Name: Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Erfahren Sie die duale DNA-Lineal-Methode zur Untersuchung von Ribosomentranslokation mit Einzelnukleotid-Auflösung. Diese Technik ermöglicht präzise Einblicke in mRNA-Dynamik und Nukleinsäure-Interaktionen.

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Diese Arbeit wird von den US National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.) unterstützt. Y. W. würdigt die Unterstützung durch die Welch-Stiftung (E-1721).

1. Vorbereitung der Ribosom-Komplexe
<ol><li>Machen Sie 1.000 ml TAM10 Puffer, der aus 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-Mercaptoethanol) und 0,05% Tween20 besteht.</li>
	<li>Bereiten Sie die fünf in Tabelle 1aufgeführten Mischungen vor. HINWEIS: Das Ribosom stammt e.b. vom MRE600-Stamm11. EF-Tu: Dehnungsfaktor thermo instabil. EF-Ts: Dehnungsfaktor thermostabil. GTP: Guanosintriphosphat. PEP: Phospho(enol)pyruvat.</li>
	<li>Die fünf Mischungen bei 37 °C für 25 min separat inkubieren, bevor die Ribosom-Komplexe entstehen. Bereiten Sie die fünf Ribosom-Komplexe gemäß Tabelle 2vor. HINWEIS: Post: Post-Translocation; Pre: Vortranslokation.</li>
	<li>Fügen Sie jeden der fünf Ribosom-Komplexe separat auf ein 1,1 M Saccharosekissen mit einem Volumenverhältnis von 1:1 ein. Reinigen Sie jeweils mit 450.000 g für 2 h in einer Ultrazentrifuge. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen und die Ribosom-Komplexe bei -80 °C nach Wiederaufhängung des Pellets mit TAM10-Puffer wiederherzustellen.</li>
</ol>2. Herstellung von biotinbeschichteten Glasgletten
<ol><li>Vorreinigung der Glasrutschen<ol>
<li>Legen Sie 12 Glasschieber mit den Abmessungen 60,0 x 4,0 x 0,3 mm3 (L x W x T) in eine kurze und breite Glasschale.</li>
		<li>Füllen Sie die Glasschale mit Aceton und beschallen Sie für 5 min. Dann waschen Sie die Rutschen mit Reinstwasser 5 Mal und füllen Sie 3/4 der Schale mit Wasser.</li>
		<li>Fügen Sie 10 M KOH hinzu, um die Schale zu füllen und die Glasgletten für 20 min zu beschallen. Waschen Sie die Dias 5 Mal mit Wasser.</li>
		<li>Ethanol hinzufügen und 5 min beschallen, das Ethanol ausgießen und dann bei 300 °C für 3 h separat trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aminosilan-Beschichtung<ol>
<li>Die 12 gereinigten Rutschen wieder in die Glasschale mit Methanol legen. Reinigen Sie einen PEGylationskolben mit Methanol, indem Sie ihn 5 min beschallen, dann mit 25 ml Methanol, 1,25 ml Wasser, 0,125 ml HAc, 0,25 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan (AMEO) füllen.</li>
		<li>Ersetzen Sie das Methanol in der Glasschale sofort durch die vorbereitete AMEO-Lösung. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.</li>
		<li>Spülen Sie die Rutschen mehrmals mit Wasser ab und trocknen Sie sie dann durch Stickstoffspülung. Legen Sie die getrockneten Dias in saubere Glasschalen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PEGlation<ol>
<li>Bereiten Sie NaHCO3 Lösung (8,4 mg/ml) und PEGylationspuffer (37,5 mg PEG, 6 mg biotinylierte PEG, 150 l NaHCO3 Lösung). Mischen Sie sie gut, indem Sie bei 6.000 U/min für 1 min drehen.</li>
		<li>Legen Sie 25 L der PEG-Lösung auf jeden Schlitten. Bedecken Sie es mit der anderen Folie oben. Stellen Sie sicher, dass sich zwischen den beiden Folien keine Blasen befinden.  Platzieren Sie die Dias in einem leeren Pipetten-Spitzenkasten. Stellen Sie sicher, dass die Box nivelliert ist und legen Sie sie in eine dunkle Schublade für ca. 3 h.</li>
		<li>Spülen Sie die Rutschen mit Wasser und trocknen Sie wieder. Bewahren Sie die getrockneten Dias bei Raumtemperatur unter Vakuum bis zu 2 Wochen auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Probenvorbereitung vor Magnet- und Kraftmessungen
<ol><li>Maschine eine Kunststoffprobe gut mit den Abmessungen 4 x 3 x 2 mm3 (L x W x D). Mit Epoxid kleben Sie ein Stück biotinbeschichtetes Glas (ca. 5 mm lang, aus den 60 mm langen Dias in Abschnitt 2) auf die Bodenoberfläche schneiden.</li>
	<li>Fügen Sie 20 l 0,25 mg/ml Streptavidin wässrige Lösung gut in die Probe geben und bei Raumtemperatur für 40 min inkubieren. Dann spülen Sie die Probe gut zweimal mit TAM10 Puffer.</li>
