Name: Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von CAR T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie unter Erhalt ihrer funktionellen Kompetenz. Diese Methode optimiert die Zellqualität und verbessert die Wirksamkeit bei der Krebsbehandlung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Finanzierung durch Novartis Pharmaceuticals durch eine Forschungsallianz mit der University of Pennsylvania (Michael C. Milone) sowie den St. Baldrick es Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi) unterstützt.

Alle Tierstudien werden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania genehmigt.
1. T-Zellaktivierung, Transduktion und Erweiterung
<ol><li>Aktivieren Sie frische oder kryokonservierte primäre menschliche T-Zellen, indem Sie mit Anti-CD3/CD28-Magnetperlen (z. B. Dynabeads) im Verhältnis 3 Perlen pro T-Zelle in 6-Well-Zellkulturschalen mischen. Kultur-T-Zellen in X-VIVO 15 Medium ergänzt mit 5% normalem humanem AB-Serum, 2 mM L-Glutamin, 20 mM HEPES und IL2 (100 Einheiten/ml). Halten Sie T-Zellen bei einer Konzentration von 106 T-Zellen/ml während der Expansion. Kultur-T-Zellen bei 37 °C, 20%O2und 95% Luftfeuchtigkeit mit 5%CO2.</li>
	<li>Nach der nächtlichen Stimulation lentiviralen Überstand zu aktivierten T-Zellen hinzufügen. Berechnen Sie das Volumen des Überstandes, der notwendig ist, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von 3-5 zu erreichen. HINWEIS: Das CD19-BB-CAR-Lentivirus-Plasmid besteht aus einem CD8-Scharnier, einer 4-1BB-Costimulatorei und einer CD3-Signalisierungsdomäne21. Cd19-BB-Lentiviralüberstand wurde wie zuvor beschrieben21erzeugt.</li>
	<li>Sammeln Sie am 3. Tag ein repräsentatives Aliquot von Zellen zur Kryokonservierung. Entfernen Sie vor der Kryokonservierung die magnetischen Perlen durch sanfte Pipettierung und magnetische Trennung. Gefriermedium mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) mit 0,5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) zubereiten und bis zur Verwendung in 4 °C lagern.<ol>
<li>Zentrifugen-T-Zellen bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml PBS hinzu. Zentrifugenzellen bei 300 x g für 5 min und entsorgen die PBS.</li>
		<li>Das Zellpellet in 1 ml kaltem Kryokonservierungsmedium wieder aufhängen. T-Zellen in einem gekühlten Gefrierbehälter einfrieren und bei -80 °C für 48 h lagern. Die gefrorenen Zellen in flüssigen Stickstoff übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie den Rest der T-Zellen einmal in 5 ml PBS, um den Restvektor zu eliminieren. Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min. Dekantieren Sie das PBS und setzen Sie das Zellpellet in T-Zellkulturmedium in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml wieder auf.</li>
	<li>Teilen Sie die T-Zellen in zwei Kulturen auf, die für Tag 5 und Tag 9 bestimmt sind. Zähl-T-Zellen nach Durchflusszytometrie mit Zählperlen (Materialtabelle) und monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD4 und CD8 sowie einem Lebensfähigkeitsfarbstoff (Materialtabelle).<ol>
