Quantitative Ansätze zur Untersuchung zellulärer Strukturen und Organelle Morphologie in Caenorhabditis elegans
5. Juli 2019
Diese Studie skizziert quantitative Messungen der synaptischen Größe und Lokalisation, Muskelmorphologie und mitochondrialen Form in C. elegans mit frei verfügbaren Bildverarbeitungswerkzeugen. Dieser Ansatz ermöglicht es zukünftigen Studien in C. elegans, das Ausmaß der strukturellen Veränderungen von Gewebe und Organellen infolge genetischer Mutationen quantitativ zu vergleichen.
Die Fähigkeit, Veränderungen in der Morphologie von Geweben und Organellen zu quantifizieren, ist wichtig für das Verständnis der Genfunktion sowie der Auswirkungen genetischer Mutationen. Unsere Protokolle erklären, wie frei verfügbare Software zur nicht-subjektiven Bewertung der Morphologie von Synapsen, Muskeln und Mitochondrien in einem Nematoden, C.elegans, verwendet werden kann. Viele frühere Studien stützten sich auf qualitative Methoden zum Vergleich morphologischer Veränderungen.
Diese können jedoch problematisch sein, da sie möglicherweise keine subtilen phätotypischen Unterschiede erfassen, Veränderungen über- und unterschätzen und subjektiv bewertet werden. Unsere quantitativen Methoden bieten robustere und weniger voreingenommene Mittel zur Bewertung morphologischer Veränderungen. Diese Methoden könnten leicht zur Untersuchung morphologischer Veränderungen in anderen zellulären Strukturen oder Modellorganismen verwendet werden, um die Genfunktion und die Folgen krankheitsassoziierter Mutationen zu definieren.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Dias für die Bildgebung. Legen Sie einen Tropfen eine geschmolzene Agarose auf ein Mikroskopschlitten und drücken Sie sofort mit einem anderen Mikroskopschlitten nach unten, wobei die Agarose sanft abgeflacht wird. Lassen Sie die Agarose für eine Minute trocknen, trennen Sie dann vorsichtig die beiden Rutschen und lassen Sie das erstarrte Pad auf einer der Dias.
Platzieren Sie das Dia auf der Mikroskopbühne und fügen Sie einen Fünf- bis 10-Milliliter-Tropfen Anästhetikum in die Mitte des Agarose-Pads. Verwenden Sie eine wärmesterilisierte Kommissionierung, um 10 bis 15 Tiere schnell von der Stockplatte auf das Anästhetikum zu übertragen, bevor die Lösung austrocknet. Dann einen Coverslip auftragen, indem Sie ihn direkt über dem Agarose-Pad positionieren und sanft fallen lassen.
Stellen Sie die synaptischen Regionen mit einem Zeilenscannen-Konfokalmikroskop in Verbindung mit einem optisch gepumpten Halbleiterdiodenlaser von 488 und 552 Nanometern und ist mit Bildaufnahmesoftware ausgestattet. Nach dem Auffinden der Würmer wechseln Sie zu einer 40-fachen Vergrößerung und wenden Sie das Tauchmedium an. Visual die synaptische Region durch spannende die Fluorophore mit einem 552 Nanometer Laser, 1%Leistung für das TagRFP Fluorophor, und 488 Nanometer, 2%Leistung für das GFP-Fluorophor.
Erfassen Sie Bilder mit einem hybriden Photodetektor und stellen Sie die Gewinne ein, um eine Überbelichtung der Fluorophore zu verhindern. Sammeln Sie Z-Stack-Bilder, um die gesamte Synapse mit der optimalen Z-Schritt-Größe abhängig vom Objektiv abzudecken. Um den synaptischen Bereich zu analysieren, laden Sie zunächst die Bilder in die CellProfiler 3.1.5-Software.
Richten Sie das NameAndType-Modul ein und bestimmen Sie den synaptischen Bereich per Handdefinition mithilfe des diffusen TagRFP, das aus dem UIS-115-Transgen ausgedrückt wird. Messen Sie die Größe und Fluoreszenz der handdefinierten Synapse, indem Sie der Pipeline die Module MeasureObjectSizeShape und MeasureObjectIntensity hinzufügen. Berechnen Sie dann die relative integrierte Fluoreszenzintensität, indem Sie das CalculateMath-Modul hinzufügen und die aus JSIS37 erhaltenen integrierten Intensitätseinheiten durch die aus UIS-115 erhaltenen Einheiten dividieren.