	<li>Immobilisieren Sie die Ribosom-Komplexe.<ol>
<li>Ohne Antibiotika: Verwenden Sie eine Pipette, um Puffer aus der Probe gut zu entfernen, und fügen Sie dann 20 L von 0,1 M Ribosom-Komplex (MF-Pre oder MF-Post) in die Probe gut. Der Ribosom-Komplex bindet mit dem Streptavidin an der Oberfläche über das 5'-Ende-Biotin auf der mRNA. Bei 37 °C für 1 h inkubieren und dann einmal mit TAM10 Puffer ausspülen.</li>
		<li>Für das Experiment mit Neomycin und Fusidinsäure: inkubieren Sie den MF-Pre-Komplex mit Neomycin bei 37 °C für 10 min; EF-G mit Fusidinsäure bei 37 °C für 20 min inkubieren. Die Konzentrationen sind wie folgt: 0,1 m Ribosom-Komplex, 2 M EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/ml Pyruvatkinase, 0,2 mM Neomycin und 0,25 mM Fusidinsäure.</li>
		<li>Führen Sie die anderen Antibiotika-Experimente ähnlich durch. Die Konzentrationen sind wie folgt: 0,2 mM Viomycin, 0,4 mM Hygromycin B und 0,25 mM Fusidinsäure.</li>
		<li>Für Frameshifting-Studie, wiederholen Sie die oben genannten Schritte für die MFNF-Pre und MFNF-Post-Komplexe mit dem rutschigen Motiv U6A. Verwenden Sie Antibiotika Fusidinsäure plus Neomycin, und Fusidinsäure jeweils</li>
	</ol>
</li>
	<li>Puffer aus der Probe gut entfernen, dann 20 L von 1 'M biotinylierten DNA-Strang hinzufügen und bei Raumtemperatur über Nacht inkubieren. Spülen Sie das gebildete DNA-mRNA-Duplex einmal mit TAM10 Puffer.</li>
	<li>Entfernen Sie den Puffer aus dem Sample-Brunnen. Dann 20 l von 0,5 mg/ml streptavidin-beschichteten Magnetperlen gut in die Probe geben und bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren.</li>
	<li>Die Probe vorsichtig gut in einen Halter einlegen und in eine Zentrifuge legen. Entfernen Sie die freien magnetischen Partikel von der Oberfläche durch Zentrifugieren bei 84 x g für 5 min.</li>
</ol>4. Magnet- und Kraftmessungen
<ol><li>Einschalten des Lasers<ol>
<li>Schalten Sie den Laser mit der Taste ein. Drücken Sie dann die Ein-/Aus-Taste.</li>
		<li>Stellen Sie die Empfindlichkeit des Einsperrverstärkers 1 (LIA1) auf 500 mV ein und warten Sie etwa 2 h, um das Atommagnetometer aufzuwärmen und zu stabilisieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Einrichten des Atommagnetometers<ol>
<li>Führen Sie die Gerätesteuerungssoftware aus und richten Sie die Messparameter ein. Einige Parameter können in jeder Messung leicht variieren. ANMERKUNG: Das Atommagnetometer besteht aus einem Laser (siehe oben), einem SR830-Sperrverstärker (als LIA1), einem SR530-Sperrverstärker (als LIA2 bezeichnet), DS345 (bezeichnet als FG1) und ATF20B (als FG2 bezeichnet), Motor und einem Computer. All diese Sollten in diesem Schritt des Protokolls aktiviert werden.</li>
		<li>Richten Sie den Motorbewegungsmodus auf Rauschen und die Standardposition auf 0ein. Drücken Sie Lock auf der Frontplatte, stellen Sie die Empfindlichkeit von LIA1 wieder auf 200 mV ein.</li>
		<li>Stellen Sie strom und spannungsfrei den Laser ein und finden Sie die richtige Resonanzspitze und den Signal-Rausch-Pegel. Drücken Sie Sweep auf der Frontplatte. Beachten Sie, dass das Amplituden-Breite-Verhältnis über 0,5 und der Phasenwert kleiner als 5 Grad sein sollte. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie den Sweep-Schritt.</li>
		<li>Schließen Sie den Ausgang von LIA2 an das Feedback des Lasers an, um seine Frequenz zu sperren. Dieser Verstärker misst die optische Rotation einer Hilfs-Cäsiumzelle, um die Laserfrequenz auf Resonanz12beizubehalten. Der Zustand bleibt bis zum Ende der Messung.</li>
		<li>Plug-in-Funktionsgenerator FG2 zur Eingabe einer Rechteckwelle (500 mVpp, 100 mHz) als Referenzsignal. Die rechteckige Welle entspricht 100 pT und wird verwendet, um den Stromausgang des Verstärkers in magnetisches Signal umzuwandeln. Trennen Sie den Funktionsgenerator.</li>
		<li>Richten Sie den Motorbewegungsmodus auf Zwei-Wege- und Standardposition auf 260 mm ein. Überprüfen Sie den Status des Temperaturreglers, um die richtige Temperatur (ca. 37 °C) des Atomsensors zu gewährleisten.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Stabilität des gesamten Systems, indem Sie die Signale des leeren Probenhalters zweimal messen. Bewerten Sie Stabilität und Geräuschpegel, nachdem Sie die beiden Spuren subtrahiert haben. Typischer Geräuschpegel und Fluktuation sollten bei 30 ms Integrationszeit 2 pT betragen.</li>
