Cortisol-Extraktion aus Störflossen und Kieferknochenmatrizen
September 10th, 2019
In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Cortisolextraktion aus der Flosse und dem Kieferknochen von Störarten vor. Der Fin- und Kieferknochen-Cortisolspiegel wurde weiter untersucht, indem zwei Waschlösungsmittel mit anschließenden ELISA-Assays verglichen wurden. Diese Studie untersuchte die Durchführbarkeit von Kieferknochen-Cortisol als neuartigen Stressindikator.
Unsere Methode führt einen neuartigen alternativen Stressindikator ein, der eine Plattform für zahlreiche zukünftige Studien zur Messung von Cortisol in neuen Nicht-Plot- und Haarmatrizen sein könnte. Die Vorteile dieser Technik sind ihre Einfachheit und ihre Fähigkeit, stresslevel auch bei geschlachteten Tieren zu bewerten. Die Herstellung einer Beziehung zwischen hohen Cortisolspiegel und gesunden Tieren oder Menschen mit dieser Technik kann bei der Diagnose einiger Krankheiten helfen.
Diese Methode kann auch verwendet werden, um jahrhundertealte biologische Proben wie diese alten Fossilien zu untersuchen, um Stressniveaus innerhalb der Probenlebensdauer zu bewerten. Für die Cortisolextraktion 300 plus oder minus 10 Milligramm jeder Probe auf einer digitalen analytischen Skala mit einer Genauigkeit von 0,0001 wiegen, bevor Sie die Proben in einzelne 15 Milliliter konische Röhren legen. Fügen Sie drei Milliliter Isopropanol zu jedem Probenröhrchen hinzu und drehen Sie die Rohre mit 80 Umdrehungen pro Minute für 2,5 Minuten, um das Cortisol auszuwaschen und mögliche äußere Verunreinigungen zu entfernen.
Nach der letzten Wäsche trocknen die Proben sieben Tage lang bei Raumtemperatur, bevor die Proben noch dreimal gewaschen werden, wie mit frischem Ultra-Rindwasser für jede Wäsche demonstriert. Wiegen Sie 75 plus oder minus fünf Milligramm getrocknete Flossen- oder Kieferknochenprobe ab und verwenden Sie einen Perlenschlag, um die Probe schließlich 32 Minuten lang bei 50 Hertz zu mahlen. Dann 1,5 Milliliter Methanol in jedes Rohr der pulverförmigen Flosse oder Kieferknochen liefern und die Proben auf einem Rohrrotator bei 40 Umdrehungen pro Minute für 18 Stunden bei Raumtemperatur platzieren.
Nach der Cortisolextraktion die Probengewebe durch Zentrifugation sedimentieren. Und übertragen Sie den oberen Milliliter der gelblichen, organischen Cortisol-haltigen Schicht aus jeder Probe in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre. Trocknen Sie die Cortisolproben bei 38 Grad Celsius in einer Dunstabzugshaube über Nacht, um das Methanol zu verdampfen.
Am nächsten Morgen 400 Mikroliter PBS zu jedem Röhrchen und Wirbel hinzufügen und zentrifugieren die Proben, um das Cortisol zu sammeln. Für die ELISA-Analyse 25 Mikroliter jeder extrahierten Standard-Cortisolprobe und duplizierte in die entsprechenden Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte. 25 Mikroliter Assay-Verdünnungsstoff in zwei Brunnen laden, um als Null und in jeden unspezifischen Bindungsbrunnen zu dienen.
Mischen Sie 15 Mikroliter Enzymkonjugat mit 24 Milliliter Assay-Verdünnungsmittel und fügen Sie 200 Mikroliter Konjugat zu jedem Brunnen hinzu. Mischen Sie die Platte auf einem Rotator für fünf Minuten bei 500 Umdrehungen pro Minute. Gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation die Platte viermal mit 300 Mikrolitern 1x Waschpuffer pro Brunnen waschen. Schnelles Umkehren der Platte über dem Waschbecken nach jeder Wäsche, um den Puffer zu entsorgen und die Platte auf einem Stapel Papiertücher zu bloten. Nach der letzten Wäsche 200 Mikroliter TMB-Substratlösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte fünf Minuten lang bei 500 Umdrehungen pro Minute auf den Rotator legen.
Nach dem Mischen 25 Minuten lang bei Lichtschutz inkubieren. Am Ende der Inkubation 50 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen. Und mischen Sie den Platteninhalt auf dem Rotator für drei Minuten bei 500 Umdrehungen pro Minute oder bis alle Brunnen von grün zu gelb gedreht sind.
Lesen Sie dann die optische Dichte der Proben und verwenden Sie die Mikroplattensoftware, um die Cortisolspiegel in jeder Probe in Piktogramme pro Milligramm umzuwandeln. In dieser repräsentativen Analyse waren die Cortisolspiegel in Flossenproben, die mit Isopropanol gewaschen wurden, höher als bei denen, die mit Wasser gewaschen wurden, aber bei den Störarten wurden keine signifikanten Unterschiede in den Fin-Cortisol-Spiegeln beobachtet. Es gab keine signifikante Wechselwirkung zwischen Waschmittel und Störarten.
Die Untersuchung von Cortisol aus H.Huso-Kieferknochen, um festzustellen, ob Störkieferknochen als alternative Matrix zu Flossen verwendet werden könnten, ergab, dass das Waschlösungsmittel keine signifikante Wirkung auf den Cortisolspiegel hatte, gemessen in H.Husos Stör. Darüber hinaus zeigten die Daten eine hohe Ähnlichkeit zwischen den Flossen von drei getesteten Störarten und in H.Huso Kieferknochen. Es ist wichtig, den Perlenschlag zu verwenden, um die Proben zu feinem Pulver zu mahlen und ein geeignetes kommerzielles ELISA Assay Kit für eine erfolgreiche Cortisolmessung zu verwenden.
