Name: Forschungsmethoden zu Chloroplasten: Untersuchung der Zielerfassung, Lokalisierung und Wechselwirkungen von Chloroplastproteinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 45 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Untersuchung von Chloroplastenproteinimport, Lokalisierung und Wechselwirkungen in Arabidopsis thaliana. Diese Techniken umfassen in vitro- und in vivo-Assays, Subfraktionierung und BN-PAGE für die Analyse photosynthetischer Komplexe.

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<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+a+high+yield+of+Arabidopsis+chloroplasts+capable+of+efficient+import+of+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins.</a> Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Lee, J., Kang, H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+import+into+chloroplasts+using+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying protein import into chloroplasts using protoplasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+physiologically+active+thylakoids+and+their+use+in+energy-dependent+protein+transport+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+chloroplast+sub-compartments+from+Arabidopsis+for+the+analysis+of+protein+Localization+by+immunoblotting+or+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Salvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%3A+the+first+step+when+looking+for+information+about+subplastidial+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).</li>
<li>Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+chloroplast+translocon+protein+complexes+using+the+TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ycf2-FtsHi+heteromeric+AAA-ATPase+complex+is+required+for+chloroplast+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import.</a> Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thylakoid+membrane+protein+complexes+by+blue+native+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+preprotein+translocon+at+the+outer+envelope+membrane+of+chloroplasts+by+blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).</li>
<li>Chen, L. J., Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+megadalton+TOC-TIC+supercomplexes+as+major+mediators+of+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts.</a> Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).</li>
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forschungsmethoden zu chloroplasten: untersuchung der zielerfassung, lokalisierung und wechselwirkungen von chloroplastproteinen

Chloroplast Research Methods: Probing The Targeting, Localization And Interactions Of Chloroplast Proteins

Forschungsmethoden zu Chloroplasten: Untersuchung der Zielerfassung, Lokalisierung und Wechselwirkungen von Chloroplastproteinen

Chloroplasts are the organelles that define plants1. Along with many other metabolic, developmental and signaling functions, chloroplasts are responsible ...

Willkommen in den JoVE Methods Collections on Chloroplast Research Methods, kuratiert von unserem Gastredakteur Paul Jarvis. Diese Sammlung umfasst eine breite Palette von In-vitro- und in vivo-Techniken, die Proteinwechselwirkungen innerhalb von Chloroplasten charakterisieren. Forscher der Universität Oxford beschreiben eine in-vitro-Methode unter Verwendung isolierter Chloroplasten, die mit radioaktiv markierten Proteinen inkubiert werden, um deren Aufnahme zu überwachen.Diese Methode ist eine Weiterentwicklung früherer Ansätze, die zur Untersuchung des Chloroplast-Proteinimports in vitro verwendet wurden. Anschließend wird in einer ergänzenden Methode der Chloroplast-Proteinimport in vivo untersucht. Diese Methode verwendet die transienten Expression chimerischer Proteine und Protoplaste, um Proteingrößenänderungen und -lokalisationen mittels Immunblotting und Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.In diesem Methodenvideo untersuchten die Autoren das Thylakoid-Membransystem, das in Chloroplasten vorhanden ist. Durch die Isolierung der Membranen werden Proteintranslokationswege in Chloroplasten mittels SDS-PAGE- und Phosphorbildgebung aufgeklärt. Forscher in Frankreich wenden verschiedene Zentrifugationsmethoden an, um die in Chloroplasten vorkommenden Unterkompartimente zu isolieren.Diese isolierten zellulären Fraktionen werden anschließend mittels Immunoblotting und Proteomik analysiert, um Informationen über die suborganellare Lokalisation von Chloroplastenproteinen zu liefern. Anschließend nutzten Schweizer Forscher die Affinitätsreinigung von Chloroplast-Multiprotein-Komplexen, um die molekulare Maschinerie zu untersuchen, die am Proteinimport beteiligt ist. Insbesondere die Talk- und Zecken-Multiproteinkomplexe, die in Hüllmembranen eingebettet sind.In einem ergänzenden Ansatz charakterisieren Wissenschaftler den pflanzlichen Thylakoid-Proteinkomplex in Arabidopsis mit Blue Native PAGE, oder BN-PAGE, das die Trennung von Proteinkomplexen in ihrer natürlichen und funktionellen Form ermöglicht. Die Komplexe werden weiter über 2D-SDS-PAGE analysiert. Sie haben gerade einen Einblick in die verschiedenen Methoden bekommen, die zur Untersuchung von Chloroplastproteinen in unserer JoVE Methods Collection verwendet werden.Sie können die Artikel ausführlich auf der Webseite der Chloroplast Research Methods Collection einsehen, die über den Link auf dem Bildschirm angezeigt wird.

