Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen in fragilen X Mental Retardation-1 Gen
September 16th, 2019
Ein genauer und robuster, auf Polymerasekettenreaktion basierender Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen im Fragile X-Gen für geistige Retardierung-1 erleichtert die molekulare Diagnose und das Screening des Fragile X-Syndroms und des fragilen X-bezogenen Störungen mit kürzerer Umschaltzeit und Investitionen in Ausrüstung.
Diese kostengünstige Methode kann breite Anwendungen in der molekularen Diagnose und Screening von FXS und Fragile X-bezogenen Erkrankungen finden. Es ist schnell in der Durchlaufzeit und weniger Investitionen in Ausrüstung. Unser PCR-basierter Assay kann die Klassifizierung des gesamten Spektrums der FXS- und Fragile X-assoziierten Störungen, einschließlich Zwischen-, Vormutations- und Vollmutation, mit Robustheit und schneller Berichtszeit erleichtern.
Das Verfahren wird von Weng Chua von PerkinElmer Singapur demonstriert. Beginnen Sie mit dem Entfernen des PCR-Puffermixes, der Probenverdünnung und dna-Proben aus dem 20-Grad-Gefrierschrank und lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur, um aufzutauen. Vor der Verwendung der Reagenzien Wirbel und kurz drehen Sie sie nach unten.
Messen Sie die DNA-Probenkonzentration mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie sie bei Bedarf mit Probenverdünnung auf 25 Nanogramm pro Mikroliter. Beschriften Sie die Bohrungen einer PCR-Platte, um Referenz- und getestete DNA-Proben zu identifizieren und die Anzahl der Reaktionen zu berechnen, die für die Test-, Referenz- und Negativkontrollproben erforderlich sind. Bereiten Sie den PCR-Master-Mix vor, indem Sie 15 Mikroliter PCR-Puffermischung auf 0,6 Mikroliter Probenverdünnungsmittel und 0,4 Mikroliter Polymerase für jede Reaktion kombinieren.
Wirbeln Sie die Mischung und drehen Sie es nach unten. Dann 18 Mikroliter der Mischung in jeden Brunnen geben. Dann Pipette zwei Mikroliter jeder DNA in den entsprechenden Brunnen.
Mischen Sie die Reagenzien, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen, dann versiegeln Sie die Platte. Legen Sie die Platte in den Thermocycler und führen Sie die PCR entsprechend den Manuskriptrichtungen aus. Den Inkubator-Shaker auf 65 Grad Celsius vorheizen und jedem PCR-Produkt 80 Mikroliter 1X TE Puffer hinzufügen.
Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Proben auf eine PCR-Reinigungsplatte zu übertragen und legen Sie die Platte in den Shaker. Inkubieren Sie es bei 65 Grad Celsius, während es bei 1200 RPM für 10 Minuten schüttelt. Nach der Inkubation den Inkubator-Shaker auf 25 Grad Celsius abkühlen, das Vakuumgerät auf 250 Millibar stellen und die Lösung durch den Filter ansaugen.
Nach 15 Minuten sollten die Brunnen keine Flüssigkeit mehr haben. Schalten Sie das Vakuum aus und fügen Sie jedem Bohrwert 50 Mikroliter 1X TE-Puffer hinzu. Aspirieren Sie die Lösung für 10 Minuten mit den vorherigen Vakuumeinstellungen.
Trocknen Sie den Boden der Filterplatte, indem Sie sie fest auf einen Stapel Papiertücher drücken und fügen Sie dann 20 Mikroliter 1X TE Puffer in die untere Mitte jedes Brunnens. Legen Sie die Platte in den Shaker und brüten bei 25 Grad Celsius beim Schütteln bei 1200 RPM für fünf Minuten. Nach der Inkubation mindestens 15 Mikroliter des gereinigten PCR-Produkts auf eine frische 96-Well-PCR-Platte übertragen.
