Name: High-Density DNA und RNA Mikroarrays - Photolithographische Synthese, Hybridisierung und Vorbereitung von großen Nukleinsäurebibliotheken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Lernen Sie die photolithographische Synthese von DNA- und RNA-Mikroarrays für die Molekularbiologie. Diese Methode ermöglicht die parallele Erzeugung hochdichter Nukleinsäurebibliotheken für Forschungsanwendungen.

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Diese Arbeit wurde vom Wissenschaftsfonds (FWF-Stipendien P23797, P27275 und P30596) und dem Schweizerischen Nationalfonds (Grant #PBBEP2_146174) unterstützt.

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Die Autoren bescheinigen, dass sie keine Verbindung zu einer gewinnorientierten Organisation haben.

Die Festphasen-DNA- und RNA-Synthese ist das Brot und die Butter jedes Nukleinsäure-Chemielabors, und obwohl die Zugabe der Photolithographiekomponente zugegebenermaßen eine komplexe Operation ist, ist die Mikroarray-Fertigung, die durch UV-Licht vermittelt wird, auch ein sehr zuverlässiger Prozess. . Darüber hinaus ist es die einzige verfügbare Methode für die In-situ-RNA-Synthese auf Mikroarrays. Dennoch gibt es, wie bei jedem mehrstufigen experimentellen Verfahren, genügend Raum für menschliches Versagen.
Der vielleicht wichtigste Schritt ist die Kopplung eines Phosphoramidites, da es sich um eine konstant ertragreiche chemische Reaktion handelt, um sich Oligonukleotide mit wenigen synthetischen Fehlern leisten zu können. In unserem Mikroarray-Syntheseprotokoll ist die Phosphoramiditkopplung für die Gesamtsynthesequalität noch wichtiger, da der Herstellungsprozess die Deckelung umgeht und die Oligonukleotidreinigung verhindert. Für alle lichtempfindlichen DNA- und RNA-Phosphoramidite wurden stufenweise Kopplungseffizienzen von über 99% berechnet, selbst für sehr kurze Kopplungszeiten (15 s)24, aber gelegentlich können geringere Kopplungsausbeuten auftreten, insbesondere bei dG-Amiditen. Die Stabilität der löslichen Phosphoramidite bei Raumtemperatur wurde bereits untersucht und war nachweislich von der Art der Nukleobase abhängig, wobei Guanosinphosphoramidite in nur wenigen Tagen zu einem umfangreichen Abbau neigen29, 30. Bei -25 °C wurden jedoch in ACN als 30 mM Lösung gelöste dG-Phosphoramidite für mehrere Wochen als stabil befunden. Die relative Instabilität von dG-Phosphoramiditlösungen bei Raumtemperatur bedeutet jedoch, dass sie nicht mehrere Tage am DNA-Synthesizer befestigt werden sollten.
Bei RNA-Phosphoramiditen ist die Kopplungsausbeute stark von der Phosphoramiditqualität (die durch 31P NMR-Spektroskopie beurteilt werden kann) und der Kopplungszeit abhängig. Kupplungszeiten von 5 Minuten für rA, rG, rC und 2 min für rU erscheinen notwendig. Tatsächlich fanden wir heraus, dass die Verkürzung der Kondensationszeit auf 2 min für alle RNA-Phosphoramidite zu deutlich niedrigeren Hybridisierungssignalen führte.
Der DNA-Synthesizer selbst, sowie die Reagenzien und Lösungsmittel, müssen sicherlich so sauber wie möglich sein, um die höchste Ausbeute an Oligonukleotid-Synthese zu erreichen. Unlösliches Material, Salze oder Partikel können sich jedoch im Laufe der Zeit in den Leitungen und Schläuchen des Fördersystems ansammeln, was zu einer allmählichen Abnahme des Verbrauchs von Reagenzien und Reaktanten führt. Wenn eine allgemeine Reinigung des Synthesizers ein geringes Ausgangsvolumen nicht auflöst, kann eine Erhöhung der Anzahl der Impulse eine alternative Lösung sein. Besonders nützlich bei geringem Phosphoramiditverbrauch kann die Leitung im Kopplungsprotokoll, die dem Pumpen eines Gemischs aus Phosphoramidit und Aktivator entspricht (dritte Linie des Kupplungsunterabschnitts in Tabelle 1 und Tabelle 2) von 6 auf 9 Impulse ohne nennenswerte negative Auswirkungen auf die Synthesequalität. Darüber hinaus hängt die Anzahl der Impulse des Aktivators, die benötigt werden, um den Amidit-Aktivator-Mix auf das Synthesesubstrat zu bringen (derzeit 6, vierte Zeile im Kopplungsunterabschnitt, siehe Tabelle 1 und Tabelle2), sowohl vom DNA-Synthesizer selbst als auch von Rohrlänge in der Synthesezelle. Diese Zahl kann angepasst werden, nachdem der Phosphoramidit durch eine farbige Lösung ersetzt und die Anzahl der Impulse gezählt wurde, die benötigt werden, um die farbige Mischung zur Kopplung auf das Glassubstrat zu schieben.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, dass die DNA- und RNA-Synthese gleichzeitig auf demselben Mikroarray verläuft. Hybriden von DNA und RNA können auch ohne Änderung der Array-Fertigungsprotokolle hergestellt werden, und solange das dreistufige Deprotection-Protokoll befolgt wird. Es sollte jedoch beachtet werden, dass reine RNA-Mikroarrays nur einen zweistufigen Deprotection erfordern: eine Decyanoethylierung zuerst mit Et3N, gefolgt von Hydroxyl- und Basenschutz mit Hydrazin. DNA-Nukleobasen wurden unter diesen Bedingungen als unvollständig degeschützt festgestellt und benötigen den zusätzlichen Schritt in EDA, um die vollständige Entfernung von Phenoxyacetylgruppen (Pac) zu bewirken. Diese zusätzliche Behandlung mit EDA ist kürzer (5 min) als für den Standard-Deprotection von DNA-Mikroarrays31, aber es reicht aus, um es nach den Triethylamin- und Hydrazin-Behandlungen zum Abschluss zu bringen. Darüber hinaus begrenzt eine kurze Reaktionszeit mit EDA die Exposition eines vollständig degeschützten RNA-Oligonukleotids an Grundbedingungen.
