Name: Anreicherung und Nachweis von Clostridium perfringens Toxinotypes in Einzelhandels-Lebensmittelproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Anreicherung und Detektion von Clostridium perfringens Toxinotypen in Lebensmitteln ohne anaerobe Kammern. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Stämmen B und D mit Epsilon-Toxin.

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Diese Forschung erhielt keine spezifischen Mittel aus dem öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.

HINWEIS: C. perfringens gilt als Biosicherheitsrisikostufe 2 (BSL2) Organismus. Obwohl nicht alle Lebensmittelproben C. perfringensenthalten, sollten alle kultivierten Proben als solche behandelt werden. Alle geeigneten Vorsichtsmaßnahmen und Personalschutzausrüstung (PSA) sollten zu jeder Zeit getragen werden. Dekontaminieren Sie das gesamte Material vor der Entsorgung.
1. Vorbereiten modifizierter RPM4,15
<ol><li>Kombinieren Sie 30 g/L Flüssigkeit Thioglycolat Medium, 60 g/L Gelatine, 5 g/L Pepton, 5 g/L Glukose, 5 g/L Kaliumphosphat dibasic, 3 g/L Hefeextrakt, 1,5 g/L Natriumchlorid, 0,5 g/L Eisensulfat in deionisiertem Wasser, bis gleichmäßig dispergiert. Wir machen in der Regel 1 L-Chargen.</li>
	<li>Autoklav bei 121 °C für 15 min.</li>
	<li>Auf ca. 40 °C abkühlen lassen.</li>
	<li>Sobald RPM kühl ist, fügen Sie D-Cycloserin zu einer Endkonzentration von 440 mg/L hinzu. HINWEIS: Die In-Salzkonzentrationen von D-Cycloserin gelösten D-Cycloserin können bei 50 mg/ml bei -20 °C für die spätere Verwendung gelagert werden.</li>
	<li>Aseptisch 10 ml RPM auf 15 ml konische Rohre übertragen. RPM kann in Chargen zubereitet und bei 4 °C bis zu einem Monat gelagert werden.</li>
	<li>Vor gebrauchen s/ b.: RPM auf 37 °C erwärmen.</li>
</ol>2. Probensammlung und RPM-Inkubation
<ol><li>Transport von Lebensmitteln ins Labor bei Umgebungstemperaturen innerhalb von 1 h. Lebensmittel können in Originalverpackungen oder sterilen Behältern transportiert werden. Wenn die Prüfung nicht sofort erfolgt, können Lebensmittel bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden. Notieren Sie sich die Art der Lebensmittel und das Ursprungsland gemäß dem Verpackungsetikett, sofern verfügbar, sowie alle anderen relevanten Informationen.</li>
	<li>Ca. 1,0–2,0 g Lebensmittel entfernen und in eine sterile Petrischale oder ein gleichwertiges Umlegen bringen. Fein hacken mit einer sterilen Rasierklinge oder Skalpell.</li>
	<li>In einem 15 ml konischen Rohr in 10 ml Phosphatgepufferte Salin (PBS) einimpfen. Gut mischen.<ol>
<li>Zur Auswahl für vegetative Zellen 5 ml des PBS-Lebensmittelgemisches in ein 15 ml konisches Rohr mit 10 ml Drehzahl übertragen. Sichern Sie den Deckel fest.</li>
		<li>Zur Auswahl von Sporen die restlichen 5 ml PBS-Lebensmittelmischung bei 85 °C 15 min erhitzen und dann in ein 15 ml konisches Rohr mit 10 ml Drehzahl geben. Sichern Sie den Deckel fest.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wirbel und invertieren die Lebensmittel-RPM-Kulturen, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.</li>
	<li>Versiegeln Sie die konischen Rohre fest und wickeln Sie Deckel mit Paraffinfolie oder Plastikfolie, um eine anaerobe Umgebung zu gewährleisten.</li>
	<li>Über Nacht (ON) bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Am nächsten Morgen notieren Sie trüben oder gärung in RPM-Röhren.</li>
</ol>3. TSC "Sandwich" Beschichtung
<ol><li>Inokulieren Sie ON RPM-Kulturen in TSC-Agar mit einer unten beschriebenen "Sandwich"-Technik (Abbildung 2).</li>
	<li>Bereiten Sie TSC Agar gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.<ol>
<li>Bereiten Sie die Basisschicht der TSC-Platten vor, indem Sie 10 ml geschmolzenen TSC-Agar auf sterile Petrischalen übertragen und erstarren lassen. Diese können in fortgeschrittenen vorbereitet und bei 4 °C gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt werden.</li>
		<li>Für die oberste Schicht der TSC-Platte den verbleibenden geschmolzenen TSC-Agar bei 40 °C aufbewahren. HINWEIS: Obwohl der Schmelzpunkt des Agars über 85 °C liegt, erstarrt geschmolzener Agar um 32–45 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rufen Sie vorsichtig die ON-RPM-Kulturen ab und übertragen Sie 100 L auf die TSC-Agarbasis. Aufgrund der Gärung können einige Kulturen unter Druck stehen. Achten Sie darauf, alle entsprechenden PSA zu tragen.</li>
	<li>Verteilen Sie das RPM-Inokulum mit sterilisierten Glasperlen oder Zellstreuer.</li>
	<li>Lassen Sie RPM 5–10 min bei Raumtemperatur in TSC-Agar "absorbiert" werden.</li>
	<li>20 ml geschmolzenen, 40 °C TSC-Agar vorsichtig mit einer serologischen Pipette auf die Platte geben.</li>
	<li>Ersetzen Sie den Petrischalendeckel und lassen Sie den TSC-Agar bei Raumtemperatur vollständig erstarren.</li>
	<li>Die Petrischale umkehren und bei 37 °C eininkubieren.</li>
	<li>Wenn serielle Verdünnungen gewünscht werden, führen Sie Verdünnungen der ON RPM-Kulturen in frische, vorgewärmte RPM vor der Impfung in TSC-Agar durch.</li>
</ol>4. Unterkultivierung sulfitreduzierender Kolonien
<ol><li>Am nächsten Morgen, entfernen Sie Platten aus dem Brutkasten und untersuchen auf bakterielles Wachstum. Aerobe Bakterien können auf der Oberfläche des Agars vorhanden sein. Anaerobe Bakterien werden in den Agar eingebettet wachsen gefunden werden. Sulfitreduzierende Bakterien werden umgebende Agar schwarz. Mögliche C. perfringens Kolonien werden schwarz und in den Agar eingebettet sein.</li>
	<li>
C. perfringens vermutete Kolonien werden positiv für Sulfit-Reduktion sein und wird schwarz erscheinen, eingebettet in den Agar. Mit einer sterilen, einweg-Perltropfengucke, "zupfen" die schwarzen Kolonien aus dem Agar und übertragen auf 10 ml frische RPM in einem 15 ml konischen Rohr. Es ist wichtig, dass die Luft aus der Augentropfen vor dem Piercing Agar ausgestoßen werden.</li>
	<li>Wenn es eine dichte Menge an aeroben bakteriellen Wachstum auf der Oberfläche der Platte, verwenden Sie einen sterilen Zellschaber, um Kolonien aus ausgewählten Bereichen zu entfernen. Mehrere C. perfringens vermutete Kolonien können von der gleichen TSC-Platte in separate RPM-Kulturen abgetastet werden.</li>
	<li>Fest sichere konische Rohrdeckel und in Paraffinfolie oder Plastikfolie wickeln. Ein bei 37 °C inkubieren.</li>
</ol>5. DNA-Extraktion
<ol><li>Entfernen Sie ON RPM Kulturen und untersuchen Sie auf Anzeichen von Wachstum einschließlich Trübung und Fermentation.</li>
	<li>Um vorsichtig Drehzahlkultur umzukehren, um alle besiedelten Bakterien zu zerstreuen und vorsichtig zu öffnen. 1 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen.</li>
	<li>Zentrifuge mit Höchstgeschwindigkeit (ca. 15.000 x g) für 10 min Pelletbakterien.</li>
	<li>Pellet mit 1 ml sterilem PBS waschen.<ol>
<li>Unter bestimmten Umständen wird sich unverdaute Gelatine auf pelletierten Bakterien niederlassen. Um Gelatine zu entfernen, "fluff" aus Gelatine durch sanftes Rühren mit PBS mit einer Mikropipette. Dadurch wird die Gelatine "fluff-up", während das bakterielle Pellet intakt bleibt.</li>
		<li>Entfernen Sie die PBS-Gelatinemischung mit sanfter Aspiration. Das verbleibende bakterielle Pellet mit 1 ml frischem PBS wieder aufhängen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das resuspendierte Bakterielle Pellet mit Höchstgeschwindigkeit für 10 min und aspirieren Sie vorsichtig den Überstand.</li>
	<li>Führen Sie sofort die DNA-Extraktion mit einem DNA-Extraktionskit und einem Protokoll durch, das speziell für die Extraktion von DNA aus grampositiven Bakterien erstellt wurde (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Verwenden Sie die extrahierte DNA sofort oder lagern Sie bei -20 °C bis zur PCR-Analyse.</li>
</ol>6. Erkennung von C. perfringens über PCR-Genotypisierung
<ol><li>Um festzustellen, ob Kulturen für C. perfringens toxinotypes positiv sind, untersuchen Sie extrahierte DNA auf verschiedene Toxingene über PCR. HINWEIS: Da wir am meisten an den Epsilontoxin produzierenden Stämmen Typ B und D C. perfringensinteressiert sind, bewerten wir das Vorhandensein der Alpha-, Beta- und Epsilontoxingene. Primer sind in Tabelle 2aufgeführt. Primer für 16s ribosomale DNA werden als DNA-Extraktionskontrolle verwendet. Zusätzliche Primer können verwendet werden, um auf Toxinotypen A bis G zu testen und können in der veröffentlichten Literatur2,12,13gefunden werden.</li>
	<li>Verwenden Sie zuvor extrahierte C. perfringens DNA als positive Kontrolle. Diese Steuerung stellt sicher, dass alle Komponenten der PCR-Reaktionen funktionieren. Als Positivkontrolle verwenden wir DNA aus C. Perfringens Typ B (ATCC 3626). AtCC 3636 ON in RPM bei 37 °C anbauen und DNA mit den gleichen Methoden extrahieren, die in den Schritten 5.1–5.7 beschrieben sind. Extrahierte DNA bis zur Anwendung bei -20 °C lagern.</li>
	<li>PCR-Bedingungen wie folgt einstellen: 94,0 °C für 3 min; 94,0 °C für 30 s; 47,9 °C für 30 s, 72,0 °C für 1 min (Wiederholungsschritte 2–4 für 35 Zyklen); 72.0 °C für 10 min.</li>
	<li>Um PCR-Produkte zu bestätigen, führen Sie PCR-Reaktionen auf einem 1,8 g/100 ml Agarose-Gel mit Standardtechniken aus. Erwartete PCR-Produktgrößen sind in Tabelle 2aufgeführt. Typische PCR-Ergebnisse werden in Abbildung 3dargestellt.</li>
</ol>

