Name: Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Erfahren Sie die zellzyklusspezifische Messung von DNA-Doppelstrangbrüchen und Apoptose durch Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Reparaturmechanismen und Behandlungseffekten in der Onkologie.

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Wir danken dem Flow Cytometry Facility Team des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ) für die Unterstützung.

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<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
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<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
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<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
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<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
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<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die vorgestellte Methode ist einfach zu bedienen und bietet eine schnelle, genaue und reproduzierbare Messung der DNA-Schadensreaktion einschließlich Doppelstrangbruch (DSB) Induktion und Reparatur, Zellzykluseffekte und apoptotischezellige Tod. Die Kombination dieser Endpunkte bietet ein vollständigeres Bild ihrer Zusammenhänge als einzelne Assays. Die Methode kann in den Bereichen Strahlenbiologie, Therapie und Schutz und ganz allgemein in der Onkologie (z. B. für die Bewertung von Umweltrisikofaktoren, Arzneimittelscr...

Das Ziel der Onkologie ist es, Krebszellen abzutöten oder zu inaktivieren, ohne normale Zellen zu schädigen. Viele Therapien induzieren direkt oder indirekt genotoxischen Stress in Krebszellen, aber auch zu einigen in normalen Zellen. Chemotherapie oder gezielte Medikamente werden oft mit Strahlentherapie kombiniert, um die Radiosensitivität des bestrahlten Tumors1,2,3,4,5zu verbessern, was eine die Strahlendosis, um normale Gewebeschäden zu minimieren.
Ionisierende Strahlung und andere genotoxische Mittel verursachen verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich Basismodifikationen, Strang-Querverbindungen und Ein- oder Zweistrangbrüche. DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) sind die schwerwiegendsten DNA-Läsionen und ihre Induktion ist der Schlüssel zur Zelltötungswirkung ionisierender Strahlung und verschiedener zytostatischer Medikamente in der Radiochemotherapie. DSBs schädigen nicht nur die Integrität des Genoms, sondern fördern auch die Bildung von Mutationen6,7. Daher haben sich während der Evolution verschiedene DSB-Reparaturpfade und Mechanismen zur Beseitigung irreparabel beschädigter Zellen wie Apoptose entwickelt. Die gesamte DNA-Schadensreaktion (DDR) wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalwegen reguliert, die von der ERKENNUNG von DNA-Schäden und dem Zellzyklusstillstand reichen, um eine DNA-Reparatur, einen programmierten Zelltod oder eine Inaktivierung im Falle eines Reparaturfehlers zu ermöglichen8.
Die vorgestellte zytometrische Strömungsmethode wurde entwickelt, um die DDR nach genotoxischem Stress in einem umfassenden Test zu untersuchen, der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers abdeckt. Es kombiniert die Messung des weit verbreiteten DSB-Markers H2AX mit der Analyse des Zellzyklus und der Induktion der Apoptose, mit klassischer SubG1-Analyse und einer spezifischeren Auswertung der Caspase-3-Aktivierung.
Die Kombination dieser Endpunkte in einem Test reduziert nicht nur Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand, sondern ermöglicht auch die zellzyklusspezifische Messung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Caspase-3-Aktivierung. Solche Analysen wären mit unabhängig durchgeführten Assays nicht möglich, aber sie sind für ein umfassendes Verständnis der REAKTION auf DNA-Schäden nach genotoxischem Stress von großer Bedeutung. Viele Krebsmedikamente, wie z. B. zytostatische Verbindungen, richten sich gegen die Zellteilung und ihre Effizienz ist stark vom Zellzyklusstadium abhängig. Die Verfügbarkeit verschiedener DSB-Reparaturprozesse hängt auch von der Zellzyklusstufe und der Fürdier-Genauigkeit entscheidenden Zellzyklusphase und -wegwahl ab und bestimmt wiederum das Schicksal der Zelle9,10,11, 12. Darüber hinaus ist die zellzyklusspezifische Messung des DSB-Spiegels genauer als die gepoolte Analyse, da die DSB-Spiegel nicht nur von der Dosis einer genotoxischen Verbindung oder Strahlung abhängen, sondern auch vom DNA-Gehalt der Zelle.
Die Methode wurde verwendet, um die Wirksamkeit verschiedener Radiotherapien zu vergleichen, um Resistenzmechanismen bei Glioblastom13 zu überwinden und das Zusammenspiel zwischen ionisierender Strahlung und gezielten Medikamenten bei Osteosarkom14,15 zu sezieren. und atypische teraide Rhabdoidkrebs16. Darüber hinaus wurde die beschriebene Methode weit verbreitet, um Nebenwirkungen von Radio- und Chemotherapie auf mesenchymale Stammzellen17,18,19,20,21, 22,23,24, die für die Reparatur von behandlungsbedingten normalen Gewebeschäden unerlässlich sind und eine mögliche Anwendung in der regenerativen Medizin haben.

