Name: Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Lernen Sie die optimierte Isolierung, Kultur und Transfektion primärer menschlicher Monozyten für HIV-Immunforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung monozytärer Immunfunktionen bei Infizierten und gesunden Kontrollpersonen.

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Die Autoren danken dem HIV Clinical/Tumor Biorepository Core für die Bereitstellung von Patientenproben und dem Cellular Immunology Metabolism Core für die Bereitstellung von Durchflusszytometrieanalysen. Dieses Projekt wurde von NIH P20GM121288 und P30GM114732 finanziert.

Alle unten beschriebenen Methoden wurden vom Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board genehmigt. Das gesamte Blut wurde nach Einholung der Einwilligung in Kenntnis der Sachlage entnommen.
HINWEIS: Das gesamte Verfahren wird unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitseinrichtung der Stufe 2 (BSL2) durchgeführt, so dass beim Umgang mit biologischen Materialien Vorsicht geboten ist. Insbesondere wird jeder Schritt mit sterilen Techniken unter einem Biosicherheitsschrank durchgeführt. Nach jedem Schritt mit Blut, Blutprodukten, Zellen oder ZellproduktPipettierung ist es wichtig, das gesamte Kunststoffmaterial (d. h. serologische Pipetten, Pipettenspitzen und Tuben) vor der ordnungsgemäßen Entsorgung mit 10% Bleichmittel aus einem Abfallbehälter in der Haube zu spülen.
1. Isolierung primärer menschlicher Monozyten durch immunmagnetische Negativselektion
<ol><li>Sammeln Sie 40 ml frisches, menschliches Vollblut (entweder von einem HIV+ Patienten oder einer gesunden Kontrolle) in vier 10 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Vakuumröhren (10 ml Blut pro Tube). Übertragen Sie alle 40 ml Blut mit sterilen Techniken unter einem Biosicherheitsschrank in ein 50 ml konisches Propylenrohr.</li>
	<li>Nach dem Herstellerprotokoll für das ausgewählte menschliche Monozyten-Isolationskit (Tabelle der Materialien) fügen Sie 2 ml Monozyten-Isolationscocktail, im Kit vorgesehen, in die Blutröhre ein. Vortex magnetische Perlen, auch im Kit vorgesehen, für 30 s, und fügen Sie 2 ml, um die Röhre des Blutes.<ol>
<li>Wenn weniger als 40 ml Blut zur Verfügung stehen, verkleinern Sie die zugesetzten Reagenzien. Um die Lösung zu mischen, Pipette nach oben und unten mit einer 25 ml serologischen Kunststoffpipette und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trennen Sie das Blutgemisch gleichmäßig in vier 50 ml-Röhrchen und fügen Sie 30 ml sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) mit 1 mM EDTA in jedes Röhrchen. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten mit einer 25 ml serologischen Pipette aus Kunststoff.</li>
	<li>Legen Sie die Rohre 10 min in Magnethalter, um die antikörperkonjugierten Magnetperlen zu entfernen. Verwenden Sie vier Magnethalter gleichzeitig, einen für jede Röhre, um konsistente Inkubations- und Isolationszeiten für jede Blutprobe zu ermöglichen.</li>
	<li>Zeichnen Sie den Inhalt aus der Mitte jedes Rohres mit einer Pipette, während sie sich noch in den Magnethaltern befinden. Achten Sie darauf, keine roten Blutkörperchen (nicht mehr als 10 % des 10 ml Startvolumens) zu erstellen und den Inhalt in eine von vier neuen 50 ml-Röhren zu legen.</li>
	<li>Fügen Sie jedem 50 ml-Rohr 500 l wirbelnde Magnetperlen hinzu. Pipette rauf und runter mit einer 25 ml Pipette und inkubieren bei RT für 5 min. Legen Sie die Rohre dann 5 min in Magnethalter.</li>