<ol><li>Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+perfringens%3A+toxinotype+and+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clostridium perfringens: toxinotype and genotype.</a> Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).</li>
<li>Rood, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+Clostridium+perfringens+toxin-based+typing+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme.</a> Anaerobe. , (2018).</li>
<li>Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+sheep-multiple+sclerosis+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A review of the sheep-multiple sclerosis connection.</a> Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).</li>
<li>Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Clostridium+perfringens+type+B+in+an+individual+at+first+clinical+presentation+of+multiple+sclerosis+provides+clues+for+environmental+triggers+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease.</a> PLoS One. 8, 76359(2013).</li>
<li>Wagley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Clostridium+perfringens+epsilon+toxin+associated+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis.</a> Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).</li>
<li>Linden, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+perfringens+Epsilon+Toxin+Causes+Selective+Death+of+Mature+Oligodendrocytes+and+Central+Nervous+System+Demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination.</a> MBio. 6, 02513(2015).</li>
<li>Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsilon+toxin%3A+a+fascinating+pore-forming+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin.</a> FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).</li>
<li>Lee, C. A., Labbe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Enterotoxin-+and+Epsilon-Positive+Clostridium+perfringens+Spores+in+U.S.+Retail+Spices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices.</a> Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).</li>
<li>Wen, Q., McClane, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enterotoxigenic+Clostridium+perfringens+type+A+isolates+in+American+retail+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).</li>
<li>Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Clostridium+perfringens+in+retail+chicken+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers.</a> Anaerobe. 21, 67-68 (2013).</li>
<li>Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+Clostridium+perfringens+in+American+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Incidence of Clostridium perfringens in American foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).</li>
<li>Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Clostridium+perfringens+type+C+enteritis+in+pigs+using+a+DNA+amplification+technique+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medicine%2C+Series+B%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR).</a> Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).</li>
<li>Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+test+for+differentiation+of+five+toxin+types+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens.</a> Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).</li>
<li>Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+clostridium+perfringens+during+simulated+transport+and+stability+of+some+plasmid-borne+toxin+genes+under+aerobic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Veterinaria+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions.</a> Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).</li>
<li>Erickson, J. E., Deibel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+medium+for+rapid+screening+and+enumeration+of+Clostridium+perfringens+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).</li>
<li>Regan, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epsilon+toxin-producing+Clostridium+perfringens+strains+in+American+retail+food%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food.</a> Anaerobe. 54, 124-127 (2018).</li>
</ol>