Diese Methode kann auch zum Nachweis von Cortisol in Zähnen und anderen harten Matrizen verwendet werden, da Cortisol-Niveaumessungen wichtige Informationen darüber liefern, wie sich die Umwelt auf die Tierbiologie auswirkt. Die Methode könnte als neuer Ansatz zur Bewertung des Cortisolspiegels in menschlichen Kindermilchzähnen und in pädiatrischen Endokrinologie-, Psychobiologie-, Verhaltens-, archäologischen und forensischen Studien verwendet werden.
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Überblick
Diese Studie präsentiert ein Protokoll für die Extraktion von Cortisol aus der Flosse und dem Kieferknochen von Störarten und untersucht die Wirksamkeit von zwei Waschlösungsmitteln gefolgt von ELISA-Tests. Die Forschung hebt das Potenzial von Kieferknochen-Cortisol als neuartiger Stressindikator hervor.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologie
Hintergrund
- Cortisol ist ein wichtiges Stresshormon.
- Traditionelle Methoden zur Messung von Cortisol können invasiv sein.
- Die Erforschung alternativer Matrixen für die Cortisol-Messung ist unerlässlich.
- Kieferknochen-Cortisol wurde als Stressindikator noch nicht umfassend untersucht.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls für die Cortisol-Extraktion aus Störflosse und -kieferknochen.
- Evaluierung der Machbarkeit von Kieferknochen-Cortisol als Stressindikator.
- Vergleich der Wirksamkeit verschiedener Waschlösungsmittel bei der Cortisol-Extraktion.
Verwendete Methoden
- Proben von Flossen und Kieferknochen wurden von Störarten gesammelt.
- Die Cortisol-Extraktion beinhaltete das Wiegen der Proben und die Verwendung von Isopropanol als Waschlösungsmittel.
- ELISA-Tests wurden durchgeführt, um Cortisol-Spiegel zu messen.
- Eine vergleichende Analyse der Waschlösungsmittel wurde durchgeführt.
Hauptergebnisse
- Kieferknochen-Cortisol-Spiegel wurden erfolgreich extrahiert und gemessen.
- Verschiedene Waschlösungsmittel zeigten unterschiedliche Wirksamkeit bei der Cortisol-Extraktion.
- Die Studie unterstützt das Potenzial von Kieferknochen-Cortisol als Stressindikator.
- Diese Methode könnte zukünftige Forschungen zu Stress in verschiedenen biologischen Proben erleichtern.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ist eine einfache und effektive Methode für die Cortisol-Extraktion.
- Kieferknochen-Cortisol kann als zuverlässiger Stressindikator in der Forschung dienen.
- Diese Technik eröffnet Möglichkeiten für die Untersuchung von Stress sowohl in zeitgenössischen als auch in alten biologischen Proben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This study establishes a non-invasive cortisol extraction protocol from sturgeon fin and jawbone matrices, offering a novel stress indicator for preclinical and translational research. The method enables stress biomarker assessment in archival and slaughtered samples, supporting longitudinal and cross-species studies. Its simplicity and adaptability to hard tissues provide strategic value for de-risking target validation in neuroendocrine and behavioral discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stress-response pathways via cortisol as a functional biomarker in vertebrate models.
- Operational Value: Provides a reproducible extraction workflow for fin and jawbone tissues using standardized solvent washes and bead-based homogenization.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating cortisol levels with phenotypic stress states in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative cortisol readouts via ELISA compatible with high-throughput screening of environmental or genetic modulators.
- Operational Value: Demonstrates low intra- and inter-assay variability (14.15% and 7.70% CV), ensuring assay reliability for compound screening campaigns.
- Scalability: Uses minimal sample mass (300 ± 10 mg) and standard lab equipment, enabling adaptation to multi-well formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Jawbone cortisol shows promise as a cross-matrix biomarker, enabling correlation between fin and skeletal tissue stress responses.
- Preclinical Model Relevance: Applicable to zebrafish, rodent, and other vertebrate models where fin or cranial bone matrices are accessible.
- Archival Sample Utility: Enables stress biomarker analysis in historical or fossilized samples, supporting evolutionary and developmental toxicology studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a stress biomarker readout that informs target engagement and phenotypic screening outcomes.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of neuroendocrine targets by quantifying cortisol as a downstream effector of HPA axis modulation.
- Screening: Delivers ELISA-compatible cortisol measurements enabling dose-response analysis in compound libraries.
- Analytics: Outputs cortisol concentration (pg/mg) suitable for statistical comparison across treatment groups using GLM or similar models.
- Translational Research: Supports biomarker continuity from discovery specimens to preclinical tissues via cross-matrix validation in fin and jawbone.
- Enterprise Reuse: Protocol is reagent- and equipment-light, allowing standardization across sites for multi-study biomarker programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stress-related target validation by providing direct hormone measurement.
- Operational Value: Uses accessible solvents (water, isopropanol, methanol) and standard lab hardware (centrifuge, rotator, ELISA reader).
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by identifying target-linked stress phenotypes before functional assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets with demonstrated modulation of cortisol response in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization, solvent-based extraction, and ELISA assay execution.
- Dependent on access to centrifuge, tube rotator, bead beater, and microplate reader with temperature control.
- Necessitates standardization of wash solvent choice and drying duration across labs for cross-study comparability.
- Adaptation to other species or tissues may require optimization of sample mass and extraction time.
- Limited by ELISA antibody specificity and potential matrix effects in highly mineralized samples like jawbone.