	</ol></li>
	<li>Magnetisierung der Probe<ol>
<li>Legen Sie die Probe vorsichtig auf die Magnetisierungsstation und lassen Sie sie 2 min bleiben. HINWEIS: Die Magnetisierungsstation besteht aus einem Permanentmagneten (0,5 T) und einem Kunststoffabstandhalter.</li>
		<li>Legen Sie die Probe wieder in den Probenhalter. Verwenden Sie 335,4 g Zentrifugalkraft, um die nicht spezifisch gebundenen magnetischen Partikel zu entfernen. </li>
	</ol></li>
	<li>Magnetische Messungen nach Demanwendung von Kräften<ol>
<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um die Probe auf den Motor zu laden. Klicken Sie auf der Vorderseite auf Sperren, um das Programm auszuführen. In der Zwischenzeit verwenden Pinzette, um die andere Probe in den Halter zu laden und legen Sie es in der Zentrifuge. Beachten Sie, dass die beschichtete Glasseite der Mitte der Zentrifuge gegenüberstehen sollte. HINWEIS: Es wird die Technik der kraftinduzierten Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS) verwendet, die ein atomares Magnetometer verwendet, um das magnetische Signal der Probe zu messen, nachdem mechanische Kraft auf die molekularen Wechselwirkungen in der Probe angewendet wurde. Hier liegen die molekularen Wechselwirkungen zwischen den DNA-Linealmolekülen und der mRNA im Ribosom-Komplex. Die Kraft wird schrittweise erhöht, indem die Fliehkrafterhöht wird. Nach dem Anwenden jeder Kraft übersetzt der Motor die Probe in den Atomsensor und bewegt sich dann zurück. Somit werden zwei Magnetfeldprofile erhalten, eines während des Vorwärtsscans und das andere beim Rückwärtsscan13. Letzteres verwenden wir nur, um die Spitzenhöhe aufgrund seines besseren Signal-Rausch-Verhältnisses zu extrahieren. Die Spitzenhöhe im Strom (nA) wird basierend auf der Kalibrierquadratwelle in magnetische Signalamplitude (pT) umgewandelt.</li>
		<li>Jede Messung dauert ca. 5 min. Wenn der Motor auf 0 zurückkommt, klicken Sie auf der Vorderseite auf Speichern. Verwenden Sie sorgfältig Pinzette, um Proben von Motor und Zentrifuge zu nehmen. Verwenden Sie die Anfangsgeschwindigkeit von 335,4 g (2000 U/min, Umdrehung pro Minute für die zentrifuge, die in der Materialtabelleaufgeführt ist).</li>
		<li>Tauschen Sie die beiden Proben aus und wenden Sie eine stärkere Kraft an, indem Sie die Zentrifugalgeschwindigkeit um 100 U/min oder eine ähnliche Schrittgröße erhöhen. Prozess abwechselnd, um die Kraft schrittweise zu erhöhen; nach 10-12 Datenpunkten wird ein komplettes Kraftspektrum erreicht.</li>
	</ol></li>
	<li>Abschließen des Experiments<ol>
<li>Wenn alle geplanten Experimente abgeschlossen sind, schalten Sie die Ausrüstung aus und gehen Sie in umgekehrter Reihenfolge vor, als sie eingeschaltet wurde.</li>
		<li>Entfernen Sie die Proben aus dem Halter und tauchen Sie sie zur Reinigung und zukünftigen Verwendung in Ethanol ein. Reinigen Sie den Probenhalter bei magnetischer Perlenkontamination mit Aceton.</li>
	</ol></li>
	<li>Datenanalyse<ol>
<li>Öffnen Sie das Python-Analyseskript, und geben Sie alle experimentellen Daten ein. Klicken Sie auf Quadrat laden, um die Rechteckwelle als Referenz einzugeben. Klicken Sie dann auf Basislinie laden, um ein magnetisches Restsignal als Hintergrund einzugeben.</li>
		<li>Definieren Sie die allgemeine magnetische Signalabnahme als B0. Normalisieren Sie jede magnetische Signalabnahme B bis B0 und drücken Sie sie als Prozentsatz aus. Plotten Sie den Prozentsatz (B/B0) im Vergleich zu der Zentrifugalkraft, um das FIRMS-Spektrum zu erhalten. ANMERKUNG: Die Zentrifugalkraft F wird aus der Schwimmmasse der Magnetperlen m (4,6 x 10x 15 kg), der Zentrifugalgeschwindigkeit w und dem Radius der Zentrifuge r (7,5 cm hier) über Gleichung F = mw 2 r. Die typische Kraftauflösung beträgt 2-4 pN und der Kraftbereich beträgt 15-95 pN in dieser Arbeit.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Autoren berichteten über keinen möglichen Interessenkonflikt.