Keine Angaben.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung der C. perfringens Prävalenz in Einzelhandels-Lebensmittelproben mit begrenzter Subkultivierung und ohne Verwendung eines anaeroben Kammersystems. Diese Methode verwendet eine Kombination von Techniken, um die Identifizierung von C. Perfringens aus Lebensmittelproben zu erhöhen. Durch die Verwendung einer modifizierten Version von RPM-Medien ermöglichen wir das selektive Wachstum von C. perfringens. Durch das Einstecken der geimpften Drehzahl zwischen Schichten von TSC-Agar sind wir in der Lage, anaerobe, sulfitreduzierende Bakterien zu identifizieren und zu isolieren, die für C. perfringenscharakteristisch sind. Um das Vorhandensein von C. perfringenszu bestätigen, werden Sulfit-reduzierende Kolonien in frische Drehzahl subkultiviert. Die modifizierte Version oder RPM ermöglicht es uns, leicht DNA aus Kulturen zu extrahieren, was die PCR-Bestätigung bestimmter Toxingene ermöglicht. Die Bestätigung von C. perfringens kontaminierten Lebensmittelproben kann innerhalb von drei Tagen erreicht werden.
In frühen Experimenten wurden Lebensmittelproben einfach in RPM geimpft und DNA aus ON-Kulturen extrahiert. Diese Methode führte zum Nachweis von C. perfringens in einer begrenzten Anzahl von Proben (Daten nicht gezeigt). Obwohl RPM für c. perfringens Wachstum selektiv ist, ist es nicht ausschließlich für C. perfringens Wachstum. Andere, grampositive, D-Cycolserin-resistente Bakterien können noch in RPM wachsen. Wir vermuteten, dass die Kontamination durch andere Bakterienarten unseren Nachweis von C. perfringens-Stämmen verringert haben könnte, indem die Empfindlichkeit unserer PCR-Analyse in unserer ersten ON-RPM-Kultur verringert wurde. Ein entscheidender Schritt bei der Erhöhung der Erkennung von C. perfringens war die Einbeziehung der TSC Agar "Sandwich" Technik. Dies ermöglichte es uns, für anaerobe, sulfit reduzierende Kolonien, die für C. perfringens charakteristisch sind, zu differenzieren und auszuwählen. Ein wichtiger Schritt in diesem Prozess ist es, sicherzustellen, dass die oberste Schicht des geschmolzenen TSC-Agars bei 40 °C liegt. Obwohl einige C. perfringens Stämme bei erhöhten Temperaturen (46–48 °C)15,16wachsen können, reduziert die Zugabe von geschmolzenem Agar bei erhöhten Temperaturen die Menge der wiedergewonnenen Kulturen stark, was wahrscheinlich auf den Zelltod zurückzuführen ist. .
Es gibt mehrere potenzielle Einschränkungen für diese Methode. Wie bereits erwähnt, wählt oder differenziert weder der RPM- noch der TSC-Agar ausschließlich C. perfringens, was das Wachstum anderer Bakterienarten in Lebensmittelproben ermöglicht. Dies kann die Empfindlichkeit des Assays verringern, nur für C. perfringens auszuwählen. Dies ist jedoch eine häufige Einschränkung in fast allen Kultivierungstechniken. Genotypisierung Bestätigung von gereinigten Isolaten ist die beste Methode zur endgültigen Identifizierung von C. perfringens und anderen bakterienarten. Eine weitere Einschränkung dieser Studie ist, dass wir die gereinigten Isolate nicht testen. Wir haben dies absichtlich getan, um die Menge der Subkultivierung zu begrenzen, da wiederholte Unterkultivierung befürchtet wird, um zu Plasmidverlust zu führen. Da wir nicht auf Reinheit isolieren, ist es möglich, dass mehrere C. perfringens toxinotypes in der gleichen Probe oder Subkultur vorhanden sein können. Wenn Forscher gereinigte Isolate erhalten möchten, können Standardreinigungsmethoden auf der letzten RPM-Kultur verwendet werden, die in dieser Methode beschrieben wird; dies erfordert in der Regel die Verwendung von anaeroben Kammern. Obwohl ursprünglich verwendet, um C. perfringens von Lebensmitteln zu isolieren, kann diese Methode verwendet werden, um C. perfringens aus einer Vielzahl von Quellen zu identifizieren und zu isolieren. Insbesondere ist eine solche Anwendung dieser Methode, Fäkalienproben von Menschen (oder Tieren) zu testen, die im Verdacht stehen, mit C. perfringens infiziert zu sein und die Bakterien toxinotyp, um die Infektionsquelle besser zu verstehen.