Ein Vorteil der In-situ-RNA-Array-Synthese gegenüber alternativen Methoden wie Spotting oder DNA-Transkription32,33,34 ist die Möglichkeit, den synthetisierten RNA-Mikrochip bis zur Anwendung in geschützter Form zu speichern und so die Risiko eines möglichen RNA-Abbaus. Postsynthetische Verfahren für RNA implizieren hingegen, dass Verbrauchsmaterialien und Reagenzien steril gehalten werden und dass die Handhabung unter RNase-freien Bedingungen erfolgt. Bemerkenswert erweise haben wir festgestellt, dass die Zugabe von RNase-Inhibitoren zum Hybridisierungsmix keine stärkeren Hybridisierungssignale für die RNA-Features lieferte.
Die Synthese von DNA-Bibliotheken auf einem basisempfindlichen Monomer ist komplexer als die Synthese einiger Kontrollsequenzen auf einer Oberfläche und als solche sicherlich anfälliger für Konstruktionsfehler. Geht man jedoch davon aus, dass der Sequenzentwurf (d. h. die Art und die Anzahl der Sequenzen) korrekt ist, bleibt die Umwandlung dieser Liste in eine Sammlung von Belichtungsmasken und einer geordneten Reihe von Kopplungszyklen ein einfacher Prozess. Es gibt jedoch wichtige Variationen von der Standard-Mikroarray-Synthese und ist entscheidend für eine erfolgreiche Herstellung eines Bibliotheksarrays mit hoher Dichte.
Zunächst wird ein grundempfindliches dT-Monomer als erstes Phosphoramidit nach der Synthese des Linkers gekoppelt. Die Kopplungsausbeute dieses Monomers (Abbildung 1) wurde als relativ gering befunden, etwa 85%28, weshalb Anstrengungen unternommen werden, um seine Einbaurate zu verbessern, entweder durch Erhöhung der AcN-Konzentration von 30 mM auf 50 mM oder durch Wiederholung der Kupplungsschritt: zwei aufeinander folgende Kupplungsreaktionen mit frischen Monomeren oder zwei separate, aber aufeinander folgende Kupplungszyklen.
Die zweite Änderung ist die Zugabe einer Carotin-Lösung in der Hinterkammer der Synthesezelle, die bequem 365 nm Licht absorbiert. Dies ist eine wichtige Änderung der Photolithographie-Einrichtung, da es verhindert, dass UV-Licht wieder auf das Array-Substrat reflektiert wird. Tatsächlich tritt nach dem Durchlaufen des interstitiellen Mediums zwischen den Substraten einfallendes UV-Licht durch den gebohrten Schlitten aus und erreicht den Quarzblock der Zelle. Die Fresnel-Gleichungen sagen voraus, dass 4 % des senkrecht einfallenden UV-Lichts von jeder der drei nachgeschalteten Luft-Glas-Schnittstellen (Ausgangsseite des 2. Substrats und beidseitig des Quarzblocks) und zurück auf das Synthesesubstrat reflektieren werden. zu unbeabsichtigter Exposition von photogeschützten Oligonukleotiden führen. Beugung und Streuung tragen auch zum "Off-Target"-Photodeprotection und damit zur Nukleotideinfügung bei, was sich direkt auf die Fehlerrate der Synthese auswirkt, aber diese Beiträge sind viel kleiner als Reflexionen und können hauptsächlich durch Reflexionen angegangen werden. Verringerung der Synthesedichte (Lücken zwischen den Merkmalen). Wir haben festgestellt, dass der Gehalt an Carotin-Lösung in der unteren Kammer der Zelle nur in den ersten Minuten der Arraysynthese leicht abnimmt und daher überwacht und nachjustiert werden muss.
Schließlich ist die dritte Änderung die Deprotection-Lösung, die EtOH durch Toluen ersetzt, das die geklammerte DNA-Bibliothek an die Oberfläche gebunden hält, vermutlich durch elektrostatische Wechselwirkungen. Wenn Sie nach dem ACN-Waschen eine kleine Menge Wasser auf den Synthesebereich auftragen, können Sie die Bibliothek bequem sammeln. Der Prozess ist jedoch nur erfolgreich, wenn der Wassergehalt in EDA und Toluen minimal ist, wodurch die Nukleinsäure im Deprotection-Cocktail völlig unlöslich wird. Alternativ können DNA-Bibliotheken mit Ammoniak 9,10,14,35vom Chip abgeklaut und dann durch Erhitzen der DNA-haltigen wässrigen Ammoniaklösung über Nacht weiter auf 55 °C erhitzt werden. Die Wiederherstellung von DNA-Bibliotheken mit Ammoniak ist jedoch nicht mit RNA kompatibel. RNA-Oligonukleotide auf einem basissturierbaren Substrat können von der Oberfläche mit dem oben beschriebenen EDA/Toluol-Verfahren eluiert werden, jedoch nur in der vorletzten Phase nach der zweistufigen Deprotection-Strategie Et3N und Hydrazin28.
Alternative Strategien zur Rückgewinnung von Oligonukleotidbecken aus Mikroarrays ohne die Notwendigkeit einer spezifischen Grundbehandlung existieren, sind grundsätzlich mit der Photolithographie kompatibel und setzen auf den Einsatz von Enzymen. Zum Beispiel kann ein einzelnes Deoxyuracil-Nukleotid das Ziel der Uracil-DNA-Glykosomalase (UDG) sein und aus dem Rest der DNA-Sequenz entfernt werden, oder eine einzelne RNA-Einheit kann durch RNase H Typ 2-Enzyme erkannt werden und die Phosphodiesterbindung 5' an die RNA , die 5' DNA Teil23.
Wir haben jetzt eine leistungsfähige, zuverlässige und hochdichte Methode für die Synthese von DNA, RNA und hybriden DNA/RNA-Mikroarrays. Diese können nicht nur als Plattformen für Hybridisierung oder Bindungstests36dienen, sondern stellen auch eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit dar, komplexe Nukleinsäurebibliotheken herzustellen. Für die DNA-basierte digitale Datenspeicherung kann die Mikroarray-Photolithographie zu einer potenziellen Lösung für den "Schreib"-Engpass (d. h. zur Kodierung von Informationen durch Synthese) werden. Der Erfolg bei der digitalen Codierung auf DNA und in der de novo Genassembly hängt von der Sequenztreue ab, die sich auf Syntheseebene in der Fehlerrate niederschlägt. Synthetische und optische Fehler in unseren aktuellen Array-Fertigungsprotokollen werden an anderer Stelle diskutiert und berichtet. Parallel dazu werden derzeit Anstrengungen unternommen, um den Fertigungsumfang und den Durchsatz weiter zu erhöhen.