	<li>Übertragen Sie den Inhalt vorsichtig aus der Mitte jedes Rohres, während Sie noch in Magnethaltern in einem von vier neuen 50 ml-Rohren sind. Legen Sie jedes neue 50 ml Rohr für 5 min direkt in die Magnethalter.</li>
	<li>Übertragen Sie den Inhalt vorsichtig von der Mitte jedes Rohres in eines von vier neuen 50 ml-Rohren. Drehen Sie alle neuen 50 ml-Rohre bei 300 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie alle vier Zellpellets in insgesamt 10 ml sterilem PBS wieder auf.</li>
	<li>Zählen Sie Zellen nach Trypanblauausschluss mit einem Hämozytometer. HINWEIS: 8-20 x 106 Zellen werden in der Regel aus 40 ml Vollblut gewonnen.</li>
</ol>2. Kultivieren von primären menschlichen Monozyten
<ol><li>Mit einem 37 °C Wasserbad, warme serumfreie RPMI 1640 Medien ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) und (während weiterhin sterile Techniken unter einem Biosicherheitsschrank verwenden) setzen die isolierten Monozyten in diesem Medium in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml resuspendierte Zellen zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte oder in eine 35-mm-Schale (die endgültige Anzahl der Zellen sollte 1 x 106 Zellen/Platte) und legen Sie in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2. Warten Sie 0,5-1,0 h, bis zellenhaft sind.</li>
	<li>Mit einem 37 °C Wasserbad, warm wärmeinaktiviert (HI) fetales Rinderserum (FBS). Fügen Sie jeder Platte 100 l (10 % Endkonzentration) von FBS hinzu. Fügen Sie den Zellen Wachstumsfaktoren hinzu, um die Makrophagendifferenzierung zu fördern.<ol>
<li>Prime-Makrophagen für einen M1-ähnlichen Phänotyp durch Zugabe von 25 ng/ml Granulozyt-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) zu Medien. Prime-Makrophagen für einen M2-ähnlichen Phänotyp durch Zugabe von 50 ng/ml Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) zu Medien28. HINWEIS: Sowohl GM-CSF als auch M-CSF ermöglichen eine Monozytendifferenzierung zu einem allgemeinen Makrophagen-Phänotyp (M0) während der Grundierung von Zellen für M1 bzw. M2 bzw.7,28,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transfizierung primärer menschlicher Monozyten in der Kultur
<ol><li>Transfekte Monozyten mit miRNA-Mimik oder Inhibitoren oder siRNA mit einem Kit, das ein polymerbasiertes Transfektionsreagenz (Materialtabelle )enthält.<ol>
<li>Nach dem Herstellerprotokoll für das Transfektionskit (und der weiteren Verwendung steriler Techniken unter einem Biosicherheitsschrank) verdünnen Sie zunächst die ausgewählten miRNA-Mimiks/Inhibitoren oder siRNAs im Puffer auf eine Endkonzentration von 1,83 m. Bereiten Sie 10 l verdünnte Mimik/Inhibitor pro Transfektion von 1 x 106 Zellen vor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie das Transfektionsreagenz vor, indem Sie einem frischen 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr 1 l des mitgelieferten Polymers zufügen, gefolgt von sofortiger Zeit durch Zugabe von 90 l des bereitgestellten Puffers (für insgesamt 91 l Reagenz pro Transfektion). Wirbel für 3-5 s.</li>
	<li>Pipette 90 l Transfektionslösung in die Röhre mit 10 l verdünnter miRNA-Mimik/-Inhibitor oder siRNA. Mischen Sie durch sanftePipettierung und inkubieren für 15 min bei RT.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l Transfektionskomplex zu einem Brunnen (oder einer Schale) von 1 x 106 vergoldeten Monozyten hinzu. Inkubieren Sie Zellen für 4 h bei 37 °C, dann ersetzen Sie das Medium durch 3 ml komplette Medien (RPMI 1640 ergänzt durch 1% Penicillin-Streptomycin und 10% hitzeinaktiviertes FBS), das entweder GM-CSF oder M-CSF enthält.</li>