Clostridium perfringens (C. perfringens) ist ein Gram-positives, anaerobes, sporenbildendes, stabförmiges Bakterium, das in der Umwelt allgegenwärtig ist. Diese Bakterienart trägt Gene, die für über 17 Toxine kodieren und wurde historisch gesehen in fünf Toxinotypen (A-E) charakterisiert, die auf dem Vorhandensein von vier verschiedenen Toxingenen basieren: Alpha, Beta, Epsilon und Jotatoxin (Tabelle 1)1. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass dieses Typisierungsschema um die Typen F und G erweitert werden muss, die das C. perfringens enterotoxin (CPE) und NetB toxin bzw.2enthalten. Es bedarf jedoch weiterer Forschung, bevor dieses Scheming-System formell akzeptiert wird. Während das Alpha-Toxin-Gen streng chromosomal lokalisiert ist, kann das CPE-Gen sowohl auf dem Chromosom als auch auf den Plasmiden gefunden werden. Im Vergleich dazu finden sich die Gene der verbleibenden Toxine auf verschiedenen unterschiedlich großen Plasmiden. Wir sind besonders an der Prävalenz von C. perfringens Typ B und D interessiert, da diese Stämme Epsilontoxin produzieren, ein extrem starkes, porenbildendes Toxin, das eine Rolle bei der Auslösung von Multipler Sklerose (MS) beim Menschen spielen soll3 ,4,5,6,7. Wie Menschen durch diese Stämme infiziert oder kolonisiert werden, ist nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung ist der Verzehr kontaminierter Lebensmittel. Um diese Frage zu beantworten, versuchten wir, die Prävalenz verschiedener C. perfringens Toxinotypen in amerikanischen Lebensmittelproben zu bestimmen.
Das Vorhandensein von C. perfringens toxinotypes in amerikanischen Lebensmittelproben ist unteruntersucht und erfordert häufig die Verwendung von anaeroben Behältersystemen und zahlreichen Unterbaustufen8,9,10,11 . Obwohl zahlreiche Subkultivierungsschritte erforderlich sind, um gereinigte Isolate zu erhalten, kann diese Methode im Laufe der Zeit zum Verlust von Plasmiden führen12,13,14, möglicherweise den Nachweis von Plasmid-übertragenen Toxingenen beeinflussen. einschließlich des Epsilontoxin-Gens. Wir versuchten, eine einfache Methode zu entwickeln, mit weniger Unterbauschritten, um selektiv Zusätzmittel zu kultivieren, ohne anaerobe Kammern, Gläser oder Taschen zu verwenden. Kurz gesagt, Lebensmittelproben werden über Nacht (ON) in Rapid Perfringens Media (RPM) geimpft, dann in TSC-Agar "gepfert" und on inkubiert. Kolonien, die im Verdacht stehen, C. perfringens zu sein, werden dann in RPM subkultiviert und wieder ON inkubiert. DNA wird extrahiert und PCR durchgeführt, um den Genotyp zu bestimmen (Abbildung 1). Wir haben uns für RPM entschieden, da es gezeigt wurde, dass die Rückgewinnung von C. perfringens Stämmen aus Lebensmittelproben im Vergleich zu anderen Standardmedien zu erhöhen15. Darüber hinaus wurde RPM erfolgreich eingesetzt, um einen Epsilontoxin-produzierenden Typ-B-Stamm von einem MS-Patienten4zu isolieren. Wir verwenden eine modifizierte Version von RPM anstelle der ursprünglichen Version, um eine einfache DNA-Extraktion zu ermöglichen. Während diese Methode eine einfache Identifizierung von Toxingenen in Proben ermöglicht, ist es möglich, dass eine einzelne Probe mehr als ein C. perfringens toxinotype enthält. Da unsere Methode gereinigte Stämme nicht mit mehreren Reinigungsrunden isoliert, ist die Identifizierung mehrerer Toxinotypen aus einer Probe nicht möglich. Am Ende unseres Protokolls können jedoch Standardreinigungstechniken (in der Regel auf TSC-Platten oder Blutagarplatten) angewendet werden, um gereinigte Kulturen zu erreichen.

<table><tbody><tr><td>D-Cycloserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Life Science</td><td>D9434-250G</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipetten</td><td>jeder Marke</td><td></td><td>Wählen Sie eine mit schlanker Spitze wie Thermo Scientific Einweg-Transferpipetten 137116M/EMD</td></tr><tr><td>DNeasy Blut & Tissue-Kits</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Hinweis: Zahlreiche DNA- und Plasmid-Extraktions-Kits wurden evaluiert, dieses Kit lieferte die wünschenswertesten Ergebnisse.</td></tr><tr><td>Trockeninkubator</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssiges Thioglycolatmedium</td><td>Remel</td><td>R453452</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>Sigma Life Science</td><td>G1890-500G</td><td></td></tr><tr><td>Individuelle Grundierungen</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eisen (II)-sulfat Heptahydrat</td><td>Sigma Life Science</td><td>F8633-250 G</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym aus Hühnereiweiß</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Benötigt für die DNA-Extraktion, nicht im Kit</td></tr><tr><td>enthalten Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm oder Plastikfolie</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepton aus Kasein und anderen tierischen Proteinen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70173-100G</td><td></td></tr><tr><td>Perfringens Agar Base (TSC + SFP)</td><td>Oxoid</td><td>CM0587</td><td>TSC-Agar gemäß den Anweisungen herstellen</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasig</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222-100G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7653</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Zellschaber</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriler Zellspreader</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Petrischalen</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verbrauchsmaterialien und Ausrüstung für die Gelelektrophorese</td>Tischzentrifuge <td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Taq</td></tr><tr><td>&nbsp; PCR Master Mix Kit</td><td>Qiagen</td><td>201443</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler für PCR-Reaktionen</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70161-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

anreicherung und nachweis von clostridium perfringens toxinotypes in einzelhandels-lebensmittelproben