Die praktische Anwendung von DNA-Mikroarrays wurde traditionell in der Untersuchung der Variationen der Genexpressionsniveaus zwischen zwei Zellpopulationen unter Verwendung komplementärer Stränge und Fluoreszenz als Nachweismethode1verwendet. Gelegentlich wagen sich DNA-Mikroarrays in Bindungsereignisse mit Nicht-Nukleinsäure-Liganden, wie Proteinen, mit einer Strategie der systematischen Sequenzpermutation, die einen umfassenden Überblick über die Bindungslandschaft bietet2,3, 4,5. Dieser Ansatz wandelt Mikroarrays effektiv von reinen Hybridisierungsflächen in Plattformen mit breiter Sequenzabdeckung um, was ein Vorteil für die Erforschung der reicheren und komplexeren Welt der RNA-Struktur und -Funktion wäre. Unterstützt durch die extrem effiziente Phosphoramidit-Kopplungsreaktion6können in situ synthetisierte DNA-Arrays nun auch als billige Quelle von DNA7angesehen werden, die angesichts der stetig steigenden Nachfrage nach Nukleinsäurematerial für genassembly8,9, DNA-basierte Nanostrukturen10, Informationsspeicherung oder Sequenzierung11,12. Ebenso dürften Sequenzierungstechnologien von der Entwicklung von Methoden profitieren, die sehr komplexe Mischungen von RNA-Oligonukleotiden ergeben13. In diesem Zusammenhang sind Array-Fertigungsprotokolle, die es ermöglichen, Oligonukleotide vor Ort und bei hoher Dichte zu synthetisiert, ideal positioniert, um den Bedürfnissen des schnell wachsenden Feldes der Nukleinsäurebiotechnologie gerecht zu werden. Bei einem so unterschiedlichen Feld wie der Biotechnologie kann der Zweck jeder Anwendung jedoch erfordern, dass DNA auf Mikroarray entweder bei hohem Durchsatz oder mit einer sehr geringen Menge an synthetischen Fehlern14,15oder beides hergestellt wird, was eine näherer Betrachtung der Syntheseprotokolle von DNA-Mikroarrays, die historisch gesehen in erster Linie für Hybridisierungs-Assays optimiert wurden. In der Zwischenzeit hat sich die In-situ-Synthese von RNA-Mikroarrays als ein schwieriges Unterfangen erwiesen, wobei die meisten Der Mitschwierigkeiten, die mit der Schutzgruppe für die 2'-OH-Funktion verbunden sind, in der Regel ein Silylmoiety in der Standard-Festphasensynthese, das mit reagenzienauf Fluor, Chemikalien, die mit Glas- oder Siliziumoberflächen nicht kompatibel sind. Diese Probleme und Herausforderungen in der DNA- und RNA-Mikroarray-Synthese waren in letzter Zeit Gegenstand einer vielzahln Arbeit, insbesondere mit dem Photolithographie-Ansatz16.
Die Photolithographie verwendet UV-Licht, um Oligonukleotide vor der Kopplung zu entsperren und erfordert Masken, um ein Muster der UV-Exposition zu konstruieren, wodurch das Wachstum von Oligonukleotiden räumlich organisiert und gesteuert wird. Physikalische Masken wurden durch computergesteuerte Mikrospiegel ersetzt, deren Neigung selektiv UV-Licht auf das Mikroarraysubstratreflektiert 17,18,19. Als UV-Quelle verwenden wir 365 nm Licht aus einer Hochleistungs-LED-Quelle20. Aktuelle photolithographische Setups sind mit Mikrospiegel-Arrays mit 1024 x 768 Spiegeln ausgestattet, was mehr als 780.000 individuell adressierbaren Spots ("Features") auf einer kleinen Fläche von nur 1,4cm2oder 1080p mit Arrays von 1920 x 1080 entspricht, oder >2 Millionen Spiegel. Jeder der Spiegel im Gerät hat somit eine direkte Kontrolle über die Sequenz, die auf dem entsprechenden Merkmal gewachsen ist. Mit Ausnahme von UV-Licht funktioniert die Photolithographie wie eine Festphasensynthesetechnik und übernimmt die zyklusbasierte Phosphoramiditchemie. Nur erfordert es eine völlig andere Schutzstrategie für die RNA-Synthese, um erfolgreich zu sein. Wir haben eine neue Serie von lichtempfindlichen RNA-Phosphoramiditen entwickelt, die Hydrazin-Labile-Schutzgruppentragen 21. Diese Monomere ermöglichen es, die RNA unter milden Bedingungen zu degeschützt zu machen, die die Integrität der Oberfläche nicht beeinträchtigen. Ein erster Deprotection-Schritt verwendet Triethylamin, um die Cyanoethylphosphodiester Schutzgruppen zu entfernen, während Hydrazin in einem zweiten, separaten Schritt verwendet wird, um diejenigen an den 2'-OH- und exozyklischen Aminfunktionen zu entfernen. Dabei können RNA-Oligonukleotide in der Länge von 30 nt und jeder Sequenz nun in situ auf mikroarrays22,23synthetisiert werden. Parallel dazu haben wir vor kurzem auch begonnen, uns mit den Fragen des Durchsatzes, der Qualität und der Geschwindigkeit in der DNA- und RNA-Photolithographie zu befassen. Wir haben die Kopplungseffizienzvon >99% für alle DNA- und RNA-Amiditen gemessen (Abbildung 1) und jeden einzelnen Schritt im Oligonukleotid-Dehnungszyklus untersucht, von der Oxidationszeit über die Wahl des Aktivators bis hin zur optimalen UV-Exposition24 , 25. Wir haben neue lichtempfindliche 5' Schutzgruppen eingeführt, die nur in Sekundenschnelle entfernt werden können, wodurch die Synthese von Hunderttausenden von 100 Mers in einen wenigen Stunden langen Prozess umgewandelt wird26. Wir haben auch den Durchsatz der Array-Fertigung verdoppelt, indem wir zwei Substrate gleichzeitig freisetzen27. Schließlich haben wir ein dT-Phosphoramidit eingeführt, das eine grundempfindliche Succinylgruppe enthält, um DNA- und RNA-Oligonukleotide zu spalten, zu sammeln und zu analysieren, was für die Bibliotheksvorbereitung von zentraler Bedeutung ist28.