<table><tbody><tr><td>1.000 & Mikro; L Filterspitzen</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1.000 &micro; L Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Röhrchen mit Cell Strainer Cap, 35 & micro; m Maschenweite Porengröße</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Filterspitzen</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; L Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>In Wasser bei 200 & Mikro auflösen; g/mL und lagern Sie Aliquots bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antikörper, RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>Verdünnung 1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Kaninchen Anti-Active Caspase-3 Antikörper, AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>Verdünnung 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSClean Lösung</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>Für die Reinigung von Zytometern nach der Messung</td></tr><tr><td>BD FACSRinse Lösung</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>Für die Reinigung des Zytometers nach der Messung</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>In Wasser auf 1x Konzentration auflösen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit stabilem Glutamin</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>Routine-Zellkulturmaterial für die im Protokoll verwendete Beispielzelllinie</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Excel-Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (fötales Rinderserum)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>Routine-Zellkulturmaterial für die Beispielzelllinie, die im Protokoll</td></tr><tr><td>verwendet wird FlowJo v10 software</td><td>LLC</td><td>online bestellen</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Einbettungsmedium für die optionale Vorbereitung von mikroskopischen Objektträgern aus gefärbten Proben</td></tr><tr><td>Gefaltete Zellulosefilter, Klasse 3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRII oder LSRFortessa Zytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>optionales Medikament zur Apoptose-Positivkontrolle</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR+</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>4,5%ige Lösung frisch herstellen. In PBS durch Erhitzen auf 80 μg verdünnen; C mit langsamem Rühren unter dem Abzug. Decken Sie den Kolben mit Alufolie ab, um Wärmeverluste zu vermeiden. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und stellen Sie das endgültige Volumen ein. Die Lösung durch einen Zellulosefilter leiten.</td></tr><tr><td>Phospho-Histon H3 (Ser10) (D2C8) XP Kaninchen mAb (Alexa Fluor&reg; 555 Konjugat) RRID: AB_10694639</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3475</td><td>Verdünnung 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (modifizierter TNF-verwandter Apoptose-induzierender Ligand)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>optionales Medikament zur Apoptose-Positivkontrolle</td></tr><tr><td>T25-Zellkulturflaschen</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>Routine-Zellkulturmaterial für die im Protokoll verwendete Beispielzelllinie</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>Routinemäßiges Zellkulturmaterial für die im Protokoll verwendete Beispielzelllinie</td></tr><tr><td>U87 MG Glioblastomzellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>Beispielzelllinie, die im Protokoll verwendet wird</td></tr></tbody></table>

zellzyklusspezifische messung von h2ax und apoptose nach genotoxischem stress durch durchflusszytometrie