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

Clostridium perfringens (C. perfringens) ist ein produktiver Toxinproduzent und verursacht eine breite Palette von Krankheiten bei verschiedenen Wirten. C. perfringens ist in fünf verschiedene Toxinotypen, A bis E, eingeteilt, basierend auf der Beförderung von vier Haupttoxingenen. Die Prävalenz und Verbreitung dieser verschiedenen Toxinotypen ist unteruntersucht, insbesondere ihre Verbreitung in amerikanischen Einzelhandelsnahrung. Von besonderem Interesse für uns sind die Stämme Typ B und D, die Epsilontoxin produzieren, ein extrem tödliches Toxin, das als Umweltauslöser von Multipler Sklerose beim Menschen vermutet wird. Um das Vorhandensein verschiedener C. perfringens toxinotypes in verschiedenen Lebensmittelproben zu bewerten, entwickelten wir eine einfache Methode, um diese Bakterien selektiv zu kultivieren, ohne dass ein anaerobes Behältersystem nur mit drei Kultivierungsschritten verwendet wird. Lebensmittel werden in lokalen Lebensmittelgeschäften gekauft und unter Umgebungsbedingungen ins Labor transportiert. Die Proben werden gehackt und in modifizierte Schnellperfringenmedien (RPM) geimpft und über Nacht bei 37 °C in einem versiegelten, luftdichten konischen Rohr inkubiert. Über Nacht werden Kulturen auf eine untere Schicht aus solidem Tryptose Sulfite Cycloserin (TSC) Agar geimpft und dann mit einer obersten Schicht aus geschmolzenem TSC-Agar überlagert, wodurch eine "sandwiched", anaerobe Umgebung entsteht. Agarplatten werden über Nacht bei 37 °C inkubiert und dann auf das Auftreten schwarzer, sulfitreduzierender Kolonien untersucht. C. perfringens-verdächtige Kolonien werden mit sterilen Augentropfen aus dem TSC-Agar entfernt und in RPM geimpft und über Nacht bei 37 °C in einem luftdichten konischen Rohr subkultiviert. DNA wird aus der RPM-Subkultur extrahiert und dann über Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf das Vorhandensein von C. perfringens Toxingenen analysiert. Je nach Art der untersuchten Lebensmittel werden in der Regel 15–20 % der Proben positiv auf C. perfringensgetestet.

