Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen in fragilen X Mental Retardation-1 Gen

Diese kostengünstige Methode kann breite Anwendungen in der molekularen Diagnose und Screening von FXS und Fragile X-bezogenen Erkrankungen finden. Es ist schnell in der Durchlaufzeit und weniger Investitionen in Ausrüstung. Unser PCR-basierter Assay kann die Klassifizierung des gesamten Spektrums der FXS- und Fragile X-assoziierten Störungen, einschließlich Zwischen-, Vormutations- und Vollmutation, mit Robustheit und schneller Berichtszeit erleichtern.

Das Verfahren wird von Weng Chua von PerkinElmer Singapur demonstriert. Beginnen Sie mit dem Entfernen des PCR-Puffermixes, der Probenverdünnung und dna-Proben aus dem 20-Grad-Gefrierschrank und lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur, um aufzutauen. Vor der Verwendung der Reagenzien Wirbel und kurz drehen Sie sie nach unten.

Messen Sie die DNA-Probenkonzentration mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie sie bei Bedarf mit Probenverdünnung auf 25 Nanogramm pro Mikroliter. Beschriften Sie die Bohrungen einer PCR-Platte, um Referenz- und getestete DNA-Proben zu identifizieren und die Anzahl der Reaktionen zu berechnen, die für die Test-, Referenz- und Negativkontrollproben erforderlich sind. Bereiten Sie den PCR-Master-Mix vor, indem Sie 15 Mikroliter PCR-Puffermischung auf 0,6 Mikroliter Probenverdünnungsmittel und 0,4 Mikroliter Polymerase für jede Reaktion kombinieren.

Wirbeln Sie die Mischung und drehen Sie es nach unten. Dann 18 Mikroliter der Mischung in jeden Brunnen geben. Dann Pipette zwei Mikroliter jeder DNA in den entsprechenden Brunnen.

Mischen Sie die Reagenzien, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen, dann versiegeln Sie die Platte. Legen Sie die Platte in den Thermocycler und führen Sie die PCR entsprechend den Manuskriptrichtungen aus. Den Inkubator-Shaker auf 65 Grad Celsius vorheizen und jedem PCR-Produkt 80 Mikroliter 1X TE Puffer hinzufügen.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Proben auf eine PCR-Reinigungsplatte zu übertragen und legen Sie die Platte in den Shaker. Inkubieren Sie es bei 65 Grad Celsius, während es bei 1200 RPM für 10 Minuten schüttelt. Nach der Inkubation den Inkubator-Shaker auf 25 Grad Celsius abkühlen, das Vakuumgerät auf 250 Millibar stellen und die Lösung durch den Filter ansaugen.

Nach 15 Minuten sollten die Brunnen keine Flüssigkeit mehr haben. Schalten Sie das Vakuum aus und fügen Sie jedem Bohrwert 50 Mikroliter 1X TE-Puffer hinzu. Aspirieren Sie die Lösung für 10 Minuten mit den vorherigen Vakuumeinstellungen.

Trocknen Sie den Boden der Filterplatte, indem Sie sie fest auf einen Stapel Papiertücher drücken und fügen Sie dann 20 Mikroliter 1X TE Puffer in die untere Mitte jedes Brunnens. Legen Sie die Platte in den Shaker und brüten bei 25 Grad Celsius beim Schütteln bei 1200 RPM für fünf Minuten. Nach der Inkubation mindestens 15 Mikroliter des gereinigten PCR-Produkts auf eine frische 96-Well-PCR-Platte übertragen.

Bringen Sie vor dem Start das DNA-Farbstoffkonzentrat, die DNA-Gelmatrix, den DNA-Marker, die DNA-Leiter und gereinigte DNA-Proben auf Raumtemperatur. Richten Sie die Grundierstation ein, indem Sie die Spritze ersetzen und die Grundplatte anpassen, dann den Hebel des Spritzenclips loslassen und in die obere Position schieben. Starten Sie die Größensoftware und bereiten Sie den Gelfarbstoff-Mix vor.

Wirbeln Sie das Farbstoffkonzentrat für 10 Sekunden, dann drehen Sie es nach unten. Dann fügen Sie 25 Mikroliter des Farbstoffs zu einem Gel Matrix Fläschzeichen und Wirbel die Lösung zu mischen. Übertragen Sie die Gelfarbstoffmischung in einen Spinfilter, legen Sie sie in die Zentrifuge und drehen Sie sie 10 Minuten bei 1500 mal g.

Wenn Sie bereit sind, den Gelfarbstoff-Mix zu laden, legen Sie einen neuen DNA-Chip in die Grundierstation ein und fügen Sie neun Mikroliter des Gelfarbstoff-Mixes in den Mitbohrer G.Close the priming station ein und stellen Sie sicher, dass der Kolben an der Ein-Milliliter-Marke positioniert ist. Drücken Sie den Spritzenkolben nach unten, bis er durch den Clip gehalten wird. Warten Sie genau 30 Sekunden, und lassen Sie dann den Clip los.

Warten Sie noch fünf Sekunden, und ziehen Sie den Kolben langsam wieder in die Ein-Milliliter-Position. Öffnen Sie die Grundierstation und fügen Sie neun Mikroliter Gelfarbstoff mischung in die mit G.Add five mikroliters Marker markierten Brunnen in den Brunnen mit einem Leitersymbol und jeder der 12 Probenbrunnen. Fügen Sie einen Mikroliter der Leiter mit dem Leitersymbol und einen Mikroliter des PCR-Produkts oder Wasser in die Probenbrunnen.

Wirbel n. Chr. für eine Minute bei 2400 RPM. Legen Sie es in den Bioanalyzer und führen Sie den Chip innerhalb von fünf Minuten. Wenn die Ausführung abgeschlossen ist, exportieren Sie die Spitzendaten als csv-Tabellendateien.

Als Referenzproben werden eine weibliche Prämutationsprobe und eine vollständige Mutationsprobe verwendet. Ein oberer und niedrigerer Marker-Peak sind im Fragmentgrößenprofil enthalten, und es gibt in der Regel einen Primer-Komplex-Peak bei etwa 95 Base-Paaren. Diese Referenzbeispiele werden verwendet, um eine Regressionsstandardkurve zu erstellen.

Die lineare Regressionsstandardkurve wird dann verwendet, um Wiederholungsgrößen unbekannter Stichproben zu berechnen. Klinische Normal-, Zwischen-, Prämutations-, Vollmutations- und Mosaik-Vollmutationsproben können mit dieser Methode korrekt klassifiziert werden. In einigen Fällen wird nur ein Peak in den ergebnissen der mikrofluidischen Elektrophorese angezeigt, was wahrscheinlich auf das Vorhandensein normaler homozygoter Allele zurückzuführen ist.

Eine Art von suboptimalem Ergebnis ist die Basisverzerrung, die mehrdeutig oder nicht interpretierbar sein kann und im Verdacht steht, durch Fehlfunktionen des Instruments verursacht zu werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, eine angemessene Menge an DNA und Qualität zu gewährleisten, bevor Sie das Protokoll starten. Die FMR1-Gensequenzierung kann durchgeführt werden, um das AGG-Unterbrechungsmuster zu identifizieren.

Und methylierungsempfindliches Restriktionsenzym oder Bisulfidmodifikationstest kann zur Überwachung des Methylierungsstatus verwendet werden. Dies ist eine schnelle, robuste und kostengünstige Technik. Es wird andere Forscher bei der Durchführung einer bevölkerungsbasierten Studie über den Trägerstatus von FXS und fragilen X-assoziierten Störungen unterstützen.