<li>Zur Messung der T-Zellkonzentration können Sie einen Master-Mix mit 500 l PBS, 5 l Zählperlen, 10 l 7-Amino-Actinomycin D-Zelllebensfähigkeitslösung, 4 l CD4-FITC und 4 l CD8-APC, vorbereiten. Fügen Sie dem Master-Mix 40 L T-Zellen hinzu und messen Sie die Zellkonzentration anhand der Durchflusszytometrie basierend auf der Anzahl der lebenden T-Zellen/Perlenzahlen. Refeed, um die Kulturen in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml jeden zweiten Tag zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zählen Sie am 5. Tag die Kulturen des 5. Tages, wie in den Schritten 1.3 und 1.5 beschrieben.</li>
	<li>Waschen Sie am 7. Tag 0,5 x 106 T-Zellen in PBS und setzen Sie sie in 100 l Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungspuffer (FACS) wieder auf. Detektieren Sie die EXPRESSION von CAR-Oberflächenproteinen durch Immunfärbung mit einem fluoreszierend konjugierten Anti-CAR19-Idiotyp durch Durchflusszytometrie.</li>
	<li>Zählen Sie am 9. Tag die Kulturen und das Kryokonserven, wie in Schritt 1.3 beschrieben.</li>
</ol>2. Phänotypische Beurteilung der T-Zell-Differenzierung
<ol><li>Vorbereiten eines Master-Mix mit vortitierten Antikörpern für Anti-CD3-BV605 (Klon OKT3), Anti-CD14-Pacific Blue (PB) (Klon HCD14), Anti-CD19-PB (Klon HIB19), Anti-CD4-BV510 (Klon OKT4), Anti-CD8–H7APC (Klon SK1), Anti-CCR7–FITC (Klon 150503), Anti-CD45RO-PE (Klon UCHL1), Anti-CD27–PE-Cy7 (Klon 1A4CD27), Anti-CD95–PerCP-Cy5.5 (Clone DX2) und anti-CAR19-APC.</li>
	<li>Bereiten Sie individuelle Fluoreszenz-Minus-Eins-Steuerungen (FMO) für Anti-CD45RO-PE, Anti-CCR7-FITC, Anti-CD27-PE-Cy7 und Anti-CD95-PerCP-Cy5.5 vor, um positiv gefärbte Zellen vom Hintergrund zu unterscheiden.</li>
	<li>Bereiten Sie tote Zell-Färbung Lösung durch Verdünnen leben / tote Lager Reagenz (Tabelle der Materialien) 1:10,000 in PBS.</li>
	<li>Tauen Tag 3, Tag 5, und Tag 9 T-Zellen, die zuvor kryokonserviert waren. Zentrifuge 1 x 106 T Zellen aus jeder Gruppe bei 300 x g für 3 min. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min und entsorgen Sie die PBS.</li>
	<li>Mischen Sie T-Zellen mit abgestorbener Färbelösung für 15 min bei Raumtemperatur (RT), geschützt vor dem Licht.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu, um den Färber farbstoff für tote Zellen zu löschen. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 100 l FACS-Puffer mit dem in Schritt 2.1 und 2.2 beschriebenen Antikörpercocktail wieder auf. 1 h bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 300 x g für 3 min hinzu, um ungebundenen Antikörper abzuwaschen. Wiederholen Sie dies dreimal mit dem FACS-Puffer.</li>
	<li>Zellen in 1% Paraformaldehyd (PFA) aussetzen und bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Wenn die CD45RO-Expression nach der Fixierung abnimmt, analysieren Sie die Proben nach der Immunfärbung durch Durchflusszytometrie. Zur Beurteilung der Differenzierung, Gate in der folgenden Reihenfolge: Singlets (FSC-H vs FSC-A), Live CD3+ T Zellen (Dump [live-dead violet, CD14-PB und CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). In CD4+ und CD8+ Teilmengen, Gate auf CD45RO-PE vs CCR7-FITC naiv-ähnliche T-Zellen zu definieren (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-), und Tte (CD45RO-CCR7-). Um Tscm zu identifizieren, Gate auf CD27+ T-Zellen in naiven T-Zellen Population. In diesem Fach sind Tscm CD95+ und Tn cd95-.</li>
</ol>3. In-Vitro-Funktionsanalyse
<ol><li>CAR T Zellproliferation und Zytokinsekretion
	<ol>