In unserem Doppelherrscher-Assay spielen die magnetischen Perlen zwei wesentliche Rollen. Erstens dienen sie als Kraftgeber, weil die Fliehkraft proportional zu ihrer Auftriebsmasse ist. Zweitens sind die Perlen Signalträger, die von einem Atommagnetometer erfasst werden, das derzeit der genaueste Magnetsensor ist. Durch die Kombination von mechanischer Manipulation und magnetischer Detektion ist die FIRMS-Technik in der Lage, eine große Anzahl molekularer Wechselwirkungen auf der Grundlage ihrer kritischen Dissoziations...

Biomolekulare Verschiebung ist ein grundlegender Parameter bei der Untersuchung des Mechanismus der zugehörigen biologischen Funktionen. Ein besonderes Beispiel ist die Ribosomtranslokation1,2, bei der sich das Ribosom normalerweise um genau drei Nukleotide (nt) auf der Boten-RNA (mRNA) bewegt, und um eine, zwei oder andere Nt-Zahlen außer drei im Falle von Frameshifting. Daher ist eine einstellige Auflösung des molekularen Linealsystems erforderlich, um die verschiedenen Schrittgrößen zu unterscheiden. Eine größere Herausforderung besteht darin, die Ribosombewegung sowohl auf der Ein- als auch auf der Ausgangsseite zu untersuchen. Mit anderen Worten, nur mit einem Dual-Lineal-System können wir zeigen, ob die mRNA glatt durch das Ribosom gefädelt ist, oder es gibt Zwischenschritte, in denen die beiden Seiten unterschiedliche Schrittgrößen haben, die zu einer geknickten oder geschleiften mRNA-Konformation im Inneren des Ribosom.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die erste Herausforderung der Lösung verschiedener Schritte auf der Austrittsseite des Ribosoms (das 3' Ende der mRNA) zu bewältigen. Der duale Luziferase-Assay löst die verschiedenen Leserahmen auf, indem er die Verhältnisse der resultierenden verschiedenen Proteine3,4misst. Sie gilt nur für das 3' Ende der mRNA und reicht daher nicht aus, um ein vollständiges Bild der Translokation zu liefern. Die Massenspektrometrie kann die verschiedenen Peptidfragmente als Folge der entsprechenden Codeumlagerungen analysieren5. Aber es kann nicht genau bestimmen, wie viele nt das Ribosom auf der mRNA bewegt. Der Zehendruck-Assay ist eine weitere gängige Methode, die eine Reverse-Transkriptase verwendet, die am 3'-distalen Ende grundiert ist, um die mRNA in Richtung des Ribosoms6zu transkribieren. Es gilt jedoch nicht für das 5' Ende von mRNA, das in das Ribosom eintritt. Andere Techniken, einschließlich Einzelmolekülansätze und Fluoreszenzmethoden7, sind schwierig, eine Single-nt-Auflösung zu erreichen.
Wir haben den Dual-DNA-Lineal-Assay entwickelt, der sowohl die Ein- als auch die Ausgangsposition der freigelegten mRNA in Ribosome-mRNA-Komplexen eindeutig bestimmen kann.  Die Lineal-DNAs sind DNA-Oligomere, die Duplexe einer bestimmten Anzahl von Basepairs (bp) bilden, wobei die mRNA vom Ribosom aufgedeckt wird, unabhängig davon, welches Ende der mRNA. Die bp-Zahlen zeigen dann genau die ribosomische Position auf der mRNA während der Translokation. Die bp-Nummern der Duplexe werden durch ihre kritischen Dissoziationskräfte bestimmt, die aus der kraftinduzierten Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS)8gewonnen werden. Bei 2-3 pN-Kraftunsicherheit reichen die kritischen Kräfte aus, um eine Single-nt-Auflösung zu bieten. Durch die Implementierung eines Linkermoleküls auf den DNA-Linealen kann die sterisch behinderte Seite der mRNA durch das Ribosom untersucht werden. So lassen sich unterschiedliche ribosomale Verschiebungen genau auflösen. Wir haben erfolgreich eine einzigartige Schleifenkonformation von mRNA aufgedeckt, die von Antibiotika während der Translokation9eingeschlossen wurde, und verschiedene Leserahmen aufgelöst, die auf einer rutschigen mRNA-Sequenz10koexistierten. Dieser Artikel beschreibt die Details des Dual-Lineals-Assays, zu denen die Vorbereitung der Ribosom-Komplexe, die Oberflächenfunktionalisierung der Glasgeuken, die Immobilisierung der Ribosom-Komplexe und deren Hybridisierung mit magnetisch beschrifteten DNA-Linealen gehören. Moleküle, magnetische Detektion und Kraftspektrumanalyse durch FIRMS.

