Aktivierte vernetzte Agarose für die schnelle Entwicklung von Affinity Chromatography Resins - Antikörpererfassung als Fallstudie

Monoklonale Antikörper dominieren den biopharmazeutischen Markt und werden typischerweise durch Protein-A-Chromatographie gereinigt. Das befolgende Harz ist ein wichtiger Kostentreiber während der Produktion, der sich auf den Preis von Antikörper-basierten Therapeutika auswirkt. Hier beschreiben wir einen neuen Affinitätsligand, der auf dem fluoreszierenden Protein basiert, das als Träger für das lineare Epitop des HIV-neutralisierenden Antikörpers 2F5 gelesen wird.

Im Allgemeinen ermöglicht unsere Methode die schnelle Erzeugung von Affinitätschromatographieharzen, die für die Erfassung monoklonaler Antikörper verwendet werden können. Wir haben diese Fähigkeit demonstriert, indem wir Antikörper 2F5 aus Rohpflanzenextrakt eingefangen haben. Wir haben die Aufnahmebedingungen und den Lösungspuffer optimiert, um die dynamische Bindungskapazität und die Harzwiederverwendbarkeit zu verbessern.

Unser Harz ermöglicht in der Regel lockerere Bedingungen als Protein A und hat das Potenzial, die Reinigungskosten monoklonaler Antikörper zu senken. Darüber hinaus kann das Harz leicht an andere Antikörper angepasst werden, die an lineare Epitope binden. Um dieses Verfahren zu beginnen, passen Sie die Konzentration der vorbereiteten Affinität Stadelandlösung so an, dass sie im Bereich von 5 bis 15 Gramm pro Liter liegt, wie im Versuchsdesign definiert.

Bewahren Sie die Lösung auf Eis auf, bis die Kupplungsreaktion bereit ist. Als nächstes füllen Sie eine Zwei-Milliliter-Spritze mit der DFE-Lösung. Und bereiten Sie einen Adapter vor, um die Spritzen auf NHS-aktivierten Kreuzlink-Agarosesäulen mit einem Bettvolumen von einem Milliliter zu montieren.

Für 10 Säulen, die für die Kopplung verwendet werden, bereiten Sie 30 Milliliter Deaktivierungslösung, 30 Milliliter Niedrig-pH-Lösung und einen Milliliter Speicherlösung vor. Dann 20 Milliliter einer Millimolaren Salzsäure in einem Rohr zubereiten. Und brüten Sie es mindestens 20 Minuten auf Eis.

Bereiten Sie eine Präzisionsskala vor, um den Durchfluss durch Brüche für alle Schritte während der Kopplungsreaktion zu überwachen. Öffnen Sie danach eine versiegelte NHS-aktivierte vernetzte Agarosesäule. Tragen Sie einen Puffertropfen auf den Adaptereinlass auf, um zu verhindern, dass Luft in die Spalte gelangt.

Montieren Sie den Spritzenadapter am Säuleneinlass. Waschen Sie die Säule mit sechs Millilitereeiskalteine Millimolar-Salzsäure, bei einer Durchflussrate weniger als ein Milliliter pro Minute. Mit einer Zwei-Milliliter-Spritze sofort 1,5 Milliliter DFE-Lösung bei einem Durchfluss von weniger als einem Milliliter pro Minute injizieren.

Und sammeln Sie den Durchfluss durch Fraktion auf einer Präzisionsskala für die nachfolgende Analyse. Versiegeln Sie die Säule an beiden Enden und brüten Sie für 15 bis 45 Minuten bei 22 Grad Celsius. Als nächstes injizieren Sechs Milliliter der Aktivierungslösung, gefolgt von sechs Millilitern niedriger pH-Lösung, bei einer Durchflussrate von weniger als einem Milliliter pro Minute, entfernen Sie nicht kovalent gebundene Liganden aus dem Harz.

Injizieren Sie sechs Milliliter der Aktivierungslösung, und inkubieren Sie die Säule für 15 Minuten. Danach sechs Milliliter Niedrig-pH-Lösung in die Säule injizieren. Gefolgt von sechs Millilitern der Aktivierungslösung.