<li>Überprüfen Sie die CAR-Expression sowie die Zelllebensfähigkeit, wie in den Schritten 1.5 und 1.7 beschrieben, durch Durchflusszytometrie.</li>
		<li>5 x 106 T-Zellen aus jeder Gruppe (Tag 3, Tag 5 und Tag 9) mit PBS waschen und in einer 1-M-Lösung von Carboxyfluorescein-Diacetat-Präparaten (CFSE) in PBS für 3,5 min bei RT resuspendieren.</li>
		<li>Fügen Sie sofort 10 ml PBS mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) hinzu, um die Reaktion zu löschen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 x g für 3 min. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Zählen Sie die Zellen am Ende der CFSE-Färbung mit einem Coulter-Zähler (Materialtabelle).</li>
		<li>CFSE-gefärbte Zellen (unstimuliert) ernten, in 1% PFA wieder aussetzen und bei 4 °C zur Analyse durch Durchflusszytometrie lagern.</li>
		<li>Inkubieren Sie die gewünschte Anzahl von CFSE-gebeizten CAR-T-Zellen mit bestrahltem K562-CD19 (Ziel) sowie K562-Wild-Typ (Kontroll)-Zellen im Verhältnis 1:1 für 120 h in zytokinfreien Medien- und Kulturbedingungen, wie in Schritt 1.1 beschrieben.</li>
		<li>Nach 24 h zentrieren Sie das Kulturgefäß bei 300 x g für 5 min. Sammeln Sie 120 l zellulären Überstand. Bewerten Sie die aktivierungsabhängige Produktion von IL2- und IFN-, TNF-, GM-CSF- und anderen entzündlichen Zytokinen (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 und IL10) durch Luminex-Analysen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.</li>
		<li>Ersetzen Sie das in Schritt 3.1.7 gesammelte Überstandvolumen durch ein entsprechendes Volumen (120 l) frisches Medium.</li>
		<li>An Tag 3 (d.h. nach 96 h) zählen und re-feed in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml mit Perlen-basierter Durchflusszytometrie wie zuvor in Schritt 1.5.</li>
		<li>Zählen Sie am 5. Tag die Live-CD3+ Zellen und berechnen Sie die Faltenänderung der lebenden T-Zellen relativ zur Anzahl der lebenden T-Zellen an Tag 0.</li>
		<li>Führen Sie eine umfassende Analyse der CFSE-Verdünnung durch, indem Sie CAR T-Zellen mithilfe der FlowJo-Software teilen, um aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung hervorzuheben. HINWEIS: Proliferationstests sind im FlowJo-Handbuch gut beschrieben.</li>
	</ol></li>
	<li>Zytotoxizitätstest HINWEIS: Die Fähigkeit von CART19-Zellen, Zielzellen zu töten, die CD19 exdrücken, wird mit einem 51Cr-Release-Assay ausgewertet.<ol>
<li>Beschriften Sie die Zielzellen durch Mischen von 5 x 105 K562-CD19, K562-Wild-Typ-Kontrollzellen oder NALM6-Leukämiezellen mit 50 l Na251CrO4 und 0,5 ml RPMI, ergänzt mit 10% FBS für 90 min im Inkubator bei 37 °C.</li>
		<li>Zentrifugenzellen bei 300 x g für 2,5 min. Entsorgen Sie den radioaktiven Überstand in geeigneten Entsorgungsbehältern und waschen Sie die Zielzellen in 5 ml PBS. Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal.</li>
		<li>Setzen Sie die Zielzellen in phenolrot-freiem Medium mit 5% FBS aus. Verwenden Sie dieses Medium für den Rest der Prozedur, um den Hintergrund zu reduzieren.</li>
		<li>Nach Auswertung der CAR-Expression und Zelllebensfähigkeit durch Durchflusszytometrie (wie in Abschnitt 5.1 beschrieben) mischen SIE CAR-T-Zellen mit beschrifteten Zielzellen bei Effektor:Target(E:T)-Verhältnissen von 10:1, 3:1 und 1:1 in Dreifachform. Transfer auf eine 96-Well U Bodenplatte.</li>
