Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Die Delib-er-ating ein CAR T Cell Produkt mit funktioneller Kompetenz, die engraft, vermehrt und hat Cit-el-uric Aktivität nach infusion ist ein Schlüsselbestandteil einer wirksamen Adoptivimmuntherapie. Zum Beispiel, in soliden Tumoren, CAR T-Zellen können sie durch feste Tumoren eindringen und sie erhalten eine optimale Antigenstimulation;jedoch wird ihre allgemeine Engraftmentierung und Proliferation bei Menschen behindert. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Qualität der CAR-T-Zellen oder den Differenzierungszustand der CAR-T-Zellen beibehalten kann, ohne endlos differenzierte oder erschöpfte T-Zellen zu erzeugen, was die proliferative Kapazität oder eine schlechte effektive Funktion nach der Infusion verringert hätte.

Diese Technik kann schwierig sein, da T-Zellen sehr empfindlich auf ihre Zellkonzentration oder die Oberfläche der Gefäße reagieren, in denen sie kultiviert wurden. Sowie ihre Stoffwechselbedürfnisse. Im Wesentlichen müssen T-Zellen während des gesamten Prozesses glücklich gehalten werden, sonst wachsen sie nicht.

Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie 6-Well-Kultur-Gerichte. Aktivieren Sie frische oder kryoerhaltene primäre menschliche T-Zellen, indem Sie sie mit Anti-CD3 CD28-Magnetperlen mischen, im Verhältnis von drei Perlen pro T-Zelle in den Brunnen der Kulturgerichte. Kultur die T-Zellen in X-Vivo 15 Medium ergänzt mit normalen menschlichen AB-Serum, L-Glutamin, he-pees und IL2.

Aktivieren Sie die T-Zellen mit einer Konzentration von einer Million T-Zellen pro Milliliter während der Expansion. Und kultursie bei 37 Grad Celsius mit 20% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid und 95% Feuchtigkeit. Nach der nächtlichen Stimulation lentivirale Überstoffe zu den aktivierten T-Zellen hinzufügen.

Berechnen Sie das Volumen der Überstande, die notwendig sind, um eine Vielzahl von Infektionen zwischen drei und fünf zu erreichen. Fahren Sie mit der Kultivierung der Zellen unter den gleichen Bedingungen fort. Sammeln Sie am dritten Tag ein repräsentatives Aliquot der Zellen der Kryokonservierung.

Entfernen Sie vor der Kryokonservierung die magnetischen Perlen durch sanfte Pipettierung und magnetische Trennung. Bereiten Sie das Gefriermedium vor, das PBS mit 0,5%DMSO enthält. Und lagern Sie es bei vier Grad Celsius, bis es einsatzbereit ist.

Als nächstes zentrifugieren Sie die T-Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 300 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie die PBS.

Wir setzen das Pellant in einem Milliliter kalten Kryo-Konservierungsmedium aus. Einfrieren der T-Zellen in einem gekühlten Gefrierbehälter. Und bei minus 80 Grad Celsius für 48 Stunden lagern.

Danach die gefrorenen Zellen in flüssigen Stickstoff übertragen. Waschen Sie den Rest der T-Zellen einmal in fünf Milliliter PBS, um jeden Restvektor zu eliminieren. Zentrifuge bei 300 mal G für fünf Minuten.

Dekantieren Sie dann die PBS und setzen Sie das Zellpellant im T-Zellkulturmedium in einer Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter wieder auf. Teilen Sie die T-Zellen in zwei Kulturen, die 45 und 9 entworfen haben. Zählen Sie die T-Zellen nach Durchflusszytometrie mit Zählperlen und monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD4 und CD8.

Ebenso wie ein Lebensfähigkeitsfarbstoff. Füttern Sie die Kulturen jeden zweiten Tag, um sie bei einer Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Zählen und kryobewahren Sie am fünften Tag die fünf Kulturen, wie zuvor beschrieben.

Waschen Sie am siebten Tag 500.000 Zellen in PBS. Und setzen Sie sie in 100 Mikroliter Fluoreszenz aktivierten Zellsortierpuffer wieder aus. Dann erkennen Sie die EXPRESSION von CAR-Oberflächenproteinen durch Immunfärbung mit einem fluoreszierend konjugierten Anti-CAR 19-Idio-Typ durch Durchflusszytometrie.

Am neunten Tag zählen und kryobewahren sie den Tag neun Kulturen, wie zuvor beschrieben. In dieser Studie werden die Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen gemessen, die in unterschiedlichen Intervallen in der X-Vivo-Kultur geerntet werden. Mit den in diesem Video beschriebenen Methoden werden T-Zellen für drei oder neun Tage stimuliert und erweitert.

Das Zelldifferenzierungsprofil, wie es in der hier gezeigten Gating-Strategie dargestellt wird, wird analysiert, indem die Häufigkeit von verschiedenen Glykoproteinen gemessen wird, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Eine fortschreitende Verschiebung hin zur Effektordifferenzierung zeigt sich im Laufe der Zeit während der X-Vivo-Kultur. Anschließend wird die Effektorfunktion und die proliferative Kapazität von CAR-T-Zellen als Reaktion auf Antigen bewertet.

Zellen, die weniger erweitert werden, sind funktional denen überlegen, die über eine längere Dauer ausgiebig kultiviert werden. In einem menschlichen Xenograft-Mausmodell von ALL wird die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die zu verschiedenen Zeiträumen geerntet werden, verglichen. Die neun Tage-Zellen zeigen eine dosisabhängige anti-laumische Reaktion mit einer vollständigen Reaktion im Wert von einer hohen Dosis von drei Millionen;und einen Verlust der Wirksamkeit für die niedrige Dosis von 500 000.

Jedoch, der Tag drei Zellen zeigten anhaltende Tumorkontrolle in hohen und niedrigen Dosen. Diese Reaktion ist mit der absoluten Anzahl von CAR-T 19 im peripheren Blut von Mäusen verbunden. Insgesamt liefern diese Ergebnisse Beweise dafür, dass CAR-T-Zellen früher geerntet wurden und die später geernteten besser abschneiden.

Nach diesem Verfahren können zusätzliche Funktionen wie Seepferdchen-Assay durchgeführt werden, um ihre metabolischen Eigenschaften wie Sauerstoffverbrauch oder Spir-it-ed-Kapazität zu messen. Mehrere Runden der Restimulation können auch durchgeführt werden, um Einen Einblick in ihre Differenzierung und Persistenz von CAR-T-Zellen zu geben. Mit dieser Arbeit als Grundlage beschäftigen wir und andere Forscher Studien, um den Kulturprozess weiter abzukürzen.

Es kann auch in Kernansätzen Design für andere Krebsantigene erweitert werden. Bei der Arbeit mit dem Lentivirus ist immer Vorsicht geboten. Aber selbst wenn das Lentivirus entwickelt wird, um Replikation inkompetent zu sein.