Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung
29. August 2019
Wir zeigen eine Methode zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung auf Basis der Spermien-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppelbefruchtung mit einem Epifluoreszenzmikroskop.
Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, die Beteiligung eines bestimmten Faktors an der doppelten Befruchtung der Arabidopsis zu bewerten. Der Befruchtungsstatus kann anhand der Morphologie der Spermakerne auf einen Blick beurteilt werden, so dass die schnelle Erfassung der Daten für die statistische Auswertung möglich ist. Diese Methode ist spezifisch für die Bewertung für Befruchtung Phänotyp bei Arabidopsis.
Es gibt immer noch unbekannte Düngung Regulatoren, auch wenn in Arabidopsis. Diese Methode wäre nützlich für die funktionelle Analyse zukünftiger unbekannter Düngefaktoren. Um die Fähigkeit des schnellen und intakten Umgangs mit den Eizellen zu beherrschen, sind wichtige für den Erfolg dieser Analyse.
Zunächst wachsen Arabidopsis thaliana bei 22 Grad Celsius unter einem 16-stündigen Hellen und achtstündigen dunklen Zyklus in einer Wachstumskammer. Schneiden und entfernen Sie den ersten entwickelten Blütenstiel mit der Schere, um die Entwicklung von Achselknospen zu fördern. Messen Sie zwei bis drei Wochen nach dem Abschneiden des ersten Stiels die Pflanzenhöhe.
Pflanzen mit einer Höhe von mehr als 25 Zentimetern gelten als kräftig wachsende Pflanzen und eignen sich zur Analyse. Um zu entleeren, suchen Sie nach Knospen in Stufe 11 mit Flecken von Blütenblättern an der Spitze gesehen. Verwenden Sie eine Nummer fünf Zangen, um Sepal, Blütenblatt und Stamen von Blütenknospen zu entfernen.
15 bis 18 Stunden nach der Entschämung, nehmen Sie das Stamen einer DMP9-Knockdown-Linie mit Hintergrund der HTR10-mRFP-Blume in Stufe 13, indem Sie das Filament mit Zangen kneifen. Um zu bestäuben, klopfen Sie das Stigma eines entstickten Stempels mehrmals mit einem dehiscent Anther. Sieben bis acht Stunden nach der Bestäubung, sammeln Sie den Stempel und legen Sie ihn auf das doppelseitige Band.
Drücken Sie dann vorsichtig mit Zangen, um den Stempel auf dem Band zu fixieren. Schneiden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die oberen und unteren Enden des Eierstocks mit einer Injektionsnadel ab. Bewegen Sie die Spitze der Injektionsnadel, um die Eierstockwand auf beiden Seiten des Replum aufzuschlitzen.
Schneiden Sie sorgfältig, um den Funiculus und den Sendetrakt nicht zu trennen. Evert die Eierstockwand. Kneifen Sie die Basis des Septums, mit dem Dieovuls verbunden sind, und heben Sie sie vorsichtig mit Zangen an.
Übertragen Sie die Eizellen in einen Tropfen Wasser auf einem Gleitglas, und decken Sie vorsichtig mit einem Deckglas zur Beobachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop. Passen Sie die Objektivlinse auf ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Fluoreszenzfilterwürfel ausgestattet ist, auf 20x oder 40x. Erfassen Sie Bilder der Eizellen, die Spermienkerne enthalten, die mit mRFP gekennzeichnet sind.
Bestätigen Sie die Anzahl der mRFP-markierten Spermakerne in einem Embryosack. Bestätigen Sie die Form und Position jedes mRFP-markierten Spermakerns in einem Embryosack. In dieser Studie wurden Befruchtungsphänotypen durch Spermien-Kernsignalmorphologie in Ovule beurteilt.
Die meisten Eizellen enthielten zwei dekondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Eizelle mikropylar Seite und zentrale Zelle Charazal Ende Seite. Dies deutet auf eine erfolgreiche Doppeldüngung hin. Darüber hinaus wurden Ovule beobachtet, die einen dekondensierten mRFP-markierten Spermakern am zentralen Zellkern sowie einen kondensierten mRFP-markierten Spermakern außerhalb der Eizelle enthielten, was auf eine einzelne Befruchtung hindeutet.
Bei einer fehlgeschlagenen Doppelbefruchtung wurden zwei kondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Grenze der Eizelle und der Zentralzelle beobachtet. In der Analyse mit DMP9-Knockdown-Linie mit Hintergrund von HTR10-mRFP Pollen wurden selten Ovules beobachtet, die einen einzelnen kondensierten mRFP-markierten Spermakern oder drei oder mehr mRFP-markierte Spermakerne enthielten. In Kombination mit der Verwendung weiblicher Markerlinien kann ein genauerer Düngestatus analysiert werden.
Zum Beispiel kann der Düngestatus nach der Gamete-Fusion und vor der Karyogamie beurteilt werden. Ja, der Düngeprozess ist in mehrere Schritte unterteilt. Die Fragen, an denen jeder Düngeregulator beteiligt ist, welche Schritte mit dieser verbesserten Methode beantwortet werden können.