		<li>Parallel dazu umfassen Sie Zielzellen allein und Zielzellen mit 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), um die spontane (S) und maximale (M) 51Cr-Freisetzung zu bestimmen.</li>
		<li>Zentrifugenzellen bei 300 x g für 5 min und inkubieren für 4 h oder 20 h in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie nach der vorgesehenen Zeit das Kulturgefäß bei 300 x g für 5 min. Sammeln Sie 35 L Zellüberstand und übertragen Sie es auf eine Leseplatte. Vermeiden Sie Blasen. Lassen Sie die Platte über Nacht trocknen.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Platte mit einer Standardplattendichtung und zählen Sie mit einem flüssigen Szintillationszähler. Chromüberfluss im Überstand bietet einen Proxy für die Tötung von Zielzellen. Berechnen Sie den Prozentsatz der spezifischen Lyse wie folgt: 100 x (Zählungen pro Minute [cpm] experimentelle Veröffentlichung – cpm S Release)/ (cpm M release – cpm S release).</li>
	</ol></li>
</ol>4. In Vivo Funktionsanalyse
<ol><li>Erhalten Sie 6-10 Wochen alte NOD-SCID-Mäuse , die kein adaptives Immunsystem haben, und weisen Sie sie nach dem Zufallsprinzip der Behandlungs-/Kontrollgruppe zu.</li>
	<li>Injizieren Sie Tiere intravenös über Schwanzvene mit 1 x 106 NALM6 Zellen in 0,1 ml sterile PBS.</li>
	<li>Nach 5 bis 7 Tagen die Tumorengraftment durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) bestätigen. Injizieren Sie 150 mg/kg D-Luziferin an Mäuse, die mit Isofluran anbesstattet wurden (Das Volumen ist abhängig von der Körpermasse).</li>
	<li>Messen Sie Biolumineszenzwerte mit einem Bildgebungssystem. Quantifizieren Sie den Gesamtfluss mit der entsprechenden Software, indem Sie Rechtecke mit identischer Fläche um Mäuse zeichnen, die vom Kopf bis zu 50 % der Schwanzlänge reichen. Subtrahieren Sie den Hintergrund für jedes Bild einzeln.</li>
	<li>Nach der Leukämie-Infektion 3 x 106 Tag 9 CART19-Zellen, 0,5 x 106 Tage 3 CAR-T-Zellen oder entsprechende nicht transducierte (NTD) menschliche T-Zellen über Schwanzvene in einem Volumen von 100 l sterilen PBS/Ca2+injizieren. HINWEIS: Da die Bioaktivität der Zellen, die in verschiedenen Intervallen während des Kulturprozesses geerntet werden, unterschiedlich ist, ist die gewählte Konzentration von Tag-3-Zellen niedriger als Tag 9.</li>
	<li>Um das Fortschreiten der Krankheit zu bestimmen, messen Sie die Biolumineszenzwerte zweimal pro Woche, wie oben in Schritt 4.3 beschrieben.</li>
	<li>Um die CAR-T-Zellengraftierung zu bestimmen, sammeln Sie 75 L Blut durch retroorbitale Blutungen in einem EDTA-beschichteten Röhrchen. Übertragen Sie 50 l Blut in absolute Zählröhrchen.</li>
	<li>Blut mit Antikörpern gegen CD45, CD4, CD8 und CAR 30 min bei RT färben. Fügen Sie den Röhrchen und Wirbeln 400 l 1x FACS-Lysinglösung gründlich hinzu. Analysieren Sie nach der Färbung den Oberflächenmarkerausdruck durch Durchflusszytometrie. HINWEIS: Andere Oberflächenmarker können verwendet werden, um den Differenzierungs- und Erschöpfungsstatus der T-Zellen im Blut zu bewerten.</li>
	<li>Um den Zytokinspiegel im Blut zu messen, zentrifugieren Sie das Blut bei 1.200 x g für 30 min bei 4 °C, um Serum von der oberen Blutschicht zu trennen.</li>
	<li>Serum sammeln und die Zytokine mit einer bestimmten Leseplatte gemäß den Anweisungen des Herstellers messen.</li>
</ol>