chloroplast-research-methods-probing-targeting-localization

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Hier beschreiben wir eine neue Methode Proteinimport in isolierte Chloroplasten unter Stress zu studieren. Das Verfahren ist schnell und einfach, und kann die Folgen verschiedener Stressbedingungen für Chloroplasten Proteinimport, und die entsprechenden regulatorischen Mechanismen zu studieren, angewendet werden.

Analyse von Protein-Import in Chloroplasten von gestressten Pflanzen isoliert

Hier präsentieren wir ein Interaktom-Capture-Protokoll, das auf Arabidopsis thaliana Blatt-Mesophyll-Protoplasten angewendet wird. Diese Methode beruht kritisch auf in vivo UV-Vernetzung und ermöglicht die Isolierung und Identifizierung von p-mRNA-bindenden Proteinen aus einer physiologischen Umgebung.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

Wir präsentieren Protokolle hierin für High Yield Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und Protein Transport Assays für die Chloroplasten Twin Arginin Translokation (CpTat), sekretorische (cpSec1) und Signalwege Anerkennung Teilchen (CpSRP).

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Proteine in Protoplasten zum Ausdruck zu bringen, mit PEG-vermittelten Transformationsmethode. Die Methode bietet einfach Ausdruck der interessierenden Proteine und effiziente Untersuchung von Protein-Lokalisierung und der Importvorgang für verschiedenen experimentellen Bedingungen in-vivo.

Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten

Wir stellen Ihnen hier eine bewährte und getestete Protokoll für die Reinigung der Chloroplasten Import Proteinkomplexe (TOC-TIC-Komplex) mit der TAP-Tag. Das einstufige Affinität-Isolierung-Protokoll kann potenziell auf jedem Protein angewendet werden und verwendet werden, um neue Interaktionspartner identifizieren durch Massenspektrometrie.

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Hier beschreiben wir eine Methode, um intakte Chloroplasten aus Arabidopsis Blättern und ihre drei Sub-Hauptfächer (Umschlag, Stroma und Thylakoids), reinigen mit einer Kombination von differenziellen Centrifugations, kontinuierliche Percoll Gradienten und diskontinuierliche Saccharose Steigungen. Die Methode ist wertvoll für Subplastidial und subzelluläre Lokalisierung der Proteine durch Immunoblotting und Proteomik.

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Viele Pflanzenarten verändern die Positionierung von Chloroplasten, um die Lichtabsorption zu optimieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein einfaches, selbst gebautes Instrument verwendet, um die Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana-Blättern zu untersuchen, wobei Veränderungen in der Lichtübertragung durch ein Blatt als Proxy verwendet werden.

Verwendung von Veränderungen in der Blattübertragung zur Untersuchung der Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana

Der Bedarf an neuen Ansätzen zur Untersuchung von Membrankontaktstellen (MCS) ist aufgrund des zunehmenden Interesses an der Untersuchung dieser zellulären Strukturen und ihrer Komponenten gestiegen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das bisher verfügbare Mikroskopietechnologien integriert, um intra- und interorganelle Proteinkomplexe, die sich an MCS befinden, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endogener intraorganeller Proteininteraktionen an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen durch Proximity-Ligation-Assays

Lernen Sie Methoden zur Untersuchung von Chloroplastenproteinimport, Lokalisierung und Wechselwirkungen in Arabidopsis thaliana. Diese Techniken umfassen in vitro- und in vivo-Assays, Subfraktionierung und BN-PAGE für die Analyse photosynthetischer Komplexe.

Forschungsmethoden zu Chloroplasten: Untersuchung der Zielerfassung, Lokalisierung und Wechselwirkungen von Chloroplastproteinen (Video) | JoVE Journal

Forschungsmethoden zu Chloroplasten: Untersuchung der Zielerfassung, Lokalisierung und Wechselwirkungen von Chloroplastproteinen

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