<table><tbody><tr><td>Styrolstreifen</td><td>Stadt der Industrie</td><td>MS-861</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Bedampfte Beschichtungen</td><td></td><td>60,0 & mal 4,0 & mal 0,3 mm3</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilan</td><td>UCT Spezialitäten</td><td>21400088</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>154-82</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>152-84</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Epoxidkleber</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>Fusidinsäure</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0756-1G</td><td></td></tr><tr><td>Neomycinsulfat</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>1458009</tr><tr><td>Viomycinsulfat</td><td>Millipore Sigma</td><td>1715000</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetat</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9434-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kalium chlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GIBCO</td><td>774750</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M6250-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-250ML</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8877-100MG</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvatkinase</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1506-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7903-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>mRNA Oligo</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>133899727</td><td>5&prime;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU UUA UGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3& prime; &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>157468630</td><td>3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>164845370</td><td>3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA-Oligo</td><td>Integrierte</td><td>DNA-Technologien 157468628</td><td>3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>163472705</td><td>3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA-Oligo-integrierte</td><td></td><td>DNA-Technologien 138678130</td><td>3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5'</td></tr><tr><td>DNA-Oligo-integrierte</td><td></td><td>DNA-Technologien 138678131</td><td>3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA-Oligo</td><td>Integrierte</td><td>DNA-Technologien 138678132</td><td>3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA-Oligo-integrierte</td><td></td><td>DNA-Technologien 138678133</td><td>3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Micro Ultrazentrifuge</td><td>Hitachi</td><td>CS150FNX</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>VWR</td><td>VM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Lock-in-Verstärker</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>Lock-in-Verstärker</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR830</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Newport</td><td>TLB-6918-D</td><td></td></tr><tr><td>Funktionsgenerator</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DS345</td><td></td></tr><tr><td>Photodetektoren</td><td>Thorlabs</td><td>DET36A</td><td></td></tr></tbody></table>

