Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da die Verwendung von gefrorenem Gewebe die Logistik bei der Bewertung mehrerer Gewebe vereinfacht, die Probenübertragung an ein entferntes Labor zur Analyse ermöglicht und es ermöglicht, eine Entscheidung zur Analyse eines Gewebes monatelang zu verschieben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Verwendung von gefrorenem Würfelgewebe kein Personal erfordert, das im Kometentest bei Nekropsie geschult ist, und die Möglichkeit für technische Fehler und mechanische DNA-Schäden minimiert, die während der Probenmanipulation auftreten. Diese Technik ist in der präklinischen Arzneimittelentwicklung, der Sicherheitsbewertung von Chemikalien, die in die Umwelt gelangen, und Lebensmittelzusatzstoffen Anwendung.

Gefrorenes Gewebe kann im Kometentest verwendet werden, um das genotoxische Potenzial, die DNA-Reparatur, die Schutzwirkung gegen DNA-Schäden, die durch Chemotherapie oder Strahlung verursacht werden, und für die Umwelt-Bioüberwachung zu bewerten. Idealerweise sollten Experimente so konzipiert werden, dass die Verarbeitung jeder Gewebeprobe bis zum Gefrierschritt möglich ist, bevor Organe, die vom nächsten Tier geerntet wurden, zur Verarbeitung zur Verfügung stehen. Gefrorenes Gewebe kann im Kometentest verklagt werden, um das genotoxische Potenzial, die DNA-Reparatur, die Schutzwirkung gegen DNA-Schäden, die durch Chemotherapie oder Strahlung verursacht werden, und für die Umwelt-Bioüberwachung zu bewerten.

Die technische Trainerin Carole Bobbitt und die Leiterin der investigativen Toxikologie, Eileen Gilas, werden heute als Prosektoren tätig sein. Der wissenschaftliche Mitarbeiter Lincoln Martin und die Histologie-Technikerin Amelie Ladesseur demonstrieren die Probenhandhabung. Um dieses Verfahren zu beginnen, entfernen Sie alle angeschlossenen Verbindungsgewebe, Organe, und Schmutz von einem Organ von Interesse.

Sofort das Organ kräftig in einem mittelgroßen Wägeboot mit etwa sieben Milliliterkaltem, frisch zubereiteter Hacklösung schwenken, um Restblut und Schmutz zu entfernen. Übertragen Sie das Organ auf ein anderes sauberes Wägeboot, das eine ausreichende Kaltschnittlösung enthält, um das Gewebe unter Wasser zu halten und es bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis zu halten. Für die Leber einen fünf Millimeter langen Abschnitt des linken Lappens schneiden und sanft in etwa sieben Milliliter kalter Hacklösung schwenken.

Dann legen Sie den Gewebestreifen in ein sauberes mittelgroßes Wägeboot mit etwa sieben Milliliter kalter Hacklösung und halten Sie auf Eis, bis sie weiter verarbeitet werden kann. Entfernen Sie einen Abschnitt der Leber und legen Sie ihn in eine Einbettkassette. Führen Sie Fixierung, Trimmen und Paraffineinbettung gemäß den Laborstandardverfahren für eine mögliche zukünftige histopathologische Bewertung durch.

Für das Zwölffingerdarm einen 10-Millimeter-Anteil des Zwölffingerdarms proximal in den Magen schneiden. Legen Sie eine 21 bis 25 MessgerätNadel in einem Ende des Zwölffingerdarms und spülen Sie es mit einem Milliliter kalter Hacklösung, um Schmutz und Bakterien zu entfernen. Das Zwölffingerdarm umdrehen, mit einem weiteren Milliliter Hacklösung wieder spülen und die Nadel entsorgen.

Das Zwölffingerdarm aufschneiden und in etwa sieben Milliliter Mincing-Lösung abspülen. Dann spülen Sie das Zwölffingerdarm wieder ab und halten Sie es in Derinzierlösung auf Eis, bis es weiterverarbeitet werden kann. Schneiden und fixieren Sie einen Teil des verbleibenden Zwölffingerdarms für eine mögliche zukünftige histopathologische Bewertung, wie zuvor für die Leber beschrieben.

Für das Gehirn kann es nützlich sein, zuerst das Gehirn in zwei Hemisphären zu teilen, wobei eine Hemisphäre für eine mögliche Histopathologie gespeichert wird. Sezieren Sie die Voninteresseer Hirnregionen, spülen Sie sie dann sanft aus und halten Sie sie in der Hacklösung auf Eis, bis sie bereit sind, weiter zu verarbeiten, wie zuvor für Leber und Zwölffingerdarm beschrieben. Für den Magen den Vordermagen entfernen und entsorgen.