Wenn Sie fertig sind, exportieren Sie alle Messungen und Berechnungen. Um die Muskelzellfläche zu messen, öffnen Sie das Bild in der Fidschi-Software und verwenden Sie die Polygonauswahl, um eine einzelne schräge Muskelzelle sorgfältig zu verfolgen. Passen Sie die Linie des Polygons am Ende an, indem Sie den Ankerpunkt ziehen, um die Ablaufverfolgung zu verbessern.
Navigieren Sie zur Registerkarte Analysieren oben in der Software, und klicken Sie auf Messen, um den ausgewählten Bereich zu berechnen. Bei Muskelzellen mit einem degenerierten oder fehlenden Bereich verfolgen Sie den fehlenden Bereich mit dem Polygonauswahlwerkzeug, und klicken Sie erneut auf Messen. Wenn mehrere Lücken vorhanden sind, verfolgen Sie jede einzelne.
Berechnen Sie das Verhältnis der Spaltfläche zur Fläche der gesamten Zelle. Ein hohes Verhältnis deutet auf ein höheres Ausmaß der Muskeldegeneration hin. Und wenn keine Regionen fehlen, wird das Verhältnis als Null berechnet.
Öffnen Sie Elastic, und wählen Sie Pixelklassifizierung unter Neues Projekt erstellen. Benennen Sie dann das Projekt um, und speichern Sie es. Navigieren Sie zur Registerkarte Eingabedaten, klicken Sie auf Neu hinzufügen, und fügen Sie dann separate Bilder hinzu.
Richten Sie das Popupfenster mit den TIF-Dateien in den Ordner und wählen Sie das gewünschte Bild aus. Klicken Sie auf der Registerkarte Feature-Auswahl auf Features auswählen, um alle Pixel-Features auszuwählen, die durch die grünen Kontrollkästchen angezeigt werden. Die Pixelauswahl in diesem Schritt wird verwendet, um die verschiedenen Pixelklassen im nächsten Schritt zu unterscheiden.
Verwenden Sie ein Trainingspanel, um zwischen den einzelnen GFP-exemitten Myosin-Filamenten und unerwünschtem Hintergrund zu unterscheiden. Klicken Sie auf Label hinzufügen und unerwünschte Hintergründe und Leerzeichen zwischen den Filamenten durchforsten, um mit dem Klassifikaltraining zu beginnen. Fügen Sie eine zweite Beschriftung hinzu, benennen Sie sie in Filament um, und kritzeln Sie über eine Reihe von Filamenten.
Klicken Sie auf Live Update, um sicherzustellen, dass die Klassifizierung korrekt durchgeführt wurde. Fügen Sie bei Bedarf weitere Crawls hinzu, um das Training zu optimieren. Sobald der Trainingsklassifler durchgeführt wurde, gehen Sie zum Bedienfeld Vorhersageexport und klicken Sie auf Bildeinstellungen exportieren mit Wahrscheinlichkeiten als Quelle auswählen.
Stellen Sie sicher, dass die Ausschnitt-Unterregionen x und y angekreuzt sind und c nicht angekreuzt ist. Wählen Sie Null und eins als Start- und Stoppwerte für c und Konvertieren des Datentyps in nicht signierte 8-Bit. Kreuzen Sie Neunormalisieren und ändern Sie dann das Ausgabedateivideo in png, indem Sie die Datei und das Verzeichnis nach Belieben umbenennen.
Schließen Sie das Fenster Einstellungen exportieren, und exportieren Sie das gerade segmentierte Bild. Öffnen Sie dann die Png-Datei in Fidschi-Software. Passen Sie den Schwellenwert des Bildes mithilfe der Standardeinstellungen an, und wenden Sie das Skelettierungs-Plug-In an, das eine separate Ergebnistabelle erstellt.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Funktion der Alpha-Tubulin-Acetyltransferase MEC-17 in der Synapsenentwicklung zu erforschen. Die quantitative Analyse von Bildern der hinteren/lateralen Mikrotubuli oder PLM-Synapsen zeigt, dass die Überexpression von MEC-17 die normale Neuronenfunktion stört. Im Vergleich zur Wildtypkontrolle haben überexponisierte MeC-17 präsynaptische Regionen und synaptische Integrität deutlich reduziert.
Diese Techniken wurden auch verwendet, um C.elegans Modelle von Charcot-Marie-Tooth Typ 2 oder CMT2 zu analysieren, die Mutationen in CMT2-assoziierten Genen tragen. Die visuelle Beurteilung der Körperwandmuskelmorphologie ergab eine 2,5- bis 3,5-fache Zunahme der Defekte bei den Versuchstieren im Vergleich zur Wildtypkontrolle. Tiere mit Mutationen in fzo-1 und unc-116 erlebten Verlust von Muskelsttriationen, Ansammlung von Zellablagerungen, und Muskelfaserdegeneration.