dual dna lineale zur untersuchung des mechanismus der ribosomentranslokation mit single-nukleotid-auflösung

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Die Ribosomentranslokation bezieht sich auf die ribosomale Bewegung auf der mRNA durch genau drei Nukleotide (nt), was der zentrale Schritt in der Proteinsynthese ist. Um seinen Mechanismus zu untersuchen, gibt es zwei wesentliche technische Anforderungen. Die erste ist die Single-nt-Auflösung, die die normale Translokation von Frameshifting auflösen kann, während der sich das Ribosom um andere als 3 nt bewegt. Die zweite ist die Fähigkeit, sowohl die Ein- als auch die Ausgangsseite von mRNA zu untersuchen, um das gesamtbildende Translokation zu erläutern. Wir berichten über den dualen DNA-Lineal-Assay, der auf den kritischen Dissoziationskräften von DNA-mRNA-Duplexen basiert, die durch kraftinduzierte Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS) gewonnen werden.  Mit einer Kraftauflösung von 2-4 pN reicht der Dual-Lineal-Assay aus, um verschiedene Translokationsschritte zu unterscheiden. Durch die Implementierung eines langen Linkers auf den prüfenden DNAs können sie die mRNA auf der gegenüberliegenden Seite des Ribosoms erreichen, so dass die mRNA-Position für beide Seiten bestimmt werden kann. Daher ist der Dual-Lineal-Assay einzigartig geeignet, um die ribosomsome Translokation und Nukleinsäurebewegung im Allgemeinen zu untersuchen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse, die auf eine geschleifte mRNA-Konformation hindeuteten und die normale Translokation von Frameshifting auflösten.

Abbildung 1 zeigt das Erkennungsschema und die Fotos der hauptwichtigsten Komponenten. Die magnetische Detektion wird durch ein atomares Magnetometer mit dem Scanschema erreicht (Abbildung 1A)13. Die Probe wird auf einer Stange platziert, die auf einem Linearmotor montiert ist. Der Motor transportiert die Probe zum Atomsensor innerhalb eines magnetischen Schildes und dann zurück zum ursprünglichen Ort zum Entladen. Das At...

Dual DNA Lineal Assay wird entwickelt, um die mRNA-Position während der ribosomen Translokation zu bestimmen, die auf den Dissoziationskräften der gebildeten DNA-mRNA-Duplexe beruht. Mit einer Single-Nukleotid-Auflösung und der Fähigkeit, beide Enden der mRNA zu erreichen, kann es mechanistische Einblicke für ribosome translokation liefern und andere Nukleinsäureverschiebungen untersuchen.

Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Der Dual-DNA-Lineal-Assay kann mechanistische Erkenntnisse für ribosometranslokation liefern und andere Nukleinsäureverschiebungen untersuchen. Unser Dual-DNA-Lineal-Assay ist derzeit die einzige Methode, die sowohl die Ein- als auch die Ausgangsseite von mRNA in den Ribosom-Komplexen mit Single-Nukleotid-Auflösung objektiv untersuchen kann. Ähnliche Methoden werden auch angewendet, um die DNA-Bindungsfestigkeit und Selektivität von chemotherapeutischen Medikamenten zu messen.Die visuelle Demonstration der Methode ist eine gute Chance für uns, die Vorteile unserer Technik intuitiv aufzuzeigen und anderen Forschern zu helfen, sie zu weiteren Anwendungen zu entwickeln. Zunächst eine Kunststoffprobe mit einem Styrolstreifen gut zu machen, indem Sie einen Würfel in der Mitte mit Abmessungen von vier Millimetern mal drei Millimetern mal zwei Millimeterbohren bohren. Dann, mit Epoxid, kleben Sie ein Stück biotinbeschichtetes Glas, von etwa fünf Millimetern lang, auf die untere Oberfläche.20 Mikroliter 0,25 Milligramm pro Milliliter Streptavidin-Wässerlösung in die Probe geben und 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann spülen Sie die Probe zweimal mit TAM10-Puffer gut ab. Um die R