Den Drüsenmagen aufschneiden und frei von Lebensmitteln waschen, indem Man ihn in einem mittelgroßen Wägeboot mit etwa sieben Millilitern kalter Zerkleinerungspuffer schwenkt. Entfernen Sie einen fünf Millimeter langen Streifen Drüsenmagen proximal zum Zwölffingerdarm zur Fixierung für eine mögliche histopathologische Bewertung, wie zuvor beschrieben. Den restlichen Magen in ein mittelgroßes Wägeboot mit etwa sieben Milliliterkaltem Schnittpuffer geben und 15 bis 30 Minuten auf Eis brüten.

Danach den Magen auf ein sauberes Stück Paraffin übertragen und mit einem Skalpellmesser oder einem Plastikzellschaber das Oberflächenepithel mindestens zwei Mal vorsichtig kratzen, um Schmutz zu entfernen. Nehmen Sie die Magenschleimhaut mit Zange auf und spülen Sie sie mit einer Pipette mit einem Milliliter Kaltzersparung ab. Übertragen Sie das vorspülte Magengewebe auf eine saubere Oberfläche oder Schale und fügen Sie kalte Hacklösung hinzu.

Verwenden Sie die Rückseite einer Skalpellklinge oder eines Plastikzellschabers, um das Magenepithel vier- bis fünfmal sorgfältig zu kratzen, um die Zellen freizusetzen. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Hacklösung mit den freigesetzten Zellen zu sammeln und auf Eis in ein Mikrozentrifugenrohr zu übertragen. Zum Zerschneiden von Gewebeproben einen Abschnitt der Leber, des Gehirns oder des Zwölffingerdarms schneiden und in ein beschriftetes Mikrozentrifugenrohr mit einem Milliliter Kaltzerlegungslösung übertragen.

Verwenden Sie eine Schere, um die Probe schnell zu zerkleinern, bis sie schließlich verteilt ist, während sie sicherstellt, dass die Probe kalt bleibt. Das Beispiel sollte leicht bewölkt aussehen. Es ist jedoch üblich, dass einige Stücke bleiben, die sich auf dem Boden des Rohres absetzen.

Um das Gewebe zu verwenden, während es frisch ist, halten Sie die Rohre, die die Proben enthalten, auf Eis. Um die Gewebeproben einzufrieren, sichern Sie den Deckel der Röhre unmittelbar nach dem Hacken oder sammeln und lassen Sie das Rohr in einen Dewar-Kolben, der flüssigen Stickstoff enthält. Verwenden Sie am Ende der Gewebeernte eine Pfanne, um die Probenröhrchen zu bergen, und legen Sie sie auf Trockeneis, um sie zu sortieren.

Die Rohre auf Trockeneis in eine Gefrierbox geben und die Box bei minus 80 Grad Celsius in einem Gefrierschrank aufbewahren. Um gefrorene Gewebewürfel vorzubereiten, schneiden Sie mehrere kleine Gewebestücke und legen Sie sie einzeln für einige Sekunden direkt in ein mittelgroßes Wägeboot oder ein anderes geeignetes Gefäß mit flüssigem Stickstoff. Nachdem die Stücke vollständig eingefroren sind, die gefrorenen Gewebewürfel einzeln auf beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen oder Kryoröhren auf Trockeneis übertragen.

Zum Abschluss der Gewebeernte die Rohre auf Trockeneis in eine Gefrierbox geben und die Box bei minus 800 Grad Celsius in einem Gefrierschrank aufbewahren. Wenn Sie frisch gehacktes oder geschabtes Gewebe auf nassem Eis verwenden, bereiten Sie Kometenrutschen innerhalb einer Stunde nach der Ernte vor. Wenn Sie gefrorenes Hackfleisch oder abgekratztes Gewebe verwenden, legen Sie Rohre mit gefrorenem Gewebe bei Raumtemperatur in ein Wasserbad, bis die Proben vollständig aufgetaut sind, während sie kalt gehalten werden.

Sobald die Proben aufgetaut sind, übertragen Sie die Rohre sofort auf Eis. Für würfelförmiges Gewebe die Rohre, die die Würfel enthalten, aus dem Gefrierschrank holen und auf Trockeneis bis zur Gleitvorbereitung pflegen. Aliquot einen Milliliter Handelsmedium oder eine Hacklösung in ein beschriftetes 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr für jede Probe und auf Eis zu halten.