Trotz des relativ banalen Aspekts der DNA- und RNA-Festphasensynthese, insbesondere für Nukleinsäurechemiker, bleibt die Mikroarray-Photolithographie ein nicht triviales Upgrade, das eine komplexe Einrichtung, eine sorgfältige Kontrolle und Überwachung des Prozesses erfordert, und separate Anweisungen für die postsynthetische Handhabung in Abhängigkeit von der Art des Oligonukleotids und der Art der Anwendung. In diesem Artikel möchten wir eine detaillierte Darstellung des gesamten Schrittweise-Verfahrens der In-situ-Synthese von DNA- und RNA-Mikroarrays durch Photolithographie, vom experimentellen Design bis zur Datenanalyse, mit Schwerpunkt auf der Vorbereitung von Instrumenten und Verbrauchsmaterialien. Wir beschreiben dann die postsynthetischen Deprotection-Methoden, die dem beabsichtigten Zweck der Mikroarray-Fertigung entsprechen (d. h. entweder Hybridisierung oder die Wiederherstellung von Nukleinsäurebibliotheken).

<table><tbody><tr><td>Funktionalisierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure >99,8%</td><td>Sigma</td><td>33209</td><td>Für RNA-Entschützung</td></tr><tr><td>CNC-Fräser</td><td>Stepcraft</td><td>300 CK</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR</td><td>1.07017.2511</td><td>Für Entschützung und Funktionalisierung</td></tr><tr><td>N-(3-Triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramid</td><td>Gelest</td><td>SIT8189.5</td><td>Silanisierungsreagenz</td></tr><tr><td>Nexterion Glass D Objektträger</td><td>Schott</td><td>1095568</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td></td><td>Orbital Shaker</td></tr><tr><td>Proclean 507 Ultraschall-Wasserbad</td><td>Ulsonix</td><td></td><td>Zur Reinigung von Objektträgern nach</td></tr><tr><td>dem Bohren Tickopur RW 77 Spezialreiniger</td><td>Sigma</td><td>Z860086</td><td>Zur Reinigung von Objektträgern nach dem Bohren</td></tr><tr><td>Microarray-Synthese</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 M Dicyanoimidazol in ACN</td><td>Biosolve</td><td>0004712402BS</td><td>Aktivator</td></tr><tr><td>0,7 XGA DMD</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td>Digital Micromirror Device</td></tr><tr><td>20 mM I2 in Pyridin/H2O/THF</td><td>Sigma</td><td>L860020-06</td><td>Oxidationsmittel</td></tr><tr><td>250 &mu; m dick Chemraz 584 Perfluorelastomer</td><td>FFKM</td><td></td><td>Untere Teflondichtung</td></tr><tr><td>2'-O-ALE RNA Phosphoramidite</td><td>ChemGenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>365 nm Hochleistungs-UV-LED</td><td>Nichia</td><td>NVSU333A</td><td></td></tr><tr><td>5'BzNPPOC DNA Phosphoramidite</td><td>Orgentis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'NPPOC DNA Phosphoramidite</td><td>FlexGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Biosolve</td><td>0001205402BS</td><td>Für die DNA-Synthese</td></tr><tr><td>Amidit-Verdünnungsmittel für die DNA-Synthese</td><td>Sigma</td><td>L010010</td><td>Zum Auflösen von Phosphoramiditen</td></tr><tr><td>Spaltbar dT</td><td>ChemGenes Basenempfindliches</td><td></td><td>Monomer für die Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biosolve</td><td>0004474701BS</td><td>Als Expositionslösungsmittel</td></tr><tr><td>DNA und RNA-Microarray-Entschützung </td>Ethylendiamin >99,5 % Sigma 3550 Für die Entschützung Expedite 8909 PerSeptive Biosystems DNA-Synthesizer <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrazinhydrat 50-60 % Hydrazin</td><td>Sigma</td><td>225819</td><td>Für die RNA-Entschützung</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Industrietaugliches PTFE-Band mit geringerer Dichte <td></td></tr><tr><td></td><td>Gasoila</td><td></td><td>Dünne, obere Teflondichtung</td></tr><tr><td>Pyridin >99%</td><td>Sigma</td><td>P57506</td><td>Für RNA-Entschützung</td></tr><tr><td>Triethylamin >99%</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td>Für RNA-Entschützung</td></tr><tr><td>&beta;-Carotin</td><td>Sigma</td><td>C9750</td><td>Für die Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>Hybridisierung und Scanning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Natriumkochsalzcitrat</td><td>Roth</td><td>1054.1</td><td></td></tr><tr><td>5'Cy3-markierter Komplementärstrang</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Für die Duplex-Hybridisierung</td></tr><tr><td>Biopur Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (10 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>R3961</td><td></td></tr><tr><td>EDTA molekularbiologische Qualität</td><td>Promega</td><td>H5031</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4100A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Microarray Scanner</td></tr><tr><td>Hybridisierungsschrank</td><td>Boekel Scientific</td><td>230500</td><td></td></tr><tr><td>MES Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>69889</td><td></td></tr><tr><td>MES Natrium</td><td>Sigma</td><td>M3058</td><td></td></tr><tr><td>NaCl >99,5%</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>SecureSeal SA200 Hybridisierungskammer</td><td>Grace BioLabs</td><td>623503</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td>Microarray-Zentrifuge</td></tr><tr><td>Tween-20 Molekularbiologie</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Datenextraktion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Für die Datenextraktion</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Microarray-Design</td></tr><tr><td>NimbleScan 2.1</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Entsalzung und Quantifizierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTip C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18s008</td><td>Pipettenspitzen zum Entsalzen</td></tr></tbody></table>

high-density dna und rna mikroarrays - photolithographische synthese, hybridisierung und vorbereitung von großen nukleinsäurebibliotheken

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Die Photolithographie ist eine leistungsstarke Technik zur Synthese von DNA-Oligonukleotiden auf Glasdias, da sie die Effizienz von Phosphoramidit-Kopplungsreaktionen mit der Präzision und Dichte von UV-Licht kombiniert, das von mikrometergroßen Spiegeln reflektiert wird. Die Photolithographie liefert Mikroarrays, die in nur wenigen Stunden von Hunderttausenden bis zu mehreren Millionen verschiedenen DNA-Sequenzen, 100 nt oder länger, aufnehmen können. Mit diesem sehr großen Sequenzraum sind Mikroarrays ideale Plattformen, um die Mechanismen von Nukleinsäure-Ligand-Wechselwirkungen zu erforschen, die besonders bei RNA relevant sind. Kürzlich berichteten wir über die Herstellung eines neuen Satzes von RNA-Phosphoramiditen, die mit der In-situ-Photolithographie kompatibel sind und anschließend zum Anbau von RNA-Oligonukleotiden, Homopolymeren sowie gemischten Basissequenzen verwendet wurden. Hier veranschaulichen wir detailliert den Prozess der RNA-Mikroarray-Fertigung, vom experimentellen Design bis zum Instrumental-Setup, Array-Synthese, Deprotection und Final-Hybridisierungs-Assay anhand einer Vorlage 25mer-Sequenz, die alle vier Basen als Beispiel enthält. Parallel dazu gehen wir über hybridisierungsbasierte Experimente hinaus und nutzen die Mikroarray-Photolithographie als kostengünstiges Tor zu komplexen Nukleinsäurebibliotheken. Dazu werden DNA-Mikroarrays mit hoher Dichte auf einem basisempfindlichen Monomer hergestellt, das es ermöglicht, die DNA bequem zu spalten und nach Synthese und Deprotection zu bergen. Das Fertigungsprotokoll ist so optimiert, dass die Anzahl der synthetischen Fehler begrenzt wird, und zu diesem Zweck wird eine Schicht von Carotin-Lösung eingeführt, um UV-Photonen zu absorbieren, die sonst auf die Synthesesubstrate zurückfallen könnten. Schritt für Schritt beschreiben wir den gesamten Prozess der Bibliotheksvorbereitung, vom Design bis zur Spaltung und Quantifizierung.

