Identifizieren von Mutationen durch hochauflösendes Schmelzen in einer TILLING-Bevölkerung von Reis

Es wäre sehr nützlich für Zuchteigenschaften, die technisch schwierig oder kostspielig zu bestimmen sind, wie Krankheitsresistenz, Mineralgehalt. Es ist eine ziemlich einfache, kostengünstige und hohe Durchsatztechnik. Legen Sie zunächst vier Blattscheiben in jeden Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte.

Fügen Sie 50 Milliliter Puffer Eine Lösung in jeden Brunnen. Einfrieren der Platte in einem minus 80-Grad-Gefrierschrank für 10 Minuten. Dann die Platte bei Raumtemperatur einfrieren.

Bei 95 Grad Celsius 10 Minuten inkubieren. Fügen Sie 50 Mikroliter Puffer B zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie sie gut durch Wirbeln. Zentrifugieren Sie die Platte für eine Minute bei 1, 500 mal g.

Sammeln Sie den Überstand als DNA für PCR. Verwenden Sie zunächst den DNA-Überstand aus einer sowie PCR-Vorlage, um die Glühtemperatur zu optimieren. Fügen Sie Reagenzien und einen Mikroliter DNA-Überstand in jeden PCR-Brunnen ein.

Legen Sie die PCR-Rohre in einen gradientenfähigen Wärmeblock und passen Sie das Heizprogramm entsprechend dem Manuskript an, um die optimale Glühtemperatur für jedes Zielfragment zu bestimmen. Führen Sie die Elektrophorese für das PCR-Produkt auf 1%Agarose-Gelen durch, um Amplicons zu untersuchen. Bestimmen Sie die optimale Glühtemperatur, die eine spezifische Verstärkung des Zielfragments ermöglicht.

Kombinieren Sie zur Durchführung der HRM-Analyse Reagenzien, einschließlich eines Mikroliters des 10-fachen Fluoreszenzfarbstoffs und eines Mikroliters des DNA-Überstands in jedem Brunnen der HRM-kompatiblen Platten. In jeder Platte, enthalten eine wilde Art parented Probe und eine negative Kontrolle ohne DNA. Fügen Sie jedem Brunnen einen Tropfen Mineralöl hinzu, um Verdunstung zu verhindern.

Versiegeln Sie die Platte dann mit Klebefolie und zentrifugieren Sie eine Minute lang 1000 mal g. Führen Sie die PCR mit der optimierten Glühtemperatur aus. Entfernen Sie nun den Klebefilm von der Platte, und legen Sie die Platte in eine HRM-Maschine ein.

Wählen Sie in der Software Neue Ausführung aus dem Dateimenü aus, oder drücken Sie die Schaltfläche Ausführen am oberen Bildschirmrand. Geben Sie die Anfangs- und Endtemperaturen für die Schmelze von 55 bis 95 Grad Celsius an. Wählen Sie Proben für die hochauflösende Schmelzanalyse aus, und schließen Sie Proben aus, die dem Negativkontroll ähnelt.

Normalisieren Sie die Schmelzkurven, um die gleiche Anfangs- und Endfluoreszenz zu haben. Bestätigen Sie visuell, dass sich die Cursor der unteren minimalen und unteren maximalen Temperatur in einem Bereich der Kurven befinden. Halten Sie das Delta F, die Fluoreszenzdifferenz, auf dem Niveau der Standardeinstellung 05.

Wählen Sie in der Auswahlliste Standards die allgemeine/Variante aus, und wählen Sie die normale Empfindlichkeit aus. Wählen Sie H12 aus, um den Wildtyp als Steuerelement zu verwenden. Proben mit einem Delta-F-Wert größer als 05 werden als mutierte Pflanze betrachtet.

Dann, mit einer CTAB-Methode, extrahieren SIE DNA aus jeder der vier Pflanzen aus dem Mutantenbecken mit der Schmelzkurve deutlich anders als die Wild-Typ. Nach der Quantifizierung mit einem Spektralphotometer passen Sie die DNA mit dem NanoDrop 2000 auf eine Endkonzentration von ca. 25 Nanogramm pro Mikroliter an. Fügen Sie 0,4 Mikroliter PCR-Primer in die DNA-Probe in den PCR-Röhren, legen Sie sie in einen thermischen Cycler und passen Sie das Programm an, um das Zielfragment zu verstärken.

Senden Sie dann die PCR-Produkte zur Sequenzierung an ein Unternehmen. Vergleichen Sie nach der Sanger-Sequenzierung die molekulare Läsion, indem Sie die Sequenzen zwischen der M2-Pflanze und der Wildart vergleichen. In dieser Studie zeigten HRM-Scans und Analysen von M2-Sämlingen auf Mutationen in OsLCT1- oder SPDT-Genen, dass die meisten Proben Schmelzkurven hatten, die sich nicht signifikant vom Wildtyp mit Delta F unter 05 unterschieden.

Die Mutanten zeigten signifikant unterschiedliche HRM-Kurven mit Delta Fs größer als 05 bei Temperaturen von 90 bis 92 Grad Celsius bzw. 81,5 bis 83,5 Grad Celsius. Der Mutationstyp und die Position der Gene von 4, 560 M2 Sämlingen wurden durch die Sequenzierungschromatogramme bestätigt. Es wurde eine heterozygote Stelle mit einer Mutation von G zu A bei 4, 304 Basenpaaren von OsLCT1 identifiziert.

Eine einzige Nukleotid-Einfügung erschien bei den 4, 240 Basispaaren von OsLCT1, und eine TTC-Trinukleotid-Deletion wurde an der Position 5, 948 bis 5, 950 Basispaare von SPDT beobachtet. Ich optimiere die PCR vor der HRM-Analyse. Der Farbstoff im Gel ist etwas schädlich.

Denken Sie daran, Handschuhe anzuziehen, wenn Sie das Gel laufen.