</ol>4. M1/M2 Differenzierung und Aktivierung
<ol><li>Monozyten beginnen sofort, sich nach der Beschichtung in der Kultur auf breite M0-Makrophagen zu differenzieren. Am dritten Tag nach der Beschichtung die Verwendung steriler Techniken unter einem Biosicherheitsschrank fortsetzen und Medien durch 3 ml frische RMPI 1640-Medien ersetzen (ergänzt durch 1% Penicillin-Streptomycin, 10% hitzeaktiviertes FBS und entweder 25 ng/mL GM-CSF zur Förderung der M1-ähnlichen Polarisation oder 50 ng/ml M-CSF zur Förderung der M2-ähnlichen Polarisation). Kultur die Zellen unter diesen Bedingungen für insgesamt 6 Tage von der Erstbeschichtung in einem Inkubator bei 37 °C, 5%CO2.</li>
	<li>Um die Polarisation der grundierten Zellen zum M1-Makrophagen-Phänotyp voranzutreiben, aktivieren Sie die Zellen am 6. Tag der Inkubation, indem Sie Zellmedien durch neue Medien ersetzen, die 5% wärmeinaktiviertes FBS, 1% Pen/Strep, 100 ng/mL E.coli-abgeleitetes Lipopolysaccharid (LPS) und 20 ng/ml Interferon-Gamma (IFN-) enthalten.</li>
	<li>Um die Polarisation der grundierten Zellen zum M2-Makrophagen-Phänotyp voranzutreiben, aktivieren Sie die Zellen am 6. Tag der Inkubation, indem Sie Zellmedien durch neue Medien ersetzen, die 5% wärmeinaktiviertes FBS, 1% Pen/Strep, 10 ng/mL M-CSF und 20 ng/mL Interleukin 4 (IL-4) enthalten.</li>
	<li>Nach 24 h ernten Sie die Zellen für RNA-, Protein- oder Durchflusszytometrie-Analysen.<ol>
<li>Wenn Zellen zur Sammlung bereit sind, waschen Sie Zellen in der Schale 2x mit PBS (bei RT für RNA-Extraktion oder gekühlt auf Eis für die Proteinextraktion). Da die differenzierten Makrophagen nun fest an den Platten befestigt sind, lysieren Sie die Zellen in Platten direkt, um Material für RNA- und Proteinanalysen zu erhalten.</li>
		<li>Zur Sammlung von Material für die Durchflusszytometrie PBS mit 2 mM EDTA in die Schale geben, die Zellen 10 min bei 37 °C inkubieren, die Zellen vorsichtig aus der Schale kratzen und den Inhalt in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr sammeln, bevor Sie mit Standardprotokollen fortfahren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Durchflusszytometrie
<ol><li>Spülen Sie Zellen in PBS, um das Kultivierungsmedium zu entfernen. Drehen Sie 100.000 Zellen (pro Durchflusszytometriezustand) und setzen Sie das Pellet in 100 l PBS wieder auf, die 2 L HuFcR-Bindungsinhibitor enthalten. 15 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 50 L Färbepuffer und die gewünschten Antikörper (hier wurden CD80, CD83, CD163 und CD209 verwendet) in den empfohlenen Mengen hinzu.</li>
	<li>Sanft mischen und bei 4 °C im Dunkeln 30 min inkubieren.</li>
	<li>2x mit PBS waschen und die gefärbten Zellen in 150 l PBS wieder aufsetzen, bevor die Probe auf einem Zytofluorimeter ausgeführt wird.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das vorgestellte Protokoll zeigt die Verwendung von Primärzellen von HIV-infizierten Probanden als Modell für die Untersuchung von Monozyten und Makrophagen. HIV+ Patienten, die sich mit cART unterziehen, leben mehrere Jahre mit einer Infektion und können auch andere Co-Infektionen haben, die mit einem geschwächten Immunsystem zusammenhängen. Um die Immunmodulation in Gegenwart einer chronischen HIV-Infektion zu untersuchen, wurden Zellen direkt von Patienten geerntet. Da sich gezeigt hat, dass miRNAs eine wic...

Eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 (HIV-1) verursacht eine schwere Immunfunktionsstörung, die zu opportunistischen Infektionen und erworbenen Immunschwächesyndromen (AIDS) führen kann. Obwohl HIV-infizierte Patienten, die sich cART unterziehen, durch geringe Viruslasten und normale CD4+ T-Zellzahlen gekennzeichnet sind, kann die Funktion des Immunsystems bei diesen Personen beeinträchtigt werden, was zu einer dysfunktionalen Immunantwort führt, die mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von Krebs verbunden ist1. Die Mechanismen der Immunfunktionsstörung bei HIV-Patienten auf cART bleiben weitgehend unbekannt. Daher ist die Charakterisierung von immunbasierten Immunzellen durch Patienten und die Untersuchung ihrer Biologie und Funktion ein kritischer Bestandteil der aktuellen HIV-Forschung.
Monozyten und Makrophagen sind wichtige Regulatoren von Immunantworten und spielen eine grundlegende Rolle bei der HIV-Infektion2,3,4,5. Heterogen und plastisch können Makrophagen grob in klassisch aktiviert (M1) oder alternativ aktiviert (M2) klassifiziert werden. Während diese allgemeine Klassifizierung bei der Einrichtung experimenteller Bedingungen notwendig ist, kann der Polarisationsstatus von Makrophagen durch eine Vielzahl von Zytokinen6,7,8,9umgekehrt werden. Obwohl mehrere Studien die Auswirkungen einer HIV-Infektion auf Monozyten und dendritische Zellen untersucht haben, sind molekulare Details von monozytenvermittelten Reaktionen weitgehend unbekannt6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Unter den Faktoren, die an der Immunzellregulation und -funktion beteiligt sind, haben sich gezeigt, dass microRNAs (miRNAs), kurze nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression posttranscriptativ regulieren, eine wichtige Rolle im Kontext wichtiger zellulärer Pfade spielen (d. h. Wachstum, Differenzierung, Entwicklung und Apoptose)20. Diese Moleküle wurden als wichtige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren beschrieben, die für die Diktat der funktionellen Polarisation von Makrophagen21unerlässlich sind. Die potenzielle Rolle von miRNAs bei Monozyten von HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, wurde untersucht, aber Fortschritte auf diesem Gebiet erfordern viel mehr Arbeit22,23,24,25,26. In diesem Beitrag wird eine optimierte Methode zur Transfektion von miRNAs und siRNAs in primäre menschliche Monozyten von HIV-infizierten Patienten und Kontrollen behandelt.
Dieses Protokoll stützt sich auf handelsübliche Reagenzien und Kits, da die Kontinuität des technischen Verfahrens dazu beiträgt, unnötige experimentelle Variablen bei der Arbeit mit klinischen Proben zu vermeiden. Nichtsdestotrotz gibt die Methode wichtige Tipps (d.h. die Anzahl der zellenbeschichteten oder kurzen Inkubation mit serumfreien Medien, um die Haftung der Zellen an der Platte zu fördern). Zusätzlich werden die in diesem Protokoll verwendeten Polarisationsbedingungen aus veröffentlichten Arbeitenabgeleitet 27,28,29.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Blutentnahmeröhrchen aus Kunststoff mit K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>CD14 PerCP</td><td>Invitrogen</td><td>46-0149-42</td><td>Durchflusszytometrie-konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>CD163 BV711</td><td>BD Horizon</td><td>563889</td><td>Durchflusszytometrie - konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>CD209 BV421</td><td>BD Horizon</td><td>564127</td><td>Durchflusszytometrie - konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>CD80 FITC</td><td>BD Horizon</td><td>557226</td><td>Durchflusszytometrie - konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>CD83 APC</td><td>BD Horizon</td><td>551073</td><td>Durchflusszytometrie - konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19669 EIF4EBP1</td><td></td></tr><tr><td>mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>Monoklonaler Antikörper für Western Blot</td></tr><tr><td>EIF4EBP1 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-29594</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Bovin Serum Definiertes hitzeinaktiviertes</td><td>Hyklon</td><td>SH30070.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43618</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH mAb</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47724</td><td>Monoklonaler Antikörper für Western Blot</td></tr><tr><td>HuFcR Binding Inhibitor</td><td>eBiosciences</td><td>14-9161-73</td><td>Durchflusszytometrie-blockierender Puffer</td></tr><tr><td>Kaluza Analysis Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>B16406</td><td>Software zur Analyse von Durchflusszytometrie-Daten</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide aus Escherichia coli O55:B5</td><td>Sigma</td><td>L4524</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA microRNA Mimic has-miR-146a-5p</td><td>Qiagen</td><td>YM00472124</td><td></td></tr><tr><td>MISSION miRNA Negative Control</td><td>Sigma</td><td>HMC0002</td><td>Scrambled miRNA, konjugiert mit einem Nahinfrarot-Farbstoff</td></tr><tr><td>Nunc 35mm Zellkulturschale Thermo</td><td>Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante humane GM-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>215-GM-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IFN-& gamma</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-4</td><td>R& D Systems</td><td>204-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes M-CSF</td><td>F& T & D Systems</td><td>216-MC-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>10040CVMP</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled Control siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Zellproliferationsreagenz</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td>kolorimetrischer Assay zur Beurteilung der Zellviabilität</td></tr></tbody></table>