DNA- und RNA-Mikroarray-Hybridisierung Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse eines Hybridisierungstests, der an einem Mikroarray durchgeführt wurde, das die DNA- und RNA-Versionen einer 25mer-Sequenz enthält (5'-GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC-3' in DNA-Form). Der Scan in Abbildung 5A erscheint in einem grünen Format, das dem Anregungs-/Emissionsspektrum der Cy3-Fluoreszenz entspricht, wobei die Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten zwischen 0 und 65536 aufgezeichnet wird. Der Arrayentwurf folgte dem im Protokollabschnitt beschriebenen 25:36-Feature-Layout. Der Scan wird nach der richtigen Ausrichtung des Arrays angezeigt, wobei die obere linke Ecke mit der längsten Kette von Fiducial-Features gefüllt ist. Hier enthalten die handelsgebundenen Merkmale die DNA-Version des 25mer und sollten grundsätzlich immer ein positives Fluoreszenzsignal geben, um Scanausrichtung und Datenextraktion durchzuführen. Das hybridisierte Mikroarray sollte gleichmäßig hell erscheinen, wobei die Ränder des Synthesebereichs jedoch in der Regel heller als das Zentrum (bis zu 50% heller) sind. Die große Anzahl von Sequenzreplikationen, die zufällig über das Gebiet verteilt sind, reduziert die Auswirkungen räumlicher Artefakte. Hier wurde jede Sequenz (DNA und RNA) an 2.000 zufälligen Stellen synthetisiert. Es gibt typischerweise niedrige Fluoreszenzrauschen (Hintergrund), &lt;50 a.u., was zu einem Signal-Rausch-Verhältnis in der Größenordnung von 200:1 bis 800:1 in Hybridisierungstests führt. Nach der Datenextraktion werden die Fluoreszenzintensitäten gemittelt und mit sD geplottet.
Die absoluten Fluoreszenzwerte zwischen den Experimenten sind signifikant variabel. Hier zeigen wir die Ergebnisse für drei unabhängige Synthesen mit den gleichen Fertigungsparametern und der gleichen postsynthetischen Handhabung. Die 25mer-DNA, wenn sie mit ihrem komplementären Cy3-markierten DNA-Strang hybridisiert wird, liefert Fluoreszenzsignale von 20.000 bis 30.000, sehr selten über oder unter. Die 25mer-RNA, wenn sie mit der gleichen Cy3-markierten DNA-Ergänzung hybridisiert wird, wird Fluoreszenzintensitäten auf die entsprechenden Merkmale von 15.000 bis 20.000 geben. Die Fluoreszenzintensität der RNA/DNA-Duplexe wird jedoch gelegentlich unter 8.000 sinken, wenn die entsprechenden DNA/DNA-Duplexe noch im Bereich von 20.000-30.000 fluoreszieren. In solchen Fällen können die Ergebnisse für RNA als suboptimal angesehen werden. Ein Synthese- oder Hybridisierungsversagen, entweder für DNA oder RNA, wird sofort beim Scannen aus dem offensichtlichen Mangel an Fluoreszenz auffallen. Es gibt mehrere Möglichkeiten für die RNA-Synthese, entweder zu scheitern oder teilweise erfolgreich zu sein, und sie werden im Diskussionsteil skizziert.
Bibliotheksdeschutz, Spaltung und Wiederherstellung Je nach Komplexität und Dichte der Bibliothek können die Form und umriss des synthetisierten Arrays ohne Vergrößerung, aber unter richtiger Beleuchtung (Abbildung 4) gesehen werden, wobei die DNA noch in geschützter Form ist. Nach dem Deschutz mit EDA/Toluol und vor dem Zusatz von Wasser, um die spaltete Bibliothek zu sammeln, kann der Synthesebereich, der die jetzt degeschützten Oligonukleotide enthält, als hydrophile Zone auffallen, wenn der Rest der Glasrutsche erscheint mit einer trüben hydrophoben Schicht bedeckt. Die direkte Beobachtung des Synthesebereichs hängt von der Gesamtfläche ab, die zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet wird: Eine stärkere Nutzung des Synthesebereichs wird einer größeren Chance einer klaren Unterscheidung zwischen hydrophilen und hydrophoben Regionen an der Oberfläche entsprechen. Umgekehrt sind Bibliotheken, die mit weniger Spiegeln und mit kleineren Features synthetisiert werden, möglicherweise nicht sofort beobachtbar.