Arbeiten Sie schnell, um das Auftauen zu vermeiden, legen Sie einen Würfel aus Gewebe in das offene Ende eines Raumtemperatur-Gewebe-Mincing-Geräts. Legen Sie schnell einen größengerechten Spritzenkolben in das Gerät ein, um das Gewebe in das Netzende zu schieben, das dann in das Mikrozentrifugenrohr mit der Kaltzerkleinerungslösung gelegt werden sollte. Tauchen Sie das Netzende des Geräts für etwa fünf bis zehn Sekunden in die Kaltschnittlösung ein, damit das Gewebe vollständig auftauen kann.

Drücken Sie den Kolben vollständig, bis Zellen durch die Netzporen extrudieren. Ziehen Sie dann den Kolben ca. 2,5 Zentimeter nach oben und drücken Sie wieder vollständig nach unten. Wiederholen Sie dies mehrmals, bis die Hacklösung trüb wird.

Um Dias vorzubereiten, mischen Sie eine Zellsuspension sanft und übertragen Sie 50 Mikroliter in ein Rohr mit 450 Mikrolitern 0,5% niedriger Schmelzpunkt Agarose bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie die Folien wie im Textprotokoll beschrieben vor und bewerten Sie sie. In der ersten Studie wurde die Leber aus zwei Kohorten männlicher Sprague Dawley Fahrzeugkontrollratten geerntet, die um eine Woche gestaffelt waren.

Die Dias wurden aus frisch gehacktem Gewebe, gefrorenem Hackfleisch und gefrorenem Würfelgewebe hergestellt. Da die OECD die Obergrenze für prozentige Schwanz-DNA in frischer Rattenleber von 6 % empfohlen hat, zeigen diese Ergebnisse, dass jede der Gefriermethoden gut für die Bewertung von Gewebe nmöglich funktionieren kann. Insgesamt haben die prozentigen Igel parallel zur prozentualen Schwanz-DNA, obwohl gefrorenes Gewebe eine größere Variabilität aufwies.

In der zweiten Studie wurden weiblichen B6C3F1-Mäusen Einvehikel oder das Mutagenethylmethansulfonat verabreicht. Die prozentualen DNA-Ergebnisse deuten darauf hin, dass Lebergewebe, das als Würfel eingefroren und anschließend mit dem Gewebezerkleinerungsgerät verarbeitet wurde, zu Ergebnissen führte, die denen für frisch gehacktes Gewebe sehr ähnlich waren. In Gewebeproben, die mit allen drei Methoden verarbeitet wurden, wurde eine statistisch signifikante Zunahme der EMS-induzierten DNA-Schäden gemessen.

In der dritten Studie wurden Leberproben von weiblichen B6C3F1-Mäusen in einer 90-tägigen chemischen Toxizitätsstudie analysiert. Die DNA-Schäden in gefrorenem Hackfleisch waren in allen Dosisgruppen hoch, mit erheblichen Variabilitäten von Tieren bis zu Tieren. Die prozentualen DNA-Ergebnisse korrelierten mit prozentigen Igeln, was darauf hindeutet, dass Igel wesentlich zu dem hohen Grad an DNA-Schäden beigetragen haben, der in diesen Proben beobachtet wurde.

Im Gegensatz dazu waren sowohl DNA-geschädigte als auch prozentige Igel im blitzgefrorenen Würfelgewebe, das parallel zu den Hackfleischproben hergestellt worden war, sehr gering. So waren die stark geschädigten Zellen, die sich als Igel in den Hackfleischproben manifestierten, eindeutig nicht das Ergebnis eines biologischen Prozesses, sondern wurden wahrscheinlich durch mechanische Störungen und gewebeerwärmung während des Hackvorgangs vor dem Blitzeinschlag eingeführt. Daher wurden die Daten für Hackfleisch als unzuverlässig angesehen.

Zum Vergleich: Aus dem gefrorenen Würfelgewebe wurden auch nach längerer Lagerung qualitativ hochwertige Daten gewonnen. Es ist wichtig, geerntetes Gewebe kalt und feucht zu halten und schnell zu arbeiten, um die Proben einzufrieren. Auch gefrorenes Würfelgewebe sollte unmittelbar vor dem Homogenisierungsschritt aufgetaut werden.

Gefrorene Gewebeproben eignen sich für andere nachgelagerte Anwendungen, wie z. B. Modifikationen des Kometentests zum Nachweis oxidativer Schäden oder Vernetzung sowie die Bewertung von Veränderungen der Genexpression. Beim Umgang mit Skalpellklingen zum Schneiden oder Kratzen von Geweben und beim Umgang mit flüssigem Stickstoff während des Gefrierprozesses ist Vorsicht geboten.