isolation, transfektion und kultur der primären menschlichen monozyten

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Trotz der Einführung einer kombinierten antiretroviralen Therapie (cART) Mitte der 1990er Jahre ist das Humanimmundefizienzvirus (HIV) nach wie vor ein großes Gesundheitsproblem. Während die antiretrovirale Therapie die systemische Viruslast effizient senkt und die normale CD4+ T-Zellzahl wiederherstellt, stellt sie kein vollständig funktionierendes Immunsystem wieder her. Ein dysfunktionales Immunsystem bei HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, kann durch Immunaktivierung, frühe Alterung von Immunzellen oder anhaltende Entzündungen gekennzeichnet sein. Diese Bedingungen, zusammen mit komorbiden Faktoren im Zusammenhang mit HIV-Infektion, erhöhen die Komplexität der Krankheit, die nicht leicht in Zell- und Tiermodellen reproduziert werden kann. Um die molekularen Ereignisse zu untersuchen, die der Immunfunktionsstörung bei diesen Patienten zugrunde liegen, wird hier ein System zur Kultur und Manipulation menschlicher Primärmonozyten in vitro vorgestellt. Insbesondere ermöglicht das Protokoll die Kultur und Transfektion von primären CD14+ Monozyten, die von HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, sowie von HIV-negativen Kontrollen erhalten werden. Die Methode umfasst Isolation, Kultur und Transfektion von Monozyten und monozytenabgeleiteten Makrophagen. Während handelsübliche Kits und Reagenzien eingesetzt werden, bietet das Protokoll wichtige Tipps und optimierte Bedingungen für die erfolgreiche Haftung und Transfektion von Monozyten mit miRNA-Mimik und Inhibitoren sowie mit siRNAs.

Mit dem beschriebenen Verfahren wurden primäre menschliche Monozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Spendern isoliert. Alle hier vorgestellten Daten stammen von HIV+ Probanden, die sich mit niedrigen (&lt;20 Kopien/ml) oder nicht nachweisbaren Viruslasten und normalen CD4+ T-Zellzahlen unter cART befinden. Unmittelbar nach der Isolierung wurden Zellen befleckt und die Durchflusszytometrie durchgeführt, um die Reinheit der Zellpopulationen zu bestätigen. Di...