In ähnlicher Weise ist die Menge der wiedergewonnenen DNA nach der Entsalzung direkt proportional zur Gesamtfläche, die für die Synthese verwendet wird. Wenn alle Merkmale für die Oligonukleotid-Synthese verwendet werden, sollte das Spaltungs- und Rückgewinnungsverfahren zwischen 25 und 30 pmol DNA ergeben. Eine 10%ige Nutzung des Synthesebereichs wird daher nur etwa 3 pmol DNA ermöglichen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> Abbildung 1 . Chemische Strukturen der DNA- und RNA-Phosphoramidite, die bei der Oligonukleotidsynthese durch Mikroarray-Photolithographie verwendet werden. Standard-Nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) lichtempfindliche Schutzgruppen am 5'-OH werden in der regulären DNA- und RNA-Mikroarraysynthese zur Hybridisierung eingesetzt. Für die Synthese komplexer DNA-Bibliotheken wird am 5'-OH das photolabile Benzyl-NPPOC (BzNPPOC) bevorzugt, da BzNPPOC doppelt so schnell entfernt wird wie NPPOC, was die Gesamt-Mikroarraysynthesezeit deutlich reduziert. DNA-Oligonukleotide für Bibliotheken erfordern auch die Kopplung eines cleavablen dT-Monomers am 3'-Ende. Dieses Monomer, das eine Succinylester-Funktion trägt, wird während des Deschutzes zerklaut tappt, so dass die DNA aus dem Mikrochip gesammelt werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> Abbildung 2 . Beispiel für eine Maske als Bilddatei, die während der UV-Bestrahlung an das Mikrospiegelgerät gesendet wird. Die weißen Pixel entsprechen Spiegeln, die in der Position "ON" gekippt werden und UV-Licht auf die Synthesezelle reflektieren. Schwarze Pixel entsprechen" OFF"-Spiegeln, bei denen das UV-Licht von der Zelle weg reflektiert wird. Weiße Pixel ermöglichen daher die Kopplung des nächsten eingehenden Phosphoramidites auf die Oligonukleotide, die an den entsprechenden Merkmalen auf den Glassubstraten zu finden sind. Oligonukleotide synthetisiert auf den Features, deren entsprechende Spiegel sind, in dieser Maskendatei, schwarze Pixel bleiben jedoch während des nächsten Kopplungsereignisses inert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> Abbildung 3 . Fotos der Mikroarray Photolithographie optische und Synthese-Setup. (A) Optischer Schaltkreis für UV-Belichtung. UV-Licht der UV-LED wird zunächst durch ein rechteckig-querschnittsförmiges Lichtrohr homogenisiert und dann auf die Mikrospiegel reflektiert. Mikrospiegel, die in eine "OFF"-Position gekippt wurden, reflektieren UV-Licht von der Synthesezelle weg, aber Mikrospiegel in der Position "ON" reflektieren Licht auf die Synthesezelle, die sich auf der Brennebene befindet, indem sie zuerst ein 1:1 Offner-Relais passieren. Bildgebungssystem. (B) Die Synthesezelle besteht nach der Montage aus einem bohrenden Schlitten, der zuerst auf den Quarzblock der Zelle gelegt wird und durch eine dicke PTFE-Dichtung getrennt ist (nicht dargestellt). Ein zweiter, nicht gebohrter Schlitten wird dann über dem gebohrten Schlitten positioniert, der durch eine dünne PTFE-Dichtung getrennt ist. Ein Metallrahmen (nicht dargestellt) hält die Baugruppe zusammen. (C). Zur Bibliotheksvorbereitung wird die Kammer zwischen Quarzblock und Bohrschlitten nach der Befestigung der Synthesezelle an der Brennebene des einfallenden UV-Lichts mit einer 1%-Lösung von .-carotin in CH2Cl2gefüllt. Dazu wird ein zusätzlicher Ein- und Auslassschlauch am Quarzblock befestigt und die orangenlösung fließt von der rechten bis zur linken Position. Der Fluss von Reagenzien und Lösungsmitteln für die Synthese wird in weißen Pfeilen dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> Abbildung 4 . Der Synthesebereich ist in der Regel mit bloßem Augesichtbar. Hier ist direkt nach der Synthese eine DNA-Bibliothek auf der Glasoberfläche zu sehen, wobei die DNA noch in geschützter Form ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> Abbildung 5 . Hybridisierungs-Assays zu den 25mer-DNA- und RNA-Sequenzen, die in situ auf Mikroarrays synthetisiert werden. (A) Fluoreszenzscan des gesamten hybridisierten DNA- und RNA-Mikroarrays. 25mer-DNA- und RNA-Oligonukleotide werden zu ihren Cy3-markierten Komplementärsträngen hybridisiert. Das Array wurde mit einem Laser mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm mit einer Auflösung von 5 m gescannt. (B) Fluoreszenzintensitäten (willkürliche Einheiten) der DNA:DNA und RNA:DNA-Duplexe in drei separaten Experimenten. Die hellgrünen Daten für in situ synthetisierte RNA-Oligonukleotide können im Vergleich zur Fluoreszenzintensität der entsprechenden DNA-Sequenzen als suboptimal betrachtet werden. Fehlerleisten sind SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> Abbildung 6 . Schematische Darstellung des Deprotection-, Spaltungs- und Wiederherstellungsverfahrens für DNA-Bibliotheken, die auf Mikroarrays synthetisiert werden. DNA-Sequenzen werden auf einem basisempfindlichen, spaltbaren dT-Nukleosid (im vergrößerten Bereich dargestellt) angebaut. Nach der Synthese lässt der Deschutz der DNA-Oligonukleotide (Basisschutzgruppen werden als rote Kugeln dargestellt) in EDA/Toluol das degeschützte Material elektrostatisch an die Oberfläche gebunden und kann dann durch Auftragen einer kleinen Menge Wasser auf den synthetisierten Bereich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> Abbildung 7 . Repräsentatives Absorptionsspektrum (220 - 350 nm) einer geklammerten, entsalzten DNA-Bibliothek mit 4.000 verschiedenen Sequenzen, 100 nt lang. Insgesamt wurden 940 ng DNA aus einer einzigen Arraysynthese isoliert, was 30 pmol DNA-Gesamtmenge oder 15 pmol pro Glassubstrat entspricht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> Tabelle 1. Repräsentatives Zyklusprotokoll für Kopplung/Oxidation/Photodeprotection von 5'-BzNPPOC-dA unter der Annahme, dass der entsprechende Phosphoramidit auf Port "A" geladen wurde. Die Kopplungszeit (in Sekunden) wird in der Linie "Paarmonomer" angezeigt. Die UV-Photodeprotektionszeit, hier einer Strahlungsenergie von 3 J/cm2 (BzNPPOC Photochemie) entspricht, wird als Zeit zwischen den beiden "Event 2 Out"-Kommunikationssignalen berechnet.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> Tabelle 2. Repräsentatives Zyklusprotokoll für Kopplung/Oxidation/Photodeprotection von 5'-NPPOC-rA unter der Annahme, dass der entsprechende RNA-Phosphoramidit auf Port "A" geladen wurde. Die Kopplungszeit (in Sekunden) wird in der Linie "Paarmonomer" angezeigt. Die UV-Photodeschutzzeit, hier einer Strahlungsenergie von 6 J/cm2 (NPPOC Photochemie) entspricht, wird als Zeit zwischen den beiden "Event 2 Out"-Kommunikationssignalen berechnet.