Mit dieser Methode testen 15–20% unserer untersuchten Lebensmittel positiv auf C. perfringens. Während die meisten Stämme positiv für den Toxinotyp A sind, haben wir sowohl Typ B als auch D in Lebensmittelproben erfolgreich nachgewiesen. In einem zuvor veröffentlichten Papier haben wir insgesamt 216 Lebensmittelproben getestet, die in New Yorker Einzelhandelsgeschäften gekauft wurden16 (Tabelle 3). Diese Proben umfassten verschiedene Fleischproben (Rind, Lamm, Schwein und Lamm), Geflügelproben (Huhn und Pute) und Fischproben (Kabeljau, Lachs, Schalentiere, Schnapper, Flunder, Tintenfisch, Tilapia, Thunfisch und verschiedene andere Fische). Auch Produktions- und Milchproben wurden getestet. Von 216 Proben, 34 (16%) waren positiv für C. perfringens. Von den 34 C. perfringens positiven Proben wurden 31 Proben (91,2%) alpha toxin, eine Probe (2,9%) Alpha-, Beta- und Epsilontoxin sowie zwei Proben (5,9%) alpha- und Epsilontoxin enthielten.
Interessanterweise entdeckten wir auch, dass C. perfringens häufiger als vegetative Zellen im Vergleich zu Sporen verbreitet war. 25 Proben wurden auf das Vorhandensein von vegetativen C. perfringens Zellen oder Sporen verglichen. Sporen wurden durch hitzeschockende Proben bei 85 °C für 15 min ausgewählt. Von den 25 getesteten Proben waren 16% positiv für vegetative C. perfringens Stämme gegenüber 4% für Sporen. Dies weist darauf hin, dass es möglicherweise kostengünstiger ist, nur vegetative Zellen anstelle von beidem zu testen.
<img alt="Workflow-Diagramm für die PCR-Analyse von Lebensmittelproben für die DNA-Extraktion aus Zellen/Sporen mittels Hitzeschockmethode." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Übersicht über die Prozedur. Lebensmittelproben werden gehackt und zu sterilem PBS verdünnt. Die Hälfte der PBS-Lebensmittelprobe wird in RPM geimpft, um sie für vegetative Zellen auszuwählen. Die verbleibende PBS-Lebensmittelprobe wird bei 85 °C 15 min wärmer geschockt, um vor der Impfung in RPM für Sporen auszuwählen. Kulturen werden bei 37 °C eingeschrieben und dann in TSC-Agar eingehakt. TSC-Agar wird bei 37 °C eingetaucht und schwarze, sulfitreduzierende Kulturen werden in frische Drehzahl subkultiviert. Subkultivierte RPM-Kulturen werden bei 37 °C eingeschrieben und DNA extrahiert, um Genotypisierung über PCR durchzuführen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Diagramm der geschichteten Gelelektrophorese; TSC- und RPM-Schichten für die DNA-Trennung in der Petrischale." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Schematische TSC-Agar-Sandwich-Technik. RPM-Medien, die die C. perfringens Bakterien enthalten, werden zwischen zwei Schichten TSC-Agar plattiert, um eine anaerobe Umgebung zu fördern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Ergebnisse der Elektrophorese; DNA-Banden; Identifizierung von Arten; Geldiagramm; 250-750bp Leiter." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: Ausgewählte PCR-Ergebnisse. Beispielbilder der Genotypisierungsergebnisse von C. perfringens aus sieben verschiedenen Arten von Lebensmitteln und eine positive Kontrolle von C. perfringens Typ B. Eine Molekulargewichtsleiter (erste Spur jedes Gels) wurde verwendet, um die Größe der PCR-Ergebnisse in Basenpaaren (bp) anzunähern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Toxinotyp</td>
			<td>alpha</td>
			<td>Beta</td>
			<td>Epsilon</td>
			<td>Iota</td>
			<td>Cpe</td>
			<td>NetB</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">bestehend</td>
			<td>pro</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>c</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Vorgeschlagenen</td>
			<td>f</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>g</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">+ vorhanden - nicht vorhanden +/- kann vorhanden sein oder nicht</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Übersicht über Die Genotypen von C. perfringens. Ein Diagramm der Kombinationen von Toxinen, die von jedem C. perfringens toxinotype produziert werden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>zielscheibe</td>
			<td>Primer-Paare</td>
			<td>Erwartetes PCR-Produkt (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>alpha</td>
			<td>F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG</td>
			<td>325</td>
		</tr>
<tr>
<td>Beta</td>
			<td>F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C</td>
			<td>196</td>
		</tr>
<tr>
<td>Epsilon</td>
			<td>F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC</td>
			<td>655</td>
		</tr>
<tr>
<td>16s RNA</td>
			<td>F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T</td>
			<td>Nr. 1300</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Primer und erwartete PCR-Produkte für ausgewählte Toxingene. Primer, die im PCR-Genotypisierungsschritt verwendet werden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3" rowspan="2">Lebensmitteltyp</td>
			<td colspan="2">Typ A</td>
			<td colspan="2">Typ B</td>
			<td colspan="2">Typ C</td>
			<td colspan="2">Typ D</td>
			<td colspan="2">C. perf +</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Alphatoxin positiv</td>
			<td colspan="2">Alpha-, Beta- und Epsilontoxin-positiv</td>
			<td colspan="2">Alpha und Beta-Toxin positiv</td>
			<td colspan="2">Alpha- und Epsilontoxin positiv</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr><tr><td colspan="2"></td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">fleisch</td>
			<td>rindfleisch</td>
			<td>38</td>
			<td>8</td>
			<td>21%</td>
			<td>1</td>
			<td>3%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>9</td>
			<td>24%</td>
		</tr><tr><td>lamm</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>schweinefleisch</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
			<td>13%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>13%</td>
		</tr><tr><td>gemischt</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>100%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>zwischen-</td>
			<td>64</td>
			<td>11</td>
			<td>17%</td>
			<td>1</td>
			<td>2%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>12</td>
			<td>19%</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">geflügel</td>
			<td>küken</td>
			<td>19</td>
			<td>5</td>
			<td>26%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>5</td>
			<td>26%</td>
		</tr><tr><td>Turkei</td>
			<td>7</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>zwischen-</td>
			<td>26</td>
			<td>5</td>
			<td>19%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>5</td>
			<td>19%</td>
		</tr><tr><td rowspan="11">meeresfrüchte</td>
			<td>kabeljau</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>gemischt</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>lachs</td>
			<td>11</td>
			<td>2</td>
			<td>18%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>18%</td>
		</tr><tr><td>shelfish</td>
			<td>32</td>
			<td>1</td>
			<td>3%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>3%</td>
		</tr><tr><td>Snapper</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>75%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>3</td>
			<td>75%</td>
		</tr><tr><td>zappeln</td>
			<td>12</td>
			<td>4</td>
			<td>33%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>4</td>
			<td>33%</td>
		</tr><tr><td>Tintenfisch</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>25%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>Tilapia</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>10%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>10%</td>
			<td>4</td>
			<td>19%</td>
		</tr><tr><td>thunfisch</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>andere</td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>13%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>13%</td>
		</tr><tr><td>zwischen-</td>
			<td>100</td>
			<td>14</td>
			<td>14%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>2%</td>
			<td>16</td>
			<td>16%</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">milchgeschäft</td>
			<td>kuh</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>ziege</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>milch</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>zwischen-</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">hervorholen</td>
			<td>gemüse</td>
			<td>12</td>
			<td>1</td>
			<td>8%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>8%</td>
		</tr><tr><td>obst</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>kraut</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr><tr><td>zwischen-</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>6%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>6%</td>
		</tr><tr><td>gesamt</td>
			<td></td>
			<td>216</td>
			<td>31</td>
			<td>14%</td>
			<td>1</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>0.90%</td>
			<td>34</td>
			<td>16%</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Prävalenz verschiedener C. perfringens toxinotypes in 216 Lebensmittelproben. Ein Beispiel für die Ergebnisse, die bei der Verwendung dieser Methode zum Testen von Einzelhandelsnahrung auf C. perfringenserzielt wurden. Diese Tabelle wurde aus dem zuvor veröffentlichten Manuskript Regan et al.16geändert.

Ziel dieses Protokolls ist es, verschiedene Clostridium perfringens toxinotypes in lokal gekauften Lebensmitteln, insbesondere Epsilontoxin produzierenden Stammtypen B und D, ohne verwendung von anaeroben Kammern zu erkennen.

Anreicherung und Nachweis von Clostridium perfringens Toxinotypes in Einzelhandels-Lebensmittelproben

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized ...