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV-Infektion verursacht Immunfunktionsstörungen auch bei Personen, die sich einer antiretroviralen Therapie ohne nachweisbares Virus unterziehen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Monozytenfunktion, die wichtige Regulatoren der Immunantwort sind. Wir haben diese Technik für die Isolierung, Kultur und Transfektion menschlicher Primärmonozyten optimiert.Wir verwenden diese Methode, um die molekularen Mechanismen der Immunfunktionsstörung bei HIV-infizierten Personen zu verstehen, aber es kann auf alle anderen Immunstudien mit Monozyten angewendet werden. Wenn Dies zum ersten Mal mit menschlichem Blut arbeitet, denken Sie daran, die richtigen Biosicherheitsprotokolle zu befolgen und alle Proben als möglicherweise infektiöses Material zu behandeln. Nach der Sammlung von 40 Milliliter frisches menschliches Vollblut in vier 10 Milliliter EDTA Vakuumröhren, verwenden Sie sterile Technik, um das gesamte Blut in einem einzigen 50 Milliliter konischen Propylen-Röhrchen in einem Biosicherheitsschrank zu übertragen.Fügen Sie nach den Anweisungen des Herstellers aus einem ausgewählten menschlichen Monozyten-Isolationskit zwei Milliliter Monozyten-Isolationscocktail aus dem Kit in d

isolation-transfection-and-culture-of-primary-human-monocytes

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von Monozyten aus menschlichem Vollblut durch immunomagnetische negative Trennung. Die isolierten Monozyten können für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Isolierung von Monozyten aus Vollblut durch immunomagnetische Negativselektion

Dieses Video zeigt das Priming von primären Monozyten in Makrophagen. Primäre humane Monozyten können isoliert und unter Verwendung des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) zu einem M1-ähnlichen proinflammatorischen Phänotyp oder unter Verwendung des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF) zu einem M2-ähnlichen entzündungshemmenden Phänotyp differenziert werden.

In vitro Kultur und Differenzierung von primären Monozyten zu Makrophagen

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu...

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Analyse der Nanopartikel Wechselwirkung mit definierten Untergruppen der Immunzellen durch Durchflusszytometrie.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Diese Studie vergleicht zwei verschiedene Methoden der Isolierung humaner Monozyten zur Gewinnung von in vitro dendritischen Zellen (DCs). Monozyten werden durch Adhärenz selektiert oder durch magnetische Trennung negativ angereichert. Die Monozytenausbeute und -viabilität sowie die Viabilität, Proliferation und Expression von CD11c/CD14-Oberflächenmarkern werden zwischen beiden Methoden verglichen.

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) aus menschlichen Blutproben, eine einfache Methode zur effizienten Einführung von BiFC-Reportern (Bimolecular Fluorescence Complementation) in das menschliche MDM, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen, und einen bildgebenden Ansatz zur Messung der entzündlichen Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Diese Studie beschreibt einen neuartigen Ansatz für die Etablierung von humanen Monozyten-abgeleiteten Mikroglia-ähnlichen (iMG) Zellen, die eine indirekte Beurteilung von Hirnentzündungen ermöglichen. Dies stellt ein zelluläres Modell dar, das für die Forschung nützlich sein könnte, die sich auf mögliche Entzündungen des Gehirns und damit verbundene neuropsychiatrische Erkrankungen konzentriert.

Engineering von humanen blutinduzierten Mikroglia-ähnlichen Zellen für die reverse-translationale Hirnforschung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14+ -Monozyten

Lernen Sie die optimierte Isolierung, Kultur und Transfektion primärer menschlicher Monozyten für HIV-Immunforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung monozytärer Immunfunktionen bei Infizierten und gesunden Kontrollpersonen.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

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