In diesem Artikel stellen wir neue Entwicklungen in der Synthese und Anwendung von Nukleinsäure-Mikroarrays vor, die vor Ort hergestellt werden. Insbesondere zeigen wir, wie die Protokolle für die DNA-Synthese auf RNA erweitert werden können und wie Mikroarrays verwendet werden können, um wiederholbare Nukleinsäurebibliotheken zu erstellen.

High-Density DNA und RNA Mikroarrays - Photolithographische Synthese, Hybridisierung und Vorbereitung von großen Nukleinsäurebibliotheken

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

DNA- und RNA-Mikroarrays sind sehr nützlich, um die Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Proteinen zu untersuchen, aber sie sind auch eine bequeme Methode für die Erstellung von Sequenzbibliotheken. Die Photolithographie ermöglicht die parallele Synthese hunderttausender einzigartiger Sequenzen und ist derzeit die einzige direkte Methode zur RNA-Synthese auf Mikroarrays. Die in situ photolithographische Synthese von Mikroarrays kann auch auf chemisch modifizierte Oligonukleotide erweitert werden, beispielsweise mit zwei Primfluor-Peptid-Nukleinsäuren.Den Prozess der Mikroarray-Fertigung und -Handhabung zu sehen, kann helfen zu verstehen, wie diese komplexe Maschineausweise aus der bekannten Standard-Festphasen-DNA-Synthese entwickelt wurde. Beginnen Sie dieses Verfahren mit microarray-Design und Slide-Funktionalisierung, wie im Textprotokoll beschrieben. Schalten Sie die UV-LED des DNA-Synthesizers und ihren Lüfter ein.Befestigen Sie ein UV-Intensitätsmessgerät am Brennpunkt des eingehenden UV-Lichts und schalten Sie es ein. Starten Sie auf dem Computer die WiCell Controller-Software. Schalten Sie das Mikromere-Gerät ein und initialisieren Sie es.Laden Sie eine weiße Maskendatei, indem Sie mit der rechten Maustaste auf DMD klicken und dann das Bild laden auswählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das UVS-Symbol und wählen Sie den UV-Verschluss öffnen. Lesen Sie den Leistungswert auf dem Intensitätsmesser und zählen Sie 60 Sekunden.Lesen Sie nach 60 Sekunden den Energiewert erneut und notieren Sie sich die Anfangs- und Endwerte. Schließen Sie den Verschluss, indem Sie den UV-Verschluss schließen und schalten Sie den Intensitätsmesser aus. Berechnen Sie den durchschnittlichen UV-Intensitätswert in Milliwatt pro Zentimeter Quadrat.Laden Sie in der WiCell-Software die Auftrags-, Sequenz- und Protokolldateien in ihre jeweiligen Unterfenster, und klicken Sie dann auf Senden, um die Sequenz- und Protokolldateien an den DNA-Synthesizer zu senden. Um die Synthesezelle zu montieren, legen Sie eine dicke Perfluorelastomerdichtung auf den Quarzblock der Zelle. Legen Sie dann einen gebohrten, funktionalisierten Mikroskopschlitten auf die erste Dichtung und überprüfen Sie, ob sich die Löcher auf den Dias mit dem Ein- und Auslassschlauch der Synthesezelle verbinden.Legen Sie eine zweite, dünne Polytetrafluorethylendichtung über den gebohrten Schlitten, der die beiden Löcher umgibt. Platzieren Sie schließlich eine zweite, funktionalisierte, aber unrillierte Rutsche auf der zweiten Dichtung. Legen Sie nun einen 4-Schrauben-Metallrahmen auf die montierte Doppelsubstratzelle Und ziehen Sie die Schraube mit einem Drehmomentschrauber auf die gleiche Spannkraft.Befestigen Sie den Einlass und den Auslassschlauch am DNA-Synthesizer. Prime die Acetonitril-Waschlinie und überprüfen Sie den richtigen Fluss von Acetonitril durch die Substrate. Messen Sie das Acetonitrilvolumen an der Abfalllinie, nachdem Sie sieben Zyklen der Acetonitrilgrundierung durchlaufen haben.Dieses Volumen sollte zwei Milliliter betragen. Befestigen Sie die Synthesezelle an der Brennebene des eingehenden UV-Lichts. Bei der Bibliotheksvorbereitung eine zusätzliche Ein- und Auslassleitung an der Rückseite der Zelle befestigen und die hintere Kammer mit den zwei Millilitern der Betacarotinlösung füllen.Starten Sie die Synthese, indem Sie zuerst in der WiCell-Software auf Ausführen klicken. Drücken Sie beim ersten Wartebefehl in der Auftragsdatei auf den DNA-Synthesizer. Nach der Synthese von regulären Mikroarrays trennen Sie die Zelle vom Synthesizer und zerlegen Sie die Zelle.Verwenden Sie einen Diamantstift, um die Synthesenummer auf die Glasgleitet zu ätzen. Ätzen Sie die Zahl auf der nicht synthetisierten Fläche jeder Folie. Die Dias in 50 Milliliter Zentrifugenrohre übertragen und bis zur weiteren Verwendung in einem ausgetrockneten Bereich lagern.Nach der Synthese von Bibliotheksmikroarrays zuerst die Betacarotin-Lösung aus der Kammer abtropfen lassen und dann die Kammer zweimal waschen, indem sie fünf Milliliter Methylenchlorid durchfließen, bevor sie abgelassen wird. Für DNA-Mikroarry-Deprotection, füllen Sie ein Glasglas mit 20 Milliliter Ethanol und 20 Milliliter EDA. Legen Sie die dna-only-Mikroarrays vertikal in das Glas, schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Dias für zwei Stunden bei Raumtemperatur deprotectieren.Nach zwei Stunden die Dias mit einer Pinzette abholen und gründlich mit doppelt destilliertem Wasser abspülen. Trocknen Sie die Dias in einer Mikroarray-Zentrifuge für einige Sekunden, bevor Sie sie in einem Trockenbaugerät lagern. Für den RNA-Mikroarray-Deprotection eine trockene Lösung von 20 Milliliter Triethylamin und 30 Milliliter Acetonitril in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr vorbereiten.