>
	<li>Fünfzehn bis achtzehn Stunden nach der Entschämung, nehmen Sie das Stamen einer DMP9KD/HTR10-mRFP Blume in Stufe 138, indem Sie das Filament mit Zangen kneifen.</li>
	<li>Um zu bestäuben, klopfen Sie das Stigma eines entstickten Stempels mehrmals mit einem dehiscent Anther.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Ovule zur Beobachtung
HINWEIS: Folgende Gegenstände sind erforderlich: ein Gleitglas mit doppelseitigem Klebeband, Nr. 5 Zangen, eine 27 G Injektionsnadel und ein Sezieren des Mikroskops.
<ol><li>7 bis 8 h nach der Bestäubung (HAP), sammeln Sie den Stempel und legen Sie ihn auf das doppelseitige Band, dann drücken Sie sanft mit Zangen, um den Stempel auf dem Band zu befestigen (Abbildung 2A,A'). HINWEIS: Die meisten Eizellen in einem Stempel erhalten mindestens ein Pollenrohr 10 HAP9. Wenn beide oder eine der Spermien aus dem ersten Pollenrohr nicht befruchtet, würde ein zweites Pollenrohr durch die Eizelle aufgrund des Düngungsrückgewinnungssystemsangezogen werden 10. Um die Spermienkernmorphologie aus dem ersten Pollenrohr zu analysieren, wird empfohlen, die Ovule-Vorbereitung spätestens um 10 HAP abzuschließen.</li>
	<li>Schneiden Sie die oberen und unteren Enden des Eierstocks mit einer Injektionsnadel unter einem Sezierendes Mikroskop ab (Abbildung 2B,B').</li>
	<li>Schlitzen Sie die Eierstockwand entlang beider Seiten des Replum (Abbildung 2C,C') durch Bewegen der Spitze der Injektionsnadel. HINWEIS: Setzen Sie die Injektionsnadel flach ein, um eine Ovuletrennung vom Septum zu verhindern.</li>
	<li>Evert die Eierstockwand mit der Injektionsnadel (Abbildung 2D,D').</li>
	<li>Kneifen Sie die Basis des Septums, mit dem die Ovules verbunden sind, und heben Sie sie vorsichtig mit Zangen an (Abbildung 2E).</li>
	<li>Übertragen Sie die Eizellen in einen Tropfen Wasser auf einem Gleitglas, und decken Sie vorsichtig mit einem Deckglas zur Beobachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2E,E').</li>
</ol>3. Mikroskopie
HINWEIS: In diesem Protokoll verwendeten wir ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Fluoreszenzfilterwürfel (siehe Materialtabelle),einer Digitalkamera und der dazugehörigen Software ausgestattet ist.
<ol><li>Erfassen Sie Bilder von Eizellen, die Mit mRFP beschriftete Spermakerne enthalten, mit einem 20-fachen oder 40-fachen Objektiv und der mitgelieferten Digitalkamera.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Anzahl der mRFP-markierten Spermakerne in einem Embryosack. HINWEIS: Ovules, die zwei mRFP-markierte Spermakerne enthalten, können für statistische Analysen in die Populationsgröße einbezogen werden.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Form und Position jedes mRFP-markierten Spermakerns in einem Embryosack. HINWEIS: Unmittelbar nach der Freigabe aus einem Pollenrohr wird ein Paar kondensierter mRFP-markierter Spermakerne zwischen dem Ei und der Zentralzelle lokalisiert. Ein dekondensierter mRFP-markierter Spermakern, der an der Seite des Chalazal-Endes nachgewiesen wurde, weist beispielsweise auf eine zentrale Zellbefruchtung hin. Durch die Verwendung einer geeigneten weiblichen Gamete-Membran-Markerlinie, wie in DerErgänzungsabbildung 1dargestellt, kann die Frage, ob die Spermien plasmogamie (nach Membranfusion, aber vor Karyogamy) durchlaufen, eindeutig überwacht werden.</li>
</ol>

<ol><li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+dialogs+in+green+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li>
<li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li>
<li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+HAP2+%28GCS1%29+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li>
<li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+gamete+membrane+protein+DMP9%2FDAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076(2018).</li>
<li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).</li>
<li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li>
<li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

HTR10-mRFP-Etiketten väterliches Chromatin (d. h. visualisiert Spermienkerne), und die Dynamik bei der Doppelbefruchtung wurde berichtet7. Unmittelbar nach der Freisetzung aus einem Pollenrohr werden HTR10-mRFP-markierte Spermakerne noch kondensiert. Jedoch, jeder der Spermienkerne wird bei der Verschmelzung mit einem befruchteten weiblichen Gamete-Kern bei Karyogamy drei bis vier Stunden nach Gamete Membranfusion7dekondensiert. Unbefruchtete Spermien bleiben kondensiert, w...