Bringen Sie vor dem Start das DNA-Farbstoffkonzentrat, die DNA-Gelmatrix, den DNA-Marker, die DNA-Leiter und gereinigte DNA-Proben auf Raumtemperatur. Richten Sie die Grundierstation ein, indem Sie die Spritze ersetzen und die Grundplatte anpassen, dann den Hebel des Spritzenclips loslassen und in die obere Position schieben. Starten Sie die Größensoftware und bereiten Sie den Gelfarbstoff-Mix vor.
Wirbeln Sie das Farbstoffkonzentrat für 10 Sekunden, dann drehen Sie es nach unten. Dann fügen Sie 25 Mikroliter des Farbstoffs zu einem Gel Matrix Fläschzeichen und Wirbel die Lösung zu mischen. Übertragen Sie die Gelfarbstoffmischung in einen Spinfilter, legen Sie sie in die Zentrifuge und drehen Sie sie 10 Minuten bei 1500 mal g.
Wenn Sie bereit sind, den Gelfarbstoff-Mix zu laden, legen Sie einen neuen DNA-Chip in die Grundierstation ein und fügen Sie neun Mikroliter des Gelfarbstoff-Mixes in den Mitbohrer G.Close the priming station ein und stellen Sie sicher, dass der Kolben an der Ein-Milliliter-Marke positioniert ist. Drücken Sie den Spritzenkolben nach unten, bis er durch den Clip gehalten wird. Warten Sie genau 30 Sekunden, und lassen Sie dann den Clip los.
Warten Sie noch fünf Sekunden, und ziehen Sie den Kolben langsam wieder in die Ein-Milliliter-Position. Öffnen Sie die Grundierstation und fügen Sie neun Mikroliter Gelfarbstoff mischung in die mit G.Add five mikroliters Marker markierten Brunnen in den Brunnen mit einem Leitersymbol und jeder der 12 Probenbrunnen. Fügen Sie einen Mikroliter der Leiter mit dem Leitersymbol und einen Mikroliter des PCR-Produkts oder Wasser in die Probenbrunnen.
Wirbel n. Chr. für eine Minute bei 2400 RPM. Legen Sie es in den Bioanalyzer und führen Sie den Chip innerhalb von fünf Minuten. Wenn die Ausführung abgeschlossen ist, exportieren Sie die Spitzendaten als csv-Tabellendateien.
Als Referenzproben werden eine weibliche Prämutationsprobe und eine vollständige Mutationsprobe verwendet. Ein oberer und niedrigerer Marker-Peak sind im Fragmentgrößenprofil enthalten, und es gibt in der Regel einen Primer-Komplex-Peak bei etwa 95 Base-Paaren. Diese Referenzbeispiele werden verwendet, um eine Regressionsstandardkurve zu erstellen.
Die lineare Regressionsstandardkurve wird dann verwendet, um Wiederholungsgrößen unbekannter Stichproben zu berechnen. Klinische Normal-, Zwischen-, Prämutations-, Vollmutations- und Mosaik-Vollmutationsproben können mit dieser Methode korrekt klassifiziert werden. In einigen Fällen wird nur ein Peak in den ergebnissen der mikrofluidischen Elektrophorese angezeigt, was wahrscheinlich auf das Vorhandensein normaler homozygoter Allele zurückzuführen ist.
Eine Art von suboptimalem Ergebnis ist die Basisverzerrung, die mehrdeutig oder nicht interpretierbar sein kann und im Verdacht steht, durch Fehlfunktionen des Instruments verursacht zu werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, eine angemessene Menge an DNA und Qualität zu gewährleisten, bevor Sie das Protokoll starten. Die FMR1-Gensequenzierung kann durchgeführt werden, um das AGG-Unterbrechungsmuster zu identifizieren.