<ol><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li>
<li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+%28CTLs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8%2B+T+cells+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8%2B+effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).</li>
<li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier beschreiben wir Ansätze zur Messung der Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die in unterschiedlichen Intervallen in der Ex-vivo-Kultur geerntet werden. Unsere Methoden bieten umfassende Einblicke in Assays zur Beurteilung der Proliferativen Kapazität sowie der Effektorfunktion in vitro. Wir beschreiben, wie man die AKTIVITÄT von CAR T-Zellen nach Stimulation durch die CAR misst und Xenograft-Modelle von Leukämie mit CAR-T-Zellen detailliert beschreibt, die am Tag 3 gegen Tag 9 ihrer logarithmischen Expansions...

Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) bieten einen vielversprechenden Ansatz, um T-Zellen gegen verschiedene Tumorantigene umzuleiten. CARs sind synthetische Rezeptoren, die ein Antigenziel binden. Obwohl ihre genaue Zusammensetzung variabel ist, enthalten CARs im Allgemeinen 3 verschiedene Domänen. Die extrazelluläre Domäne leitet die Bindung an ein Zielantigen und besteht in der Regel aus einem einkettigen Antikörperfragment, das über ein extrazelluläres Scharnier mit dem CAR verknüpft ist. Die zweite Domäne, die üblicherweise von der CD3-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes (TCR) abgeleitet wird, fördert die T-Zellaktivierung nach CAR-Eingriff. Eine dritte Costimulatorische Domäne ist enthalten, um T-Zell-Funktion zu verbessern, Transplantation, Stoffwechsel, und Persistenz. Der Erfolg der CAR-T-Zelltherapie bei verschiedenen hämatopoetischen Malignomen, einschließlich akuter lymphatischer Leukämie (ALL), chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und multiplem Myelom, unterstreicht das therapeutische Versprechen dieses Ansatzes1,2,3,4,5,6. Die jüngsten Zulassungen der Food and Drug Administration (FDA) für zwei CD19-spezifische CAR-T-Zelltherapien, Tisagenlecleucel für pädiatrische und junge Erwachsene ALL und Axicabtagene ciloleucel für diffuses großes B-Zell-Lymphom, verstärken den translationalen Wert der CAR T-Zelltherapie.
CAR T-basierte Ansätze beinhalten die Isolierung von T-Zellen aus peripherem Blut, Aktivierung, genetische Veränderung und Expansion ex vivo. Die Differenzierung ist ein wichtiger Parameter, der die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen reguliert. Dementsprechend verbessert die Einschränkung der T-Zell-Differenzierung während der Ex-vivo-Kultur die Fähigkeit des infundierten Produkts, sich zu engrafieren, zu erweitern und fortzubestehen, was eine langfristige Immunüberwachung nach derAdoption2,7,8,9bietet. T-Zellen bestehen aus mehreren unterschiedlichen Teilmengen, darunter: naive T-Zellen (Tn), Zentralgedächtnis (Tcm), Effektorspeicher (Tem), Effektor differenziert (Tte) und Stammzellgedächtnis (Tscm). Effektor differenzierte T-Zellen haben starke zytolytische Fähigkeit; jedoch sind sie kurzlebig und veredeln schlecht10,11,12. Im Gegensatz dazu weisen T-Zellen mit einem weniger differenzierten Phänotyp, einschließlich naiver T-Zellen und Tcm, nach der Adoptivzellübertragung13,14,15,16,17,18eine überlegene Engraftmentierung und proliferative Fähigkeiten auf. Die Zusammensetzung der gesammelten T-Zellen im vorgefertigten Produkt kann von Patient zu Patient variieren und korreliert mit dem therapeutischen Potenzial von CAR-T-Zellen. Der Anteil der T-Zellen mit einem naiven Immunophenotyp im Ausgangsapherese-Produkt ist stark korreliert mit der Transplantation und dem klinischen Ansprechen19.
Die Kulturdauer ist ein wichtiger Parameter, der die Differenzierung in CAR-T-Zellen beeinflusst, die für die Adoptivübertragung vorbereitet sind. Wir haben vor kurzem einen Ansatz entwickelt, um CAR-T-Zellen von höchster Qualität mit einem abgekürzten Kulturparadigma20zu erzeugen. Mit unserem Ansatz zeigten wir, dass eine begrenzte Kultur zu CAR-T-Zellen mit überlegener Effektorfunktion und Persistenz nach Derisübertragung bei Xenograft-Modellen von Leukämie führt. Hier stellen wir die Ansätze zur zuverlässigen Generierung von CART19-Zellen vor (autologe T-Zellen, die entwickelt wurden, um Anti-CD19-SCFv auszudrücken, die an CD3- und die 4-1BB-Signal-Domains angehängt sind) und enthalten eine detaillierte Beschreibung der Assays, die Einblicke in car T Bioaktivität und Wirksamkeit vor der Adoptionsübertragung geben.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD3/CD28-Dynabeads</td><td>Thermo Fisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>APC Maus Anti-Human CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID:AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 Maus Anti-Human-CD8-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID:AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution 10X Konzentrat</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Absolute Zählröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 Anti-Human-CD4-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Human-CD3-Antikörper</td><td>BioLegend 317322</td><td></td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Life Technolohgies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads,Invitrogen</td><td></td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-Human CD197 (CCR7) Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID:AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555346</td><td>RRID:AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 IS, Premium-Qualität</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>Flüssiger Szintillationszähler, MicroBeta trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbare</td><td>violette Molekularsonden</td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Scharzähler</td><td>Beckman Schar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blauer Anti-Human-CD14-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>325616</td><td>RRID:AB_830689</td></tr><tr><td>Pacific Blue Anti-Human-CD19-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Human-CD45RO-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID:AB_395884</td></tr><tr><td>PE/Cy5 Anti-Human-CD95 (Fas)-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID:AB_493652</td></tr><tr><td>PE/Cy7 Anti-Human-CD27-Antikörper</td><td>Beckman Coulter</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrotfreies Medium</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS-Lösung, 10%</td><td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via-Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salz</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von chimeric antigen receptor (car) t-zellen für die adoptivimmuntherapie