Blühende Pflanzen produzieren Samen durch doppelte Befruchtung, ein Prozess, der direkt durch Wechselwirkungen zwischen Proteinen gesteuert wird, die auf Gamete Plasmamembran1,2lokalisiert sind. Blühende Pflanzenmännchen gameten, ein Paar Spermien, entwickeln sich in Pollen. Ein Pollenrohr, das nach der Bestäubung wächst, liefert ein Paar Spermien an weibliche Gameten, eine Eizelle und eine zentrale Zelle, die sich in einem Embryosack entwickeln. Nachdem sich die männlichen und weiblichen Gameten treffen, fördern Proteine auf der Gamete-Oberfläche Die Erkennung, Anhaftung und Fusion, um eine doppelte Befruchtung zu vollenden. In früheren Studien wurden die männlichen Gamete-Membranproteine GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 und GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 als Befruchtungsregulatoren identifiziert, die an der Gamete-Fusion und Anlage. Kürzlich haben wir ein männliches Gamete-spezifisches Membranprotein, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), als Düngeregulator identifiziert, der an der Gamete-Interaktion beteiligt ist. Wir fanden heraus, dass eine Abnahme der DMP9-Expression zu einer signifikanten Hemmung der Befruchtung von Eizellen während der Doppelbefruchtung in A. thaliana6führt.
Da die Doppelbefruchtung in einem Embryosack auftritt, der in eine Eizelle eingebettet ist, die weiter mit Eierstockgewebe umwickelt ist, ist es schwierig, die Zustände von Doppelbefruchtungsprozessen zu beobachten und zu analysieren. Aus diesem Grund gibt es noch viele unklare Punkte, die ein vollständiges Verständnis des gesamten Mechanismus der doppelten Düngungskontrolle behindern. Die Etablierung von Beobachtungstechniken zur Verfolgung des Verhaltens von Gameten während der Doppelten Befruchtung unter in vivo-Bedingungen ist für die funktionelle Analyse potenzieller Kandidaten für Diebesregulatoren unerlässlich. Jüngste Studien haben Markerlinien ergeben, in denen subzelluläre Strukturen von Gamete mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet sind. In diesem Artikel zeigen wir ein einfaches und schnelles Protokoll zur Beobachtung der doppelten Befruchtung, das in einem Embryosack aufgetreten ist, der aus künstlich bestäubten Stempeln stammt. Mit Spermienkern MarkerLinie HTR10-mRFP7, kann der Befruchtungszustand jeder weiblichen Gamete auf der Grundlage der Spermien Kernsignal Morphologie diskriminiert werden. Unser Protokoll, das sich auf eine solche morphologische Veränderung der Spermienkerne bei der Befruchtung konzentriert, kann effizient eine ausreichende Menge an Daten für den statistischen Nachweis erhalten. Eine DMP9-Knockdown-Linie mit HTR10-mRFP-Hintergrund (DMP9KD/HTR10-mRFP) wurde als männliche Pflanzen verwendet, um ein einzelnes Düngemuster zu zeigen. Das Protokoll eignet sich auch für die funktionelle Analyse anderer Düngeregler.

<table><tbody><tr><td>BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td>Epifluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Matsunami Glas</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>Nichiban</td><td>NW-15S</td><td>15 mm Breite</td></tr><tr><td>DP72</td><td>Olympus</td><td></td><td>Degitalkamera</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Vigor Jegliche</td><td></td><td>Nr. 5 Pinzetten sind verfügbar</td></tr><tr><td>Wachstumskammer</td><td>Nihonika</td><td>LPH-411PFQDT-SP</td><td></td></tr><tr><td>HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. ( 2007)7Injektionsnadel</td></tr> <tr><td></td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td>27 G</td></tr><tr><td>Diaglas</td><td>Matsunami Glas</td><td>S9443</td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Olympus</td><td></td><td>Präpariermikroskop</td></tr><tr><td>U-MRFPHQ</td><td>Olympus</td><td></td><td>Fluoreszenzfilter Würfel (Anregung: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatischer Spiegel: DM565)</td></tr><tr><td>UPlanFL N 40x</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objektiv (NA 1.3), Öl-Immersion</td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objektiv (NA 0.75), trocken</td></tr></tbody></table>

bewertung des düngezustands durch rückverfolgung der sperma-kernmorphologie in arabidopsis doppeldüngung