Und methylierungsempfindliches Restriktionsenzym oder Bisulfidmodifikationstest kann zur Überwachung des Methylierungsstatus verwendet werden. Dies ist eine schnelle, robuste und kostengünstige Technik. Es wird andere Forscher bei der Durchführung einer bevölkerungsbasierten Studie über den Trägerstatus von FXS und fragilen X-assoziierten Störungen unterstützen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt einen kostengünstigen, auf der Polymerase-Kettenreaktion basierenden Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen im Fragile-X-mentalen Retardierungs-1-Gen vor. Die Methode verbessert die molekulare Diagnostik und das Screening von Fragile-X-Syndrom und verwandten Störungen mit verbesserter Durchlaufzeit und reduzierten Geräteinvestitionen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Molekulare Biologie
- Genetik
- Klinische Diagnostik
Hintergrund
- Das Fragile-X-Syndrom ist eine genetische Erkrankung, die durch Mutationen im FMR1-Gen verursacht wird.
- Traditionelle Diagnosemethoden können zeitaufwändig und kostspielig sein.
- Es besteht ein Bedarf an effizienten und zuverlässigen Screening-Techniken.
- Diese Studie stellt einen PCR-basierten Assay vor, um diese Herausforderungen zu bewältigen.
Zweck der Studie
- Um einen robusten Assay zur Quantifizierung von Trinukleotid-Wiederholungen im FMR1-Gen zu entwickeln.
- Um die Klassifizierung von Fragile-X-Syndrom und verwandten Störungen zu erleichtern.
- Um die Zeit und Kosten für die molekulare Diagnostik zu reduzieren.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung des PCR-Puffer-Mixes und der DNA-Proben.
- Auftauen der Reagenzien bei Raumtemperatur.
- Vortexen und Zentrifugieren der Proben vor der Verwendung.
- Anwendung des PCR-Assays zur Klassifizierung von FXS und verwandten Störungen.
Hauptergebnisse
- Der Assay zeigte Robustheit bei der Erkennung verschiedener Mutationen.
- Ergebnisse wurden schnell gemeldet und verbesserten die klinische Entscheidungsfindung.
- Er klassifizierte effektiv das gesamte Spektrum der Fragile-X-assoziierten Störungen.
- Die Methode erwies sich als kostengünstig mit minimalen Geräteanforderungen.
Schlussfolgerungen
- Der PCR-basierte Assay ist ein bedeutender Fortschritt in der Fragile-X-Diagnostik.
- Er bietet eine zuverlässige und effiziente Alternative zu traditionellen Methoden.
- Dieser Ansatz kann die Patientenergebnisse durch rechtzeitige Diagnose verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of CGG trinucleotide repeats in the FMR1 gene is critical for early-stage target validation and risk stratification in neurogenetic disorder pipelines. This robust PCR-based assay enables reproducible, scalable, and cost-effective measurement of repeat expansions, supporting confident classification and triage of Fragile X-associated genetic liabilities. Its rapid turnaround and broad dynamic range facilitate integration into high-throughput screening and translational research workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of FMR1 CGG repeat expansions for genetic target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing normal, intermediate, premutation, and full mutation alleles.
- Facilitates portfolio triage by providing actionable genetic classification data.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible PCR-based outputs suitable for downstream molecular screening.
- Standardizes fragment sizing and repeat quantification using reference standards and regression analysis.
- Enables scalable, high-throughput screening of population or cohort samples for carrier status.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic classification with disease-relevant models for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust genotyping.
- Reduces biological ambiguity in preclinical model selection and risk-adjusted advancement.
Pipeline & Workflow Integration
This PCR-based quantification method fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless integration into genetic screening, target validation, and translational biomarker workflows.
- Discovery Biology: Provides quantitative, hypothesis-driven assessment of FMR1 repeat expansions for mechanistic studies.
- Screening: Offers reproducible, standardized outputs for assay development and population screening.
- Analytics: Generates quantitative fragment sizing and regression-based repeat number determination for robust data comparison.
- Translational Research: Supports alignment of genetic findings with disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, cost-effective platform for ongoing genetic screening and research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable assay performance with rapid turnaround.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early, accurate genetic classification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurogenetic disorder programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR, capillary electrophoresis, and data analysis software.
- Needs access to thermocyclers, microfluidic capillary electrophoresis instruments, and validated reference standards.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- Adaptable to various sample types but dependent on DNA quality and quantity.
- Instrument malfunction or suboptimal sample quality can affect data interpretability and require troubleshooting.
