Messung der relativen Insulinsekretion mit einem co-secreted Luciferase Surrogate

Dieses Protokoll beschreibt einen alternativen schnellen Ansatz für die Untersuchung der Insulinsekretion aus Beta-Zelllinien, um die Entdeckung und Charakterisierung von Arzneimitteln zu beschleunigen. Dieser Ansatz ist nützlich, da mehrere Behandlungen gleichzeitig getestet werden können, die Ergebnisse sind unmittelbar nach dem Experiment verfügbar, und dieser Test ist erschwinglicher als andere. Die Anwendung dieser Methode auf das Screening auf neue kleine Molekülmodulatoren der Insulinsekretion kann Bleiverbindungen für zukünftige Diabetes-Therapien identifizieren.

Erhöhte Kenntnisse der Beta-Zell-Funktion kann zu einem besseren Verständnis von Protein oder Neurotransmitter Sekretion im Allgemeinen beitragen. Dieser Insulinsekretionsreporter wurde gegründet, um in einem lentiviralen System in anderen Beta-Zellen Linien und in menschlichen Inseln zu arbeiten. Dieser Test sollte für Personen, die mit der Zellkultur und dem Betrieb von Mehrkanalpipetten vertraut sind, sehr einfach sein.

Bevor Sie Experimente planen, stellen Sie sicher, dass Ihre elterlichen oder stabilen Beta-Zelllinien mit einem Insulin-ELISA richtig auf Glukose reagieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung Krebs-Ringer BicarbonatPuffer oder KRBH und Gaußier luziferase Arbeitslösung nach den Manuskriptrichtungen. Wachsen Sie MIN6-Zellen in T75-Flaschen mit Standard-Zellkulturtechniken.

Bereiten Sie die InsGLuc MIN6-Zellen für die Beschichtung vor, indem Sie einen konfluenten Kolben von Zellen zweimal mit PBS waschen und zwei Milliliter Trypsin hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für etwa fünf Minuten, oder bis die Zellen sich vom Kolben lösen. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und verdünnen Sie die Zellen in vollständigen Medien auf eine Million Zellen pro Milliliter, was 100.000 Zellen pro 100 Mikroliter in jedem Brunnen einer 96-Well-Platte entspricht.

Die Zellen sollten für den Test nach drei bis vier Tagen ausreichend konfluent sein. Am Tag des Assays genügend glukosefreie KRBH für das Experiment vorbereiten und ein Reservoir einrichten. Dekantieren Sie das Medium von der 96-Well-Platte, indem Sie es schnell über eine Laborspüle umkehren und dann fest auf einem Stapel Papiertücher bättieren, um überschüssiges Medium zu entfernen.

Waschen Sie den Teller zweimal mit 100 Mikroliter glukosefreien KRBH pro Brunnen, und wenn Sie medikamentöse Behandlungen durchführen, fügen Sie dem KRBH Medikamente gemäß den Manuskriptanweisungen hinzu. Dann fügen Sie 100 Mikroliter glukosefreie KRBH zu jedem Brunnen und inkubieren bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Nach der Inkubation den Puffer dekantieren und die Platte auf ein Papiertuch bauchen.

Fügen Sie 100 Mikroliter glukosefreies KRBH pro Brunnen hinzu, um angesammelten Hintergrund wegzuwaschen und dann die Platte zu dekantieren. Fügen Sie Kontroll- und Stimulierende Bedingungen mit oder ohne medikamentöse Behandlungen bei 100 Mikroliter pro Brunnen hinzu und bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Es ist wichtig, basale und stimulierte Kontrollen auf jeder Platte einzubeziehen, um die Reaktionsfähigkeit der Zellen in einem bestimmten Experiment zu bestimmen.

Wenn die Zellen im Laufe der Zeit ihre Reaktion verloren haben, rekulturieren Sie sie aus einem frischen flüssigen Stickstoffbestand. Sammeln Sie vorsichtig 50 Mikroliter Überstand mit einer Mehrkanalpipette, übertragen Sie es auf eine undurchsichtige weiße 96 Well-Assay-Platte, und halten Sie die Probe bei Raumtemperatur auf der Bank, bis sie für den Luziferase-Assay bereit ist. Bereiten Sie die Gaussia luciferase assay Arbeitslösung vor, indem Sie die erforderliche Menge an CTZ-Lösung in den GLuc-Assaypuffer einleiten und darauf achten, dass sich die CTZ nicht erwärmt.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die GLuc-Assay-Arbeitslösung mit den KRBH-Überwasserteinen schnell in die Platte einzutragen. Wenn es Tröpfchen an den Seiten der Brunnen gibt, drehen Sie die Platte kurz in einer Tischplatte, schwingen Eimer Zentrifuge. Dann legen Sie die Platte in den Plattenleser und lesen Sie die Lumineszenz mit einer 0,1 Sekunden Integrationszeit.

Dieser Test wurde unter Kontrollbedingungen getestet, indem die Insulinsekretion als Reaktion auf die Erhöhung der Glukosekonzentrationen gemessen wurde. Sehr wenig sekretore Aktivität wird unter fünf Millimolar Glukose beobachtet, und erhöhte Sekretion wird über acht Millimolar beobachtet. Die Zellen zeigen die erwartete sekretore Reaktion, wenn sie mit dem Diazoxid-Paradigma herausgefordert werden.

Die Diazoxid-Behandlung blockiert die Insulinsekretion, wenn kein extrazelluläres Kaliumchlorid vorhanden ist. Wenn Kaliumchlorid vorhanden ist, kann die Sekretion mit weiterer Zugabe von Glukose verstärkt werden. Es wurde auch gezeigt, dass die InsGLuc MIN6-Zellen wie erwartet auf sekretionsmodulierende Verbindungen wie Kaliumchlorid, Diazoxid, PMA und Epinephrin reagieren.

Nach diesem Verfahren sollten kritische Ergebnisse durch die Analyse von KRBH-Überdräuern in Antikörper-basierten ELISA- oder HTRF-Assays bestätigt werden, die die Bestimmung von Insulinkonzentrationen ermöglichen. Eine Gruppe des Broad Institute hat viel Pionierarbeit geleistet, was mir den Weg geebnet hat, diesen Test in meiner Forschung zunehmend zu nutzen. Mehrere Forschungsgruppen, darunter wir und die Gruppe am Broad, nutzen diesen Ansatz bei der Entdeckung von Medikamenten im Bereich Diabetes.