Übertragen Sie ein RNA-Mikroarray-Dia in das Zentrifugenrohr, schließen Sie den Deckel und wickeln Sie ihn mit Kunststoff-Dichtungsfolie. Schütteln Sie das Zentrifugenrohr auf einem Orbital-Shaker eine Stunde und 30 Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig. Als nächstes entfernen Sie den Schlitten und waschen Sie zweimal mit 20 Milliliter trockenem Acetonitril, bevor Sie in einer Mikroarrayzentrifuge für ein paar Sekunden trocknen.Nach dem ersten Deprotection-Schritt die RNA-Folie in die Hydrazinhydratlösung übertragen, den Deckel schließen und mit Kunststoff-Dichtungsfolie umwickeln. Nach zwei Stunden sanftem Schütteln auf einem Orbital-Shaker, entfernen Sie die Rutsche und waschen Sie sie zweimal mit 20 Milliliter trockenem Acetonitril. Dann trocknen Sie in einer Mikroarray-Zentrifuge für ein paar Sekunden.Wenn das RNA-Mikroarray auch DNA-Nukleotide enthält, fahren Sie mit einem dritten Deprotection-Schritt fort. Fügen Sie das DNA/RNA-Mikroarray in eine 50-Milliliter-Röhre mit einer 1-zu-eins-ETHANOL-Lösung nach 5 min bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Schlitten und waschen Sie das Mikroarray zweimal mit 20 Milliliter sterilem Wasser. Trocknen Sie die Rutsche in einer Mikroarray-Zentrifuge und lagern Sie sie in einem Trockenschrank.In einem 1,5 Milliliter sterilen Mikrozentrifugenrohr bereiten Sie den Hybridisierungspuffer vor, der Cy3-markierte DNA enthält, wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen und wirbeln Sie die Lösung. Legen Sie vorsichtig eine selbstklebende 300-Mikroliter-Hybridisierungskammer über den Synthesebereich auf jedem Schlitten und jeder Pipette in die Hybridisierungslösung.Bedecken Sie die Löcher der Kammer mit Klebepunkten und wickeln Sie die gesamte Rutsche in Aluminiumfolie. Legen Sie den Mikroarray-Dia in den Hybridisierungsofen, decken Sie ihn ab und lassen Sie es zwei Stunden lang sanft bei der gewählten Hybridisierungstemperatur drehen. Nach zwei Stunden die Rutsche lösen, die Aluminiumfolie entfernen, die Hybridisierungslösung auspipetten und die Hybridisierungskammer vorsichtig abreißen.Übertragen Sie die Dias in ein Zentrifugenrohr mit 30 Millilitern Nicht-Stringent Wash Buffer. Zwei Minuten bei Raumtemperatur kräftig schütteln. Das Dia in ein Zentrifugenrohr mit 30 Milliliter stringenten Waschpuffern geben und eine Minute lang kräftig schütteln.Übertragen Sie schließlich das Dia in ein Zentrifugenrohr mit 30 Millilitern Final Wash Buffer. Schütteln Sie für ein paar Sekunden. Trocknen Sie den Schlitten in einer Mikroarray-Zentrifuge.Platzieren Sie nun das trockene Mikroarray, den Synthesebereich nach unten, in den Diahalter des Mikroarray-Scanners. Um DNA-Bibliotheken zu deprotecten und zu spalten, tauchen Sie das Dia in die Spaltungslösung ein, in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Schließen Sie das Rohr und wickeln Sie es mit Kunststoff-Dichtungsfolie, bevor Sie sich bei Raumtemperatur zwei Stunden lang sanft in einem Orbitalshaker drehen.Nach zwei Stunden die Rutsche entfernen und zweimal mit 20 Millilitern sorgfältig trockenem Acetonitril waschen, bevor sie an der Luft trocknen. Mit einer Pipette 100 Mikroliter steriles Wasser über den nun erkennbaren Synthesebereich auftragen. Pipetdiere die Lösung ein paar Mal nach oben und unten, bevor sie in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen wird.Wiederholen Sie den Vorgang und kombinieren Sie das Mikroarray-Eluat in das gleiche Rohr. Verdampfen Sie den Chip bis zur Trockenheit und lösen Sie ihn dann wieder in 10 Mikroliter nukleasefreier H2O auf. Hier sind die Ergebnisse eines Hybridisierungstests zu sehen, der an einem Mikroarray durchgeführt wurde, das die DNA- und RNA-Versionen einer 25mer-Sequenz enthält.Der Scan in erscheint in einem grünen Format, das dem Anregungs- und Emissionsspektrum der Cy3-Fluoreszenz entspricht, wobei die Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten aufgezeichnet wird. Die absoluten Fluoreszenzwerte zwischen den Experimenten sind signifikant variabel. Die Ergebnisse für drei unabhängige Synthesen mit den gleichen Fertigungsparametern und der gleichen postsynthetischen Handhabung werden angezeigt.Die 25mer-DNA, wenn sie zu ihrem komplementären Cy3-markierten DNA-Strang hybridisiert wird, liefert Fluoreszenzsignale im Bereich von 20.000 bis 30.000, sehr selten über oder unter. Die 25mer-RNA, wenn sie mit der gleichen Cy3-markierten DNA-Ergänzung hybridisiert wird, wird Fluoreszenzintensitäten auf die entsprechenden Merkmale von 15.000 bis 20.000 geben. Die Fluoreszenzintensität der RNA/DNA-Duplexe sinkt jedoch gelegentlich unter 8 000, wenn die entsprechenden DNA/DNA-Duplexe noch im Bereich von 20.000 bis 30.000 fluoreszieren.In solchen Fällen können die Ergebnisse für RNA als suboptimal angesehen werden. Wie bei jedem anderen RNA-basierten Experiment ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass RNA-Mikroarrays empfindlich auf Abbau reagieren und unter sterilen Bedingungen behandelt werden sollten. Nukleinsäurebibliotheken, die aus Mikroarrays gesammelt werden, können in der DNA- oder RNA-Sequenzierung sowie bei der Kodierung digitaler Informationen über DNA verwendet werden.Der NED erzeugt ein intensives UV-Licht, das nicht direkt betrachtet werden sollte. Aus diesem Grund ist es ratsam, Schutzbrillen zu tragen, während das Gerät in Gebrauch ist.

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