Wir haben eine einfache Methode entwickelt, um Lebensmittelproben auf die verschiedenen C-Perfringentoxintypen zu testen. Wir interessieren uns besonders für die Prävalenz der Toxinotypen B und D, die das Epsilontoxin produzieren. Unser Protokoll ermöglicht eine einfache Anreicherung und Detektion der verschiedenen C-Perfringen-Toxinotypen ohne den Einsatz von anaeroben Kammern oder Inkubatoren mit begrenzter Unterkultivierung.Diese Methode könnte auch verwendet werden, um Boden, Wasser, Fäkalienproben und mehr zu testen. Demonstriert wird das Verfahren von Zuha Anwar und Samantha Regan, Technikerinnen und Technikern aus dem Labor. Beginnen Sie mit dem Vorbereiten von modifizierten schnell perfringens medium oder RPM.Kombinieren Sie Zutaten nach Manuskriptrichtungen, und autoklavieren Sie die Mischung bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Lassen Sie das Medium auf ca. 40 Grad Celsius abkühlen und fügen Sie dann D-Cycloserin zu einer Endkonzentration von 440 Milligramm pro Liter hinzu. Die Drehzahl auf 15 Milliliter konische Röhren aseptisch übertragen und bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius lagern.Vor der Verwendung, erwärmen Sie das Medium auf 37 Grad Celsius. Übertragen Sie das Lebensmittel bei der Entnahme von zu prüfenden Proben gemäß den Manuskriptanweisungen ins Labor. Wenn das Essen nicht sofort getestet wird, kann es bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.Notieren Sie sich die Art der Lebensmittel und das Herkunftsland sowie alle anderen relevanten Informationen. Um das Essen zu testen, transferieren Sie etwa ein bis zwei Gramm auf eine sterile Petrischale und zerkleinern Sie es fein mit einer sterilen Rasierklinge oder skalpell. Impfen Sie es in 10 Milliliter PBS in einem 15 Milliliter konischen Rohr, und gut mischen.Wählen Sie für vegetative Zellen, indem Sie fünf Milliliter der PBS-Lebensmittelmischung in ein 15 Milliliter konisches Rohr mit 10 Milliliter RPM übertragen und den Deckel fest schließen. Wählen Sie für Sporen, indem Sie die restlichen fünf Milliliter der Mischung für 15 Minuten auf 85 Grad Celsius erhitzen. Und dann übertragen Sie es auf ein Rohr mit Drehzahl und schließen Sie den Deckel fest.Um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten, Wirbel und invertieren die Lebensmittel RPM Kulturen. Dann die konischen Rohre fest versiegeln und die Deckel mit Paraffinfolie umwickeln, um eine anaerobe Umgebung zu schaffen. Inkubieren Sie die Rohre über Nacht bei 37 Grad Celsius und notieren Sie trübe oder Gärung am nächsten Morgen.Bereiten Sie Tryptose Sulfite Cycloserine oder TSC Agar entsprechend der Herstellerrichtung vor und verwenden Sie dann die Sandwich-Technik, um sie mit Übernacht-RPM-Kulturen zu impfen. Bereiten Sie die Grundschicht der Platten vor, indem Sie 10 Milliliter des geschmolzenen Agar auf sterile Petrie-Schalen übertragen und es erstarren lassen. Halten Sie den verbleibenden TSC Agar bei 40 Grad Celsius für die oberste Schicht und übertragen Sie sorgfältig 100 Mikroliter der Übernacht-RPM-Kultur auf die Agar-Basis.Einige Kulturen können durch fermentation unter Druck stehen, also achten Sie darauf, alle geeigneten persönlichen Schutzausrüstungen zu tragen. Das Inokulinmitische mit sterilen Glasperlen oder einem Zellstreuer verteilen und RPM fünf bis zehn Minuten in den Agar aufnehmen lassen. Verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um 20 Milliliter des geschmolzenen TSC Agar sorgfältig auf die Platte zu übertragen.Ersetzen Sie den Petrie Tellerdeckel und lassen Sie TSC Agar bei Raumtemperatur vollständig erstarren, dann die Schale invertieren und bei 37 Grad Celsius über Nacht inkubieren. Führen Sie bei Bedarf serielle Verdünnungen der RPM-Kultur vor der Impfung in TSC Agar durch. Nach der Inkubation, untersuchen Platten auf bakterielles Wachstum.Aerobe Bakterien können an der Oberfläche des Agar vorhanden sein, während anaerobe Bakterien in den Agar eingebettet werden. Sulfit reduzierende Bakterien werden den umgebenden Agar schwarz machen, und mögliche C-Perfringens-Kolonien werden schwarz und in den Agar eingebettet sein. Wenn es eine dichte Menge an aeroben bakteriellen Wachstum auf der Oberfläche der Platte, verwenden Sie einen Zellschaber, um Kolonien aus ausgewählten Bereichen zu entfernen.Verwenden Sie einen sterilen Einweg-Augentropfen, um die vermuteten C-Perfringen-Kolonien aus dem Agar zu pflücken und sicherzustellen, dass die Luft vor dem Durchstechen des Agars vertreibt wird. Übertragen Sie die Kolonien auf 10 Milliliter frische RPM in einem 15 Milliliter konischen Rohr. Mehrere Kolonien könnten von derselben Platte in separate Drehzahlkulturen abgetastet werden.Die konischen Rohrdeckel fest befestigen, in Paraffinfolie wickeln und über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. C perfringens ist ein BSL-Organismus. Es ist wichtig, jederzeit angemessene Sicherheitsvorkehrungen zu treffen, insbesondere beim Öffnen von Drehzahlkulturen über Nacht, und gebrauchte Medien sorgfältig zu dekontaminieren und zu entsorgen.Entfernen Sie am nächsten Tag die Nachtkulturen und untersuchen Sie sie auf Trübung und Fermentation, und fahren Sie dann mit der DNA-Extraktion fort. Um sanft die RPM-Kultur umzukehren, um alle besiedelten Bakterien zu zerstreuen und die Röhre vorsichtig zu öffnen. Übertragen Sie einen Milliliter auf ein Mikrozentrifugenrohr und pellet die Bakterien durch Zentrifugation.Waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter sterilem PBS. Wenn sich unverdaute Gelatine auf den Bakterien niedergelassen hat, fluffen Sie sie ab, indem Sie sich mit PBS aufregen. Die Gelatine und PBS vorsichtig ansaugen und das verbleibende bakterielle Pellet mit einem Milliliter frischer PBS wieder aufhängen.Es ist wichtig, jede pelletierte Gelatine mit begrenzter Störung des Zellpellets zu entfernen. Wenn Gelatine nicht entfernt wird, kann dies die DNA-Extraktion und PCR hemmen. Zentrifugieren Sie die Bakterien für 10 Minuten und aspirieren Sie vorsichtig den Überstand.Führen Sie dann die DNA-Extraktion mit einem Kit durch, das speziell für grampositive Bakterien entwickelt wurde. Verwenden Sie die DNA sofort oder speichern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Führen Sie PCR auf der extrahierten DNA durch, um festzustellen, ob die Kulturen für C-Perfringentoxinotypen positiv sind.Verwenden Sie C perfringens DNA als positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass alle PCR-Reagenzien funktionieren. Führen Sie die PCR nach Manuskriptanweisungen aus und analysieren Sie die Produkte mit Agarose-Gel-Elektrophorese. Dieses Protokoll wurde verwendet, um insgesamt 216 Lebensmittelproben zu testen, die in New Yorker Einzelhandelsgeschäften gekauft wurden.Die Proben enthielten verschiedene Fleischproben, Geflügelproben und Fischproben. C perfringens Typ B wurde als Positivkontrolle verwendet. Es wurde festgestellt, dass 15 bis 20 % der in die Stichprobe einbezogenen Lebensmittel positiv auf C-Perfringen getestet wurden.Von den 34 positiven Proben enthielten 31 Proben das Alphatoxin, eine Probe das Alpha-, Beta- und Epsilontoxin. Und zwei Proben enthielten das Alpha- und Epsilontoxin. Wir haben eine einfache Methode entwickelt, um Lebensmittelproben auf die verschiedenen C-Perfringentoxintypen zu testen.Wir interessieren uns besonders für die Prävalenz der Toxinotypen B und D, die das Epsilontoxin produzieren.