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Optische Pinzetten wurden verwendet, um die RNA-Faltung zu untersuchen, indem einzelne Moleküle von ihren 5'- und 3'-Enden gedehnt wurden. Hier werden gängige Verfahren zur Synthese von RNA-Molekülen für die Pinzette, zur Kalibrierung des Instruments und Methoden zur Manipulation einzelner Moleküle beschrieben.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

Purine gehören zu den am häufigsten vorkommenden nicht-kanonischen Nukleotiden während Eukaryotische nukleare DNA-Replikation in das Genom integriert. Wenn nicht richtig entfernt, verursachen Purine DNA-Schäden und Mutagenese. Hier präsentieren wir Ihnen zwei experimentelle Ansätze, die verwendet werden, um die Fülle der Ribonukleotidreduktase Einbindung in DNA und seine mutagenen Wirkungen zu beurteilen.

Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

Die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wird verwendet, um die räumlichen Positionen und Bewegungsbahnen fluoreszierend markierter Proteine in lebenden Bakterienzellen zu untersuchen. Das hier beschriebene experimentelle und Datenanalyseprotokoll bestimmt das vorherrschende diffusive Verhalten von zytosolischen Proteinen auf der Grundlage gepoolter Einzelmolekülbahnen.

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Hier wird eine Nanosphärenlithographiemethode zur parallelen Herstellung von Nullmoduswellenleitern beschrieben, bei denen es sich um Arrays von Nanoaperturen in einem metallbeschichteten Glasmikroskopie-Coverlip für die Einzelmolekülbildgebung bei nano- bis mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren handelt. Die Methode nutzt die Kolloidalkristall-Selbstorganisation, um eine Hohlleiterschablone zu erstellen.

Herstellung von Zero Mode Waveguides für die hochkonzentrierte Einzelmolekülmikroskopie

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Dieses Protokoll stellt einen vollständigen experimentellen Workflow für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen mit optischen Pinzetten dar. Mehrere mögliche Versuchsanordnungen werden skizziert, einschließlich der Kombination von optischen Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energietransfer ist eine Methode, die die tRNA-Dynamik während der ribosomalen Proteinsynthese verfolgt. Durch die Verfolgung einzelner Ribosomen werden inhomogene Populationen identifiziert, die Aufschluss über Mechanismen geben. Diese Methode kann verwendet werden, um biologische Konformationsänderungen im Allgemeinen zu verfolgen, um dynamische Funktionsbeziehungen in vielen anderen komplexen Biosystemen aufzudecken. Einzelmolekülmethoden können...

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

Übersetzende Ribosomen dekodieren drei Nukleotide pro Codon in Peptide. Ihre Bewegung entlang der mRNA, die durch Ribosomenprofilierung erfasst wird, erzeugt die Fußabdrücke, die eine charakteristische Triplettperiodizität aufweisen. Dieses Protokoll beschreibt, wie RiboCode verwendet werden kann, um dieses herausragende Merkmal aus Ribosom-Profiling-Daten zu entschlüsseln, um aktiv übersetzte offene Leserahmen auf der Ebene des gesamten Transkriptoms zu identifizieren.

De novo Identifizierung von aktiv übersetzten offenen Leserahmen mit Ribosom-Profiling-Daten

Das Protokoll beschreibt die SNP-FISH-Methode (Single Nucleotide Polymorphisms) zur Unterscheidung ribosomaler RNA-Transkripte, die vom ribosomalen DNA-Locus des X- oder Y-Chromosoms in Drosophila melanogaster abgeleitet sind.

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

Erfahren Sie die duale DNA-Lineal-Methode zur Untersuchung von Ribosomentranslokation mit Einzelnukleotid-Auflösung. Diese Technik ermöglicht präzise Einblicke in mRNA-Dynamik und Nukleinsäure-Interaktionen.

Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung

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