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Die Adoptivimmuntherapie verspricht die Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten. Wir beschreiben einen einfachen Ansatz, um primäre menschliche T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR) zu transduzieren und ihre Nachkommen ex vivo zu erweitern. Wir umfassen Assays zur Messung des CAR-Ausdrucks sowie Differenzierung, Proliferativfähigkeit und zytolytische Aktivität. Wir beschreiben Assays zur Messung der Cytokinproduktion und der entzündlichen Zytokinsekretion in CAR-T-Zellen. Unser Ansatz bietet eine zuverlässige und umfassende Methode zur Kultur von CAR-T-Zellen für präklinische Modelle der Adoptivimmuntherapie.

Mit den oben beschriebenen Methoden stimulierten und erweiterten wir T-Zellen für 3 oder 9 Tage(Abbildung 1A,B). Wir analysierten auch ihr Differenzierungsprofil, wie in der in Abbildung 1Cbeschriebenen Gating-Strategie angegeben, indem wir die Häufigkeit von verschiedenen Glykoproteinen, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, gemessen haben. Wir zeigen eine fortschreitende Verschiebung hin zur Effektordifferenzierung im ...

Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Die Delib-er-ating ein CAR T Cell Produkt mit funktioneller Kompetenz, die engraft, vermehrt und hat Cit-el-uric Aktivität nach infusion ist ein Schlüsselbestandteil einer wirksamen Adoptivimmuntherapie. Zum Beispiel, in soliden Tumoren, CAR T-Zellen können sie durch feste Tumoren eindringen und sie erhalten eine optimale Antigenstimulation;jedoch wird ihre allgemeine Engraftmentierung und Proliferation bei Menschen behindert. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Qualität der CAR-T-Zellen oder den Differenzierungszustand der CAR-T-Zellen beibehalten kann, ohne endlos differenzierte oder erschöpfte T-Zellen zu erzeugen, was die proliferative Kapazität oder eine schlechte effektive Funktion nach der Infusion verringert hätte.Diese Technik kann schwierig sein, da T-Zellen sehr empfindlich auf ihre Zellkonzentration oder die Oberfläche der Gefäße reagieren, in denen sie kultiviert wurden. Sowie ihre Stoffwechselbedürfnisse. Im Wesentlichen müssen T-Zellen während des gesamten Prozesses glücklich gehalten werden, sonst wachsen sie nicht.Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie 6-Well-Kultur-Gerichte. Aktivieren Sie frische oder kryoerhaltene primäre menschliche T-Zellen, indem Sie sie mit Anti-CD3 CD28-Magnetperlen mischen, im Verhältnis von drei Perlen pro T-Zelle in den Brunnen der Kulturgerichte. Kultur die T-Zellen in X-Vivo 15 Medium ergänzt mit normalen menschlichen AB-Serum, L-Glutamin, he-pees und IL2.Aktivieren Sie die T-Zellen mit einer Konzentration von einer Million T-Zellen pro Milliliter während der Expansion. Und kultursie bei 37 Grad Celsius mit 20% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid und 95% Feuchtigkeit. Nach der nächtlichen Stimulation lentivirale Überstoffe zu den aktivierten T-Zellen hinzufügen.Berechnen Sie das Volumen der Überstande, die notwendig sind, um eine Vielzahl von Infektionen zwischen drei und fünf zu erreichen. Fahren Sie mit der Kultivierung der Zellen unter den gleichen Bedingungen fort. Sammeln Sie am dritten Tag ein repräsentatives Aliquot der Zellen der Kryokonservierung.Entfernen Sie vor der Kryokonservierung die magnetischen Perlen durch sanfte Pipettierung und magnetische Trennung. Bereiten Sie das Gefriermedium vor, das PBS mit 0,5%DMSO enthält. Und lagern Sie es bei vier Grad Celsius, bis es einsatzbereit ist.Als nächstes zentrifugieren Sie die T-Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 300 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie die PBS.Wir setzen das Pellant in einem Milliliter kalten Kryo-Konservierungsmedium aus. Einfrieren der T-Zellen in einem gekühlten Gefrierbehälter. Und bei minus 80 Grad Celsius für 48 Stunden lagern.Danach die gefrorenen Zellen in flüssigen Stickstoff übertragen. Waschen Sie den Rest der T-Zellen einmal in fünf Milliliter PBS, um jeden Restvektor zu eliminieren. Zentrifuge bei 300 mal G für fünf Minuten.Dekantieren Sie dann die PBS und setzen Sie das Zellpellant im T-Zellkulturmedium in einer Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter wieder auf. Teilen Sie die T-Zellen in zwei Kulturen, die 45 und 9 entworfen haben. Zählen Sie die T-Zellen nach Durchflusszytometrie mit Zählperlen und monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD4 und CD8.Ebenso wie ein Lebensfähigkeitsfarbstoff. Füttern Sie die Kulturen jeden zweiten Tag, um sie bei einer Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Zählen und kryobewahren Sie am fünften Tag die fünf Kulturen, wie zuvor beschrieben.Waschen Sie am siebten Tag 500.000 Zellen in PBS. Und setzen Sie sie in 100 Mikroliter Fluoreszenz aktivierten Zellsortierpuffer wieder aus. Dann erkennen Sie die EXPRESSION von CAR-Oberflächenproteinen durch Immunfärbung mit einem fluoreszierend konjugierten Anti-CAR 19-Idio-Typ durch Durchflusszytometrie.Am neunten Tag zählen und kryobewahren sie den Tag neun Kulturen, wie zuvor beschrieben. In dieser Studie werden die Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen gemessen, die in unterschiedlichen Intervallen in der X-Vivo-Kultur geerntet werden. Mit den in diesem Video beschriebenen Methoden werden T-Zellen für drei oder neun Tage stimuliert und erweitert.Das Zelldifferenzierungsprofil, wie es in der hier gezeigten Gating-Strategie dargestellt wird, wird analysiert, indem die Häufigkeit von verschiedenen Glykoproteinen gemessen wird, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Eine fortschreitende Verschiebung hin zur Effektordifferenzierung zeigt sich im Laufe der Zeit während der X-Vivo-Kultur. Anschließend wird die Effektorfunktion und die proliferative Kapazität von CAR-T-Zellen als Reaktion auf Antigen bewertet.Zellen, die weniger erweitert werden, sind funktional denen überlegen, die über eine längere Dauer ausgiebig kultiviert werden. In einem menschlichen Xenograft-Mausmodell von ALL wird die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die zu verschiedenen Zeiträumen geerntet werden, verglichen. Die neun Tage-Zellen zeigen eine dosisabhängige anti-laumische Reaktion mit einer vollständigen Reaktion im Wert von einer hohen Dosis von drei Millionen;und einen Verlust der Wirksamkeit für die niedrige Dosis von 500 000.Jedoch, der Tag drei Zellen zeigten anhaltende Tumorkontrolle in hohen und niedrigen Dosen. Diese Reaktion ist mit der absoluten Anzahl von CAR-T 19 im peripheren Blut von Mäusen verbunden. Insgesamt liefern diese Ergebnisse Beweise dafür, dass CAR-T-Zellen früher geerntet wurden und die später geernteten besser abschneiden.Nach diesem Verfahren können zusätzliche Funktionen wie Seepferdchen-Assay durchgeführt werden, um ihre metabolischen Eigenschaften wie Sauerstoffverbrauch oder Spir-it-ed-Kapazität zu messen. Mehrere Runden der Restimulation können auch durchgeführt werden, um Einen Einblick in ihre Differenzierung und Persistenz von CAR-T-Zellen zu geben. Mit dieser Arbeit als Grundlage beschäftigen wir und andere Forscher Studien, um den Kulturprozess weiter abzukürzen.Es kann auch in Kernansätzen Design für andere Krebsantigene erweitert werden. Bei der Arbeit mit dem Lentivirus ist immer Vorsicht geboten. Aber selbst wenn das Lentivirus entwickelt wird, um Replikation inkompetent zu sein.