enrichment-detection-clostridium-perfringens-toxinotypes-retail-food

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Ein Protokoll, um Trichothecene (Mykotoxine, die für die menschliche Gesundheit) mit einem neu entwickelten Screening-Methode auf einem wettbewerbsfähigen immunchemischen Verfahren und eine endgültige elektrochemischer Detektion basierte Erkennung demonstriert.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung...

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Quelle: Anwar, Z., et al. Anreicherung und Nachweis von Clostridium perfringens-Toxinotypen in Lebensmitteleinzelhandelsproben. J. Vis. Exp. (2019).In diesem Video werden sulfitreduzierende Bakterien in einem sulfithaltigen Agarmedium kultiviert, wo sie anaerob wachsen und Sulfit zu Schwefelwasserstoff reduzieren, wobei sie mit Eisenionen schwarze Ausfällungen bilden. Schwarze Kolonien werden mit aseptischen Techniken aus der Agartiefe isoliert und zur fortgesetzten anaeroben Inkubation in...

Subkultivierung von sulfitreduzierenden anaeroben Bakterien aus einer Agarkultur

Quelle: Pava-Ripoll et al. Nachweis von lebensmittelbedingten bakteriellen Krankheitserregern aus einzelnen Schmutzfliegen. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video demonstriert eine PCR-basierte Methode, die gezielte bakterielle DNA aus angereicherten Fliegenproben mit pathogenspezifischen Tabletten ampliziert und so eine Echtzeit-Fluoreszenzerkennung und Schmelzkurvenanalyse ermöglicht, um das Vorhandensein lebensmittelbedingter Krankheitserreger bei einzelnen Insekten zu bestätigen.

PCR-basierte Detektion lebensmittelbedingter Krankheitserreger aus angereicherten Fliegenproben

H7 gezielt eine einzigartige genetische Marker, Z3276: Ein qPCR-Assay wurde für den Nachweis von Escherichia coli O157 entwickelt. Die qPCR wurde mit Propidium Monoazid (PMA)-Behandlung für Lebendzellerkennung kombiniert. Dieses Protokoll wurde modifiziert und auf eine 96-Well-Plattenformat für die einfache und einheitliche Behandlung einer Vielzahl von Proben geeignet ist...

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

Das Ziel dieser Studie war es, das Potenzial Kreuzkontamination Mechanismus von lebensmittelbedingten Krankheitserreger Listeria monocytogenes in einem Einzelhandels deli Einstellung zu demonstrieren. Diese Methode kann zu einer Vielzahl von unterschiedlichen Umgebungen angewendet, um Infektion mit Krankheitserregern zu verfolgen.

Tracking-Mikrobielle Kontamination in Einzelhandelsumgebungen mit fluoreszierenden Pulver - Ein Feinkost Einzelhandel Beispiel Umwelt

Ein Protokoll, das die integrierte Konzentration, Anreicherung und den kolorimetrischen Endpunktnachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern in großen Mengen landwirtschaftlichen Wassers beinhaltet, wird hier vorgestellt.  Das Wasser wird durch modifizierte Moore-Tupfer (MMS) gefiltert, die mit selektiven oder nicht-selektiven Medien angereichert sind, und der Nachweis erfolgt mit papierbasierten Analysegeräten (μPAD), die in bakterienindizierte kolorimetrische Substrate eingebettet...

Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonellen</em&gt; Spp. Und<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Von großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, funktionale Nanosensoren für die Portable, kostengünstig, zu synthetisieren und schnelle Erkennung von gezielt pathogene Bakterien durch eine Kombination von magnetischen Entspannung und Fluoreszenz Emission Modalitäten.

Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Ein Protokoll für die Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor bestehend aus eine Polymilchsäure Säure stabilisiert, gold-Nanopartikeln modifiziert, Siebdruck kohlenstoffelektrode Vibrio Parahaemolyticus erkennen wird vorgestellt.

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Campylobacter ist weltweit die Hauptursache für bakterielle lebensmittelbedingte Gastroenteritis. Obwohl Betriebe Maßnahmen ergreifen, um die Prävalenz in ihren Einrichtungen zu reduzieren, erreichen kontaminierte Produkte durchweg die Verbraucher. Die in den letzten zwölf Jahren entwickelte Technik adressiert die Grenzen bestehender Methoden zur Isolierung und zum Nachweis von Campylobacter spp. aus rohem Fleisch.

Nachweis und Isolierung von Campylobacter spp. aus rohem Fleisch

Erfahren Sie eine Methode zur Anreicherung und Detektion von Clostridium perfringens Toxinotypen in Lebensmitteln ohne anaerobe Kammern. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Stämmen B und D mit Epsilon-Toxin.

Anreicherung und Nachweis von Clostridium perfringens Toxinotypes in Einzelhandels-Lebensmittelproben

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