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Blühende Pflanzen haben ein einzigartiges sexuelles Reproduktionssystem namens "Doppelte Befruchtung", in dem jede der Spermien präzise mit einer Eizelle oder einer zentralen Zelle verschmilzt. So finden fast gleichzeitig zwei unabhängige Düngeereignisse statt. Die befruchtete Eizelle und die Zentralzelle entwickeln sich zu Zygoten bzw. Endospermen. Daher ist eine präzise Kontrolle der Doppeldüngung für die anschließende Saatgutentwicklung unerlässlich. Die doppelte Befruchtung erfolgt im weiblichen Gametophyten (Embryosack), der tief versteckt und mit dicken Eizellen und Eierstockgeweben bedeckt ist. Diese Stempelgewebekonstruktion erschwert die Beobachtung und Analyse der Doppeldüngung und hat die gegenwärtige Situation geschaffen, in der viele Fragen zum Mechanismus der Doppeldüngung unbeantwortet bleiben. Für die funktionelle Bewertung eines potenziellen Kandidaten für die Düngungsregulierer ist eine phänotypische Analyse der Befruchtung wichtig. Um den Abschluss der Befruchtung in Arabidopsis thalianazu beurteilen, werden die Formen von Fluoreszenzsignalen, die Spermienkerne kennzeichnen, als Indikatoren verwendet. Eine Spermienzelle, die nicht befruchtet, wird durch ein kondensiertes Fluoreszenzsignal außerhalb der weiblichen Gameten angezeigt, während eine Spermienzelle, die erfolgreich befruchtet, durch ein dekondensiertes Signal aufgrund von Karyogamie mit dem Weiblichen Gametenkern angezeigt wird. Die hier beschriebene Methode stellt ein Werkzeug zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung unter in vivo-Bedingungen dar.

Ovules aus einem mit DMP9KD/HTR10-mRFP bestäubten Stempel wurden bei 7-8 HAP gesammelt und beobachtet.
Die meisten Eizellen enthielten zwei dekondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Eizelle (Mikropylarseite) und zentralen Zellkernpositionen (Abbildung3A),was auf eine erfolgreiche Doppelbefruchtung hindeutet. Darüber hinaus wurden Ovule beobachtet, die einen dekondensierte...

Wir zeigen eine Methode zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung auf Basis der Spermien-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppelbefruchtung mit einem Epifluoreszenzmikroskop.

Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, die Beteiligung eines bestimmten Faktors an der doppelten Befruchtung der Arabidopsis zu bewerten. Der Befruchtungsstatus kann anhand der Morphologie der Spermakerne auf einen Blick beurteilt werden, so dass die schnelle Erfassung der Daten für die statistische Auswertung möglich ist. Diese Methode ist spezifisch für die Bewertung für Befruchtung Phänotyp bei Arabidopsis.Es gibt immer noch unbekannte Düngung Regulatoren, auch wenn in Arabidopsis. Diese Methode wäre nützlich für die funktionelle Analyse zukünftiger unbekannter Düngefaktoren. Um die Fähigkeit des schnellen und intakten Umgangs mit den Eizellen zu beherrschen, sind wichtige für den Erfolg dieser Analyse.Zunächst wachsen Arabidopsis thaliana bei 22 Grad Celsius unter einem 16-stündigen Hellen und achtstündigen dunklen Zyklus in einer Wachstumskammer. Schneiden und entfernen Sie den ersten entwickelten Blütenstiel mit der Schere, um die Entwicklung von Achselknospen zu fördern. Messen Sie zwei bis drei Wochen nach dem Abschneiden des ersten Stiels die Pflanzenhöhe.Pflanzen mit einer Höhe von mehr als 25 Zentimetern gelten als kräftig wachsende Pflanzen und eignen sich zur Analyse. Um zu entleeren, suchen Sie nach Knospen in Stufe 11 mit Flecken von Blütenblättern an der Spitze gesehen. Verwenden Sie eine Nummer fünf Zangen, um Sepal, Blütenblatt und Stamen von Blütenknospen zu entfernen.15 bis 18 Stunden nach der Entschämung, nehmen Sie das Stamen einer DMP9-Knockdown-Linie mit Hintergrund der HTR10-mRFP-Blume in Stufe 13, indem Sie das Filament mit Zangen kneifen. Um zu bestäuben, klopfen Sie das Stigma eines entstickten Stempels mehrmals mit einem dehiscent Anther. Sieben bis acht Stunden nach der Bestäubung, sammeln Sie den Stempel und legen Sie ihn auf das doppelseitige Band.Drücken Sie dann vorsichtig mit Zangen, um den Stempel auf dem Band zu fixieren. Schneiden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die oberen und unteren Enden des Eierstocks mit einer Injektionsnadel ab. Bewegen Sie die Spitze der Injektionsnadel, um die Eierstockwand auf beiden Seiten des Replum aufzuschlitzen.Schneiden Sie sorgfältig, um den Funiculus und den Sendetrakt nicht zu trennen. Evert die Eierstockwand. Kneifen Sie die Basis des Septums, mit dem Dieovuls verbunden sind, und heben Sie sie vorsichtig mit Zangen an.Übertragen Sie die Eizellen in einen Tropfen Wasser auf einem Gleitglas, und decken Sie vorsichtig mit einem Deckglas zur Beobachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop. Passen Sie die Objektivlinse auf ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Fluoreszenzfilterwürfel ausgestattet ist, auf 20x oder 40x. Erfassen Sie Bilder der Eizellen, die Spermienkerne enthalten, die mit mRFP gekennzeichnet sind.Bestätigen Sie die Anzahl der mRFP-markierten Spermakerne in einem Embryosack. Bestätigen Sie die Form und Position jedes mRFP-markierten Spermakerns in einem Embryosack. In dieser Studie wurden Befruchtungsphänotypen durch Spermien-Kernsignalmorphologie in Ovule beurteilt.Die meisten Eizellen enthielten zwei dekondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Eizelle mikropylar Seite und zentrale Zelle Charazal Ende Seite. Dies deutet auf eine erfolgreiche Doppeldüngung hin. Darüber hinaus wurden Ovule beobachtet, die einen dekondensierten mRFP-markierten Spermakern am zentralen Zellkern sowie einen kondensierten mRFP-markierten Spermakern außerhalb der Eizelle enthielten, was auf eine einzelne Befruchtung hindeutet.Bei einer fehlgeschlagenen Doppelbefruchtung wurden zwei kondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Grenze der Eizelle und der Zentralzelle beobachtet. In der Analyse mit DMP9-Knockdown-Linie mit Hintergrund von HTR10-mRFP Pollen wurden selten Ovules beobachtet, die einen einzelnen kondensierten mRFP-markierten Spermakern oder drei oder mehr mRFP-markierte Spermakerne enthielten. In Kombination mit der Verwendung weiblicher Markerlinien kann ein genauerer Düngestatus analysiert werden.Zum Beispiel kann der Düngestatus nach der Gamete-Fusion und vor der Karyogamie beurteilt werden. Ja, der Düngeprozess ist in mehrere Schritte unterteilt. Die Fragen, an denen jeder Düngeregulator beteiligt ist, welche Schritte mit dieser verbesserten Methode beantwortet werden können.Es würde tiefere Einblicke in die sexuelle Reproduktion der Pflanze geben.

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Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Eine verbesserte Methode zur Messung von Pollenhydratationsprofilen in Arabidopsis thaliana wird hier beschrieben. Die neue Methode bietet eine höhere Auflösung, ist nicht-invasiv und sehr gut reproduzierbar. Das Protokoll stellt ein neues Werkzeug dar, um die Prozesse, die die frühen Stadien der Bestäubung regulieren, genauer zu analysieren.

Ein hochauflösender Einzelkorn-In-vivo-Pollenhydratations-Bioassay für Arabidopsis thaliana

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Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Die Chromosomenbewegung während der meiotischen Prophase ist ein wenig verstandenes Phänomen, das für die Sporenbildung von grundlegender Bedeutung ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erfassung, Analyse und Quantifizierung von Zentromerbewegungen während der meiotischen Prophase in männlichen Meiozyten von Arabidopsis thaliana .

Live-Imaging-Charakterisierung von Zentromerbewegungen während der männlichen meiotischen Prophase in Arabidopsis thaliana

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