manufacturing-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells-for-adoptive

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen ex vivo. Menschliche T-Zellen werden mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, zusammen mit einem mit Interleukin-2 (IL-2) angereicherten Medium, was zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Zellen führt. Transgene lentivirale Vektoren werden eingeführt, die es der transgenen RNA ermöglichen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren und...

Eine ex vivo-Technik zur Herstellung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Hier stellen wir ein Protokoll für die Genbearbeitung in primären menschlichen T-Zellen vor, das die CRISPR Cas-Technologie verwendet, um CAR-T-Zellen zu modifizieren.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess für chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für den klinischen Einsatz, insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Zellprozessors, der in der Lage ist, virale Transduktion und Kultivierung von T-Zellen durchzuführen. Wir geben Empfehlungen und beschreiben Fallstricke, die bei der Prozessentwicklung und Durchführung einer frühen klinischen Studie berücksichtigt werden sollten.

Herstellung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf einem automatisierten Zellprozessor

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen unter Verwendung von nicht-integrierender mRNA für die Krebsimmuntherapie und bietet zuverlässige Methoden zur Bewertung von CAR-T-Zellen und ihrer zytotoxischen Funktion.

Ein nicht-viraler Ansatz zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen unter Verwendung von mRNA für die Krebsimmuntherapie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte zur Kultivierung primärer T-Zellen, einschließlich ihrer Isolierung, Aktivierung, Expansion und transienten Transfektion durch mRNA-Elektroporation. Zusätzlich werden ein Workflow und ein Antikörperpanel für die Durchflusszytometrie von Phänotyp, Aktivierungsmarkern, Viabilität und der Expression des chimerischen Antigenrezeptors (CAR) vorgeschlagen.

Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen

Erfahren Sie die Herstellung von CAR T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie unter Erhalt ihrer funktionellen Kompetenz. Diese Methode optimiert die Zellqualität und verbessert die Wirksamkeit bei der Krebsbehandlung.

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Weitere Videos entdecken