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Die vorgestellte Methode oder leicht modifizierte Versionen wurden entwickelt, um spezifische Behandlungsreaktionen und Nebenwirkungen verschiedener Anti-Krebs-Behandlungen zu untersuchen, wie sie in der klinischen Onkologie verwendet werden. Es ermöglicht eine quantitative und Längsschnittanalyse der DNA-Schadensreaktion nach genotoxischem Stress, wie durch Strahlentherapie und eine Vielzahl von Anti-Krebs-Medikamenten induziert. Die Methode deckt alle Stadien der Reaktion auf DNA-Schäden ab und bietet Endpunkte für die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusstillstand und Zelltod durch Apoptose im Falle eines Reparaturfehlers. Die Kombination dieser Messungen liefert Informationen über zellzyklusabhängige Behandlungseffekte und ermöglicht somit eine eingehende Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Zellproliferation und Bewältigungsmechanismen gegen DNA-Schäden. Da die Wirkung vieler Krebstherapeutika, einschließlich Chemotherapeutika und ionisierender Strahlung, auf bestimmte Zellzyklusphasen begrenzt ist oder stark variiert, basieren korrelative Analysen auf einer robusten und praktikablen Methode zur Bewertung der Behandlungseffekte. auf die DNA in einer zellzyklusspezifischen Weise. Dies ist bei Single-Endpunkt-Assays und einem wichtigen Vorteil der vorgestellten Methode nicht möglich. Die Methode ist nicht auf eine bestimmte Zelllinie beschränkt und wurde gründlich in einer Vielzahl von Tumor- und normalen Gewebezelllinien getestet. Es kann weithin als umfassender Genotoxizitätstest in vielen Bereichen der Onkologie neben der Radioonkologie angewendet werden, einschließlich der Bewertung von Umweltrisikofaktoren, dem Arzneimittelscreening und der Bewertung genetischer Instabilität in Tumorzellen.

Menschliche U87- oder LN229-Glioblastomzellen wurden mit 4 Gy Photonen- oder Kohlenstoffionenstrahlung bestrahlt. Zellzyklus-spezifische H2AX-Spiegel und Apoptose wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten bis zu 48 h nach Bestrahlung mit der hier vorgestellten Strömungszytometriemethode gemessen (Abbildung 3). In beiden Zelllinien induzierten Kohlenstoffionen höhere H2AX-Spitzenwerte, die langsamer zurückgingen und mit 24 bis 48 h signifikant erhöht blieben, verglichen mit Photonenstrahlung be...

Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Die Methode liefert Informationen über zellzyklusabhängige Behandlungseffekte und ermöglicht und vertieft das Zusammenspiel von Zellproliferation und Bewältigungsmechanismen gegen DNA-Schäden. Diese Methode kombiniert wichtige Endpunkte aus der DNA-Schadensreaktion, einschließlich Doppelstrang-Frag-Erkennung und -Reparatur, Zellzykluseffekte und schließlich Zelltod durch Apoptose in einem umfassenden Test. Wir haben diese Technik hauptsächlich verwendet, um spezifische Behandlungsreaktionen und Nebenwirkungen von radiochemotherapeutischen Behandlungen in der klinischen Onkologie zu untersuchen.Der Assay ist sehr nützlich für korrelative Studien in den Bereichen Radiobiologie und Strahlentherapie, kann aber auch auf verschiedene andere Bereiche der Onkologie angewendet werden. Nachdem Sie die Zellen aus der Kultur nach Standard-Zellentnahmeverfahren gesammelt haben, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder aus. Und übertragen Sie die Zellen in zwei Milliliter Fixierlösung in einer Haube.Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Zellen durch Zentrifugieren sammeln und den Überstand dekantieren. Es ist wichtig, die Zellen als Einzelzellsuspension zu fixieren und die Fixierungszeit für alle Proben konstant zu halten. Geben Sie den anhaftenden Zellen genügend Zeit, um sich zu lösen, um schön abgerundete Zellen für die Analyse zu erhalten.Lösen Sie dann das Pellet, indem Sie die Zellen in drei Millilitern 70% Ethanol anzapfen und wieder aussetzen. Um die Zellen vor der Färbung zu waschen, sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, und lösen Sie das Pellet durch Klopfen. Dann die Zellen mit zwei aufeinanderfolgenden Wäschen mit drei Milliliter Waschlösung und einem Waschen mit einem Milliliter Waschlösung wieder aussetzen.Entsorgen Sie den Überstand zwischen jeder Wäsche. Nach der letzten Wäsche den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Pellet zu stören, und das Lucent-Pellet in 100 Mikroliter des interessierenden Antikörpercocktails wieder aufhängen. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Zellen durch Zentrifugieren sammeln und den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Pellet zu stören.Dann setzen Sie das gelockerte Pellet in 100 bis 250 Mikroliter DNA-Färbungslösung wieder auf und geben die Zellen durch die Zellsiebkappe eines Probenröhrchens mit einer Maschenöffnungsgröße von 35 Mikrometern aus. Um die Zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, öffnen Sie die Registerkarte Parameter im Zytometerfenster, und wählen Sie die in der Tabelle angegebenen Parameter aus. Öffnen Sie als Nächstes das Arbeitsblattfenster, und erstellen Sie Diagramme wie angegeben.Laden Sie eine Steuerprobe auf das Zytometer und drücken Sie die Run-Taste. Wählen Sie die erste Röhre im Browserfenster aus, und klicken Sie auf den Rohrnamen. Passen Sie die Detektorspannungen für Vorwärts- und Seitenstreuung und DAPI in der Parameter-Registerkarte des Inspektorfensters an.Drücken Sie die Standby-Taste, um mit der Einrichtung des Arbeitsblatts in der Software fortzufahren. Verwenden Sie das Polygon-Gate-Werkzeug, um die Zellpopulation im Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Seitenstreubereichsdiagramm zu definieren, und verwenden Sie das Rechteck-Gate-Werkzeug, um die Grundgesamtheit einzelner Zellen in der DAPI mit einem DAPI-Flächendiagramm zu definieren. Drücken Sie die Taste G, um die Grundgesamtheitshierarchie anzuzeigen, und klicken Sie auf die Standard-Gate-Namen, um sie umzubenennen.Anschließend klicken Sie mit der rechten Maustaste auf alle Histogramme, um Populationen und einzelne Zellen aus dem Kontextmenü anzuzeigen. Erfassen Sie Steuer- und behandelte Proben, um die Detektorspannungen für die antikörpergekoppelten Fluorophore zu optimieren, um den gesamten Dynamikbereich des Signals abzudecken. Um die Proben zu messen, drücken Sie die Run-Taste auf dem Zytometer und verwenden Sie das Erfassungs-Dashboard in der Software, um die Proben zu messen.Wählen Sie dann Datei, Export und Experimente aus, um den Verzeichnisexport im Dialogfeld auszuwählen, um die Daten als Punkt-FCS-Dateien zu speichern. Um die Daten auszuwerten, ziehen Sie die Punkt-FCS-Dateien in den Beispielbrowser der flow cytometrischen Analysesoftware. Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um die Zellenpopulation im Diagramm vorwärts und seitlich eziellungsflächen zu definieren und Trümmer aus der Analyse auszuschließen.Verwenden Sie in der DAPI mit im Vergleich zu DAPI-Flächendiagramm das Rechteckwerkzeug, um die Grundgesamtheit einzelner Zellen zu definieren und alle Zelldoublets oder Klumpen aus der Analyse auszuschließen. Verwenden Sie im DAPI-Bereich Histogramm das Bisektor-Tool, um einzelne Zellen mit einem normalen DNA-Gehalt von apoptotischen Zellen mit degradierter DNA zu unterscheiden. Wählen Sie Werkzeugbiologie und Zellzyklus aus, um das Werkzeug zur Zellzyklusmodellierung zu öffnen, und wählen Sie Dean-Jett Fox aus, um die Häufigkeit von Zellen in den Phasen G 1 S und G zwei M zu schätzen.Erstellen Sie G 1 S- und G-Zwei- und M-Phasentore in der DAPI mit einem Im-DAPI-Flächendiagramm der Zellzykluspopulation, um eine zellzyklusspezifische Gamma H-Messung zwei A X zu ermöglichen. Verwenden Sie das Bisektor-Tool, um Phosphohiston H drei positive und negative Zellen im Alexa 555 Bereich Histogramm der Zellzykluspopulation zu unterscheiden und CAS-Basis drei positive und negative Zellen im Alexa 647 Bereich Histogramm der Einzelzellen Population zu unterscheiden. Drücken Sie die Taste T, um den Tabelleneditor zu öffnen und die Tabelle wie angegeben zu konfigurieren.Wählen Sie dann In Datei aus, um das Format und das Ziel im Ausgabeabschnitt des Menübands festzulegen und die Daten in ein Spreadsheet zu exportieren. Kohlenstoffionen induzieren höhere Gamma H zwei AX-Spitzenwerte in Glioblastom-Zellen, die langsamer abnehmen und in 24 bis 48 Stunden deutlich erhöht bleiben, verglichen mit Photonenstrahlung bei der gleichen physikalischen Dosis. Sowohl bei Kohlenstoffionen als auch bei Photonenstrahlung waren die Gamma H-Werte zwei AX in G-Phasenzellen wahrscheinlich am höchsten, da die DNA-Doppelstrangbruchreparatur auf den Weg der nicht-homologen Endverbindung in diesem Stadium des Zellzyklus beschränkt ist.Im Einklang mit der höheren Doppelstrangbruch-Induktionsrate und der langsameren Reparaturkinetik induzieren Kohlenstoffionen einen stärkeren und länger anhaltenden Zellzyklusstillstand in G zwei Phasen und eine höhere Apoptoserate als Photonen. Je nach Stärke des Behandlungseffekts kann die Auflösung der verschiedenen Zellzyklusphasen eine Herausforderung sein. In einigen Zelllinien hat die DAPI-Konzentration einen großen Einfluss auf die Qualität des Zellzyklusprofils und muss angepasst werden.Folien können aus den verbleibenden Proben nach der Durchflusszytometrie hergestellt werden, um die Anzahl, Größe und Form von Gamma H zwei AX-Schwerpunkten zu bewerten und zwischen fokalen und parnuklearen Gamma H zwei AX-Färbungen zu unterscheiden. Mit unserer Methode konnten wir zeigen, dass mesenchymale Stammzellen relativ resistent gegen ionisierende Strahlungen und Topoisomerase-Hemmung sind, aber empfindlich gegen Gliomyacin. Da PFA-Dämpfe giftig sind, verwenden Sie immer eine Dunstabzugshaube bei der Vorbereitung der Fixierungslösung und während des Fixierungsschritts.Denken Sie auch daran, Handschuhe zu tragen, wenn Sie mit DAPI umgehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrang Streifen mit γH2AX Bildung als einen molekularen Marker hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Foci nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrangbrüche auf der Grundlage γH2AX Brennpunkten hat sich zu einem wertvollen Werkzeug, vor allem in der Strahlenbiologie, für die Auswertung von Gewebe Strahlenempfindlichkeit und die Auswirkungen der Strahlung modifizierende Verbindungen. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Brennpunkte in Gewebeproben.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Schadensreaktionsproteine, die an den Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen in menschlichen mononukleären Zellen lokalisiert sind. Die Proteine werden von spezifischen Primärantikörpern erkannt, die wiederum an Fluorophor-markierte Sekundärantikörper binden, die während der mikroskopischen Visualisierung fluoreszieren, was die Visualisierung der Proteine als unterschiedliche Fluoreszenzherde...

Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

Ein Protokoll zur Bewertung von Veränderungen des DNA-Schadensniveaus und der DNA-Reparaturkapazität, die durch chronische in vivo Niedrigdosis-Bestrahlung in Milz-Lymphozyten von Mäusen induziert werden können, durch Messung von phosphoryliertem Histon H2AX, einem Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, mittels Durchflusszytometrie wird vorgestellt.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll präsentiert die Objektträgervorbereitung und das automatisierte Scoring des γ-H2AX-Foci-Assays an peripheren Blutlymphozyten. Um die Methode und Sensitivität des Assays zu veranschaulichen, wurden isolierte Lymphozyten in vitrobestrahlt. Diese automatisierte Methode des DNA-DSB-Nachweises ist nützlich für schnelle und biologische Dosimetrieanwendungen mit hohem Durchsatz.

Eine automatisierte mikroskopische Scoring-Methode für den γ-H2AX-Foci-Assay in humanen peripheren Blutlymphozyten

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch den gleichzeitigen Nachweis von γH2AX- und 53BP1-Foci in Interphasenkernen von Bleomycin-behandelten humanen peripheren Lymphozyten dar.

Duale Immunfluoreszenz von γH2AX und 53BP1 in humanen peripheren Lymphozyten

Hier stellen wir ein einfaches und schnelles Protokoll für den Nachweis von Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen vor.

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

Erfahren Sie die zellzyklusspezifische Messung von DNA-Doppelstrangbrüchen und Apoptose durch Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Reparaturmechanismen und Behandlungseffekten in der Onkologie.

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

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