Dann weitere sechs Milliliter niedrig pH-Lösung in die Säule injizieren. In jizieren Sie zwei Milliliter Speicherlösung in die Säule, und speichern Sie sie bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie zunächst 100 Milliliter des geklärten Pflanzenextrakts vor, der 2F5 enthält, oder des Überstandes für das bevorzugte zellbasierte Expressionssystem, das auch 2F5 enthält.

Als nächstes bereiten Sie den Ausgleichspuffer und den Illusionspuffer mit hoher Eisen-X-Stärke vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Spülen Sie das Chromatographiesystem mit den Puffern. Montieren Sie eine DFE-Affinitätsspalte auf dem Chromatographiesystem.

Und gleichgewichten mit fünf CV Ausgleichspuffer, mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute. Überwachen Sie die UV-Absorption mit 280 Nanometern. Dann laden Sie entweder 80 Milliliter des geklärten Pflanzenextrakts oder des Überstandes mit einer Durchflussrate von 5 Millilitern pro Minute auf die Säule.

Um eine Kontaktzeit von zwei Minuten zu garantieren. Sammeln Sie den Durchfluss durch Proben in zwei Milliliter-Fraktionen oder bahnbrechende Kurvenrekonstruktion. Bewahren Sie den Durchfluss durch Proben bei vier Grad Celsius auf, wenn eine sofortige Probenanalyse nicht möglich ist.

Danach die Säule mit 6CV Ausgleichspuffer waschen. Sammeln Sie eine Probe am Anfang, in der Mitte und am Ende der Wäsche. Verdünnen Sie den MAB2F5 mit fünf Volumen mit hohem Ionenstärke-Illusionspuffer.

Sammeln Sie die DFE-Fraktion, wenn das UV-Signal bei 280 Nanometer auf fünf Milli-Absorptionseinheiten über der Basislinie angestiegen ist. Optimieren Sie den Illusionspuffer für jedes Epitop-Antikörper-Paar, wie im Textprotokoll beschrieben. Das Fusionsprotein DFE wird in transgenen Tabakpflanzen exprimiert, die in einem Gewächshaus angebaut werden.

Die Gesamterholung von DFE beträgt 23,5 Milligramm pro Kilogramm. Bei einer Reinheit von über 90% Die absolute Menge an DFE, die auf dem Harz immobilisiert wird, steigt mit der Masse von DFE, die in die Säule injiziert wird, und Plateaus bei etwa 15 Gramm pro Liter, während die Kopplungsausbeute kontinuierlich abnimmt, wenn mehr DFE injiziert wird. Die DFE-Moleküle behalten ihre rote Blütenpracht auch nach der Kopplung.

Die Farbintensität entspricht der Gesamtmenge der immobilisierten DFE. Daher kann die Spaltenfarbe als einfacher Qualitätskontrollparameter verwendet werden, um die Kopplungseffizienz und die Spaltenqualität zu schätzen. Der rekombinante 2F5-Antikörper wird vorübergehend in Nicotiana Benthamiana-Pflanzen hergestellt, die in einem Phytotron angebaut werden.

Die Erfassung von 2F5 aus dem Rohpflanzenextrakt wird mit Affinitätssäulen getestet, gekoppelt mit etwa sieben Milligramm gereinigtem DFE. Eine Magnesiumchloridkonzentration von 1,25 Mol reicht aus, um 2F5 aus dem DFE-Affinitätsharz mit einer Erholung von fast 100% und einer Reinheit von ca. 97%, die mit Protein-A-Harzen vergleichbar ist, zu entkernen. Der DBC des DFE-Affinitätsharzes bei 10%2F5 Durchbruch sinkt linear im Laufe der 25 Zyklen auf etwa 15% des Ausgangswertes.

Wir haben einen Versuchsansatz verwendet, um die Kopplungskapazität unseres Affinitätsligands zu optimieren. Diese Bedingungen können in Zukunft auf andere Liganden abgestimmt werden. Unsere Methode verwendet floreszierendes Protein, um ein Sub-Carrier-Protein für den produktspezifischen Liganden zu fädeln.

Fügen Sie gleichzeitig einfach Funktionen als visuellen Qualitätsindikator für den Mobilisierungsvorgang hinzu und geben Sie dem Bediener ein sofortiges und intuitives Feedback.