Es würde tiefere Einblicke in die sexuelle Reproduktion der Pflanze geben.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beurteilung des Befruchtungsstatus bei Arabidopsis durch die Untersuchung der Spermienkern-Morphologie. Es ermöglicht eine schnelle Datenerhebung für die statistische Analyse und unterstützt so die funktionelle Analyse unbekannter Befruchtungsfaktoren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- Reproduktionsbiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Die Doppelfertilisation ist ein entscheidender Prozess bei Blütenpflanzen.
- Das Verständnis der Befruchtungsmechanismen kann unbekannte Regulatoren aufdecken.
- Arabidopsis dient als Modellorganismus zur Untersuchung der Pflanzenfortpflanzung.
- Die Beurteilung der Spermakern-Morphologie kann Aufschluss über den Erfolg der Befruchtung geben.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Bestimmung des Befruchtungserfolgs bei Arabidopsis.
- Vereinfachung der Identifizierung unbekannter Befruchtungsregulatoren.
- Möglichkeit einer schnellen Datenerfassung für weitere Analysen.
Verwendete Methoden
- Epifluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Spermakernen.
- Beurteilung der Kernmorphologie zur Bestimmung des Befruchtungsstatus.
- Statistische Analyse der erhobenen Daten.
- Schulung in Techniken zum Umgang mit Samenanlagen für genaue Ergebnisse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung des Befruchtungsstatus anhand der Spermienmorphologie.
- Nachgewiesene Effizienz bei der Datenerhebung zur Analyse.
- Bereitstellung eines Rahmenwerks zur Untersuchung unbekannter Befruchtungsfaktoren.
- Herausstellung der Bedeutung des Umgangs mit Samenanlagen in der Methodik.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode eignet sich zur Beurteilung der Befruchtung bei Arabidopsis.
- Sie erschließt neue Möglichkeiten, unbekannte Regulatoren der Befruchtung zu untersuchen.
- Zukünftige Studien können auf diesem Protokoll für funktionelle Analysen aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Bewertung des Befruchtungszustands bei Arabidopsis über die Spermien-Kernmorphologie ermöglicht eine schnelle, quantitative Auswertung zur Funktionsanalyse von Befruchtungsregulatoren. Dieser Ansatz erlaubt ein Hochdurchsatz-Phänotypisierungsscreening und eine statistische Beurteilung von Kandidatengenen oder Faktoren, die an der Doppelbefruchtung beteiligt sind. Die Methode unterstützt die frühe Entdeckung und die mechanistische Risikominimierung im Schnittfeld der pflanzlichen Fortpflanzungsbiologie und der Merkmalstechnologie.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte phänotypische Untersuchung von Kandidaten-Regulatoren der Befruchtung in vivo.
- Erlaubt die mechanistische Risikominimierung durch Unterscheidung erfolgreicher, teilweiser und fehlgeschlagener Befruchtungsereignisse.
- Erleichtert die schnelle Vorselektion genetischer oder chemischer Störungen, die die Doppelfruchtung beeinflussen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht einen standardisierten, fluoreszenzbasierten Assay zur Quantifizierung von Befruchtungsergebnissen.
- Liefert reproduzierbare, bildbasierte Endpunkte, die für die statistische Analyse und den Vergleich zwischen Studien geeignet sind.
- Ermöglicht die skalierbare Untersuchung von mutierten oder transgenen Linien hinsichtlich Befruchtungsphänotypen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Verknüpfung molekularer Eingriffe mit reproduktiven Ergebnissen in einem Modellsystem und unterstützt damit translationsorientierte Zielsetzungen.
- Unterstützt die kontinuierliche Übertragung von Entdeckungen bis zur präklinischen Validierung von Zielen, die mit der Befruchtung in Zusammenhang stehen.
- Bietet bei entsprechender Anpassung einen prädiktiven Wert für Strategien zur Verbesserung von Merkmalen in der Pflanzenbiotechnologie.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Kontinuum von der Entdeckung bis zur Validierung für die Entwicklung pflanzlicher Fortpflanzungsmerkmale und die funktionelle Genomik.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung von Fertilisationsregulatoren und Bestandteilen von Signalwegen.
- Screening: Bietet quantitative, reproduzierbare Messgrößen für die Assay-Entwicklung und die Mutantenanalyse.
- Analytik: Unterstützt den statistischen Vergleich von Fertilisationsphänotypen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit der präklinischen Merkmalsvalidierung in Modellsystemen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die kontinuierliche funktionelle Analyse neuartiger Fertilisationsfaktoren.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung und verringert die Uneindeutigkeit bezüglich Befruchtungsmechanismen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die phänotypische Beurteilung und ermöglicht eine schnelle, skalierbare Datenerhebung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Go/No-Go-Entscheidungen für Kandidaten-Regulatoren und optimiert die Ressourcenallokation.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung genetischer oder chemischer Interventionen in Pipelines der Fortpflanzungsbiologie.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Fachkenntnisse im Umgang mit Arabidopsis und in der Fluoreszenzmikroskopie.
- Setzt Zugang zu Epifluoreszenz-Aufnahmesystemen und Infrastruktur zur Bildanalyse voraus.
- Erfordert standardisierte Protokolle zur Dissektion von Samenanlagen und zur Probenvorbereitung.
- Kann eine Anpassung für die Verwendung an anderen Pflanzenarten oder Modellsystemen erfordern.
- Hängt von der Verfügbarkeit fluoreszierender Markerlinien zur Markierung der Spermakern ab.