Während Tiere mit Mutationen in Dyn-1 deutlich weniger Defekte in der Muskelmorphologie erlebten. Die Mutanten fzo-1 und unc-116 zeigten eine fünf- bis sechsfache Zunahme des Verhältnisses von Lücke zu Gesamtfläche für Einzelzellen und eine dramatisch kürzere durchschnittliche Faserlänge im Vergleich zu Wildtieren. Für Vergleiche zwischen Proben ist es wichtig, die optimalen Bedingungen für die Bildaufnahme zu bestimmen und sicherzustellen, dass diese Bedingungen konsistent verwendet werden.
Diese Techniken werden es den Forschern ermöglichen, morphologische Veränderungen über verschiedene genetische Hintergründe hinweg mit quantitativen Ansätzen zu vergleichen. Dies reduziert die Subjektivität und hilft somit, die Repräsentativität der generierten Daten zu verbessern.
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Quantifizierung der synaptischen Größe, der Muskelmorphologie und der mitochondrialen Form im Modellorganismus C. elegans unter Verwendung frei verfügbarer Bildverarbeitungstools zur Analyse. Die vorgestellten Methoden ermöglichen einen zuverlässigen Vergleich von strukturellen Veränderungen in Geweben und Organellen, die durch genetische Mutationen hervorgerufen werden.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Quantitative Analyse morphologischer Veränderungen
- Einfluss genetischer Mutationen auf zelluläre Strukturen
- Fortschritt bei Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Die Bedeutung der Quantifizierung morphologischer Veränderungen für das Verständnis der Genfunktion
- Einschränkungen früherer qualitativer Methoden
- Bedarf an robusten und weniger voreingenommenen Bewertungstechniken
Verwendete Methoden
- Bildverarbeitungsprotokolle mit CellProfiler- und Fiji-Software
- C. elegans als Modellorganismus
- Techniken einschließlich konfokaler Mikroskopie und Pixelklassifizierung
Hauptergebnisse
- Bereitstellung quantitativer Daten zur synaptischen Integrität und zum Muskelzellbereich
- Identifizierung signifikanter Defekte in der Muskelmorphologie in genetischen Modellen
- Aufbau von Verbindungen zwischen Genmutationen und morphologischen Phänotypen
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt den Wert quantitativer Methoden zur Bewertung morphologischer Veränderungen in C. elegans
- Die Ergebnisse haben Auswirkungen auf zukünftige genetische und krankheitsbezogene Forschung
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative morphological analysis in model organisms enables objective assessment of genetic mutation effects on cellular structures, reducing subjectivity in phenotypic evaluation. This approach supports target validation by providing reproducible, quantifiable readouts for synaptic integrity, muscle development, and organelle morphology. Such data enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic perturbations to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantifiable changes in synapse size and fluorescence intensity.
- Operational Value: Provides standardized metrics for muscle cell area and myosin filament length to assess functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying mitochondrial morphology shifts as indicators of cellular stress or dysfunction.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized image analysis pipelines using CellProfiler and Fiji for reproducible morphological quantification.
- Scalability: Enables high-content screening readiness through automated measurement of organelle size, circularity, and integrated fluorescence.
- Cross-Platform Utility: Facilitates assay transferability across model systems by establishing quantitative benchmarks for tissue and organelle morphology.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports mechanistic de-risking in neurodegenerative and neuromuscular disease models by quantifying synaptic and muscle defects.
- Translational Continuity: Enables biomarker alignment through quantifiable mitochondrial morphology shifts linked to genetic mutations.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing quantitative thresholds for morphological defect severity in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by converting qualitative phenotypic observations into quantifiable datasets for target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling statistical comparison of synaptic size and fluorescence across genetic backgrounds.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized Z-stack imaging and automated object measurement in CellProfiler.
- Analytics: Generates quantitative outputs including integrated fluorescence intensity ratios, muscle area-to-gap ratios, and mitochondrial circularity scores.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant morphological metrics in C. elegans models of neurodegeneration and muscle disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis framework applicable to multiple organelles and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing objective, quantitative readouts of cellular structural changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs through freely available software and defined imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of phenotypic effects, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable defect ratios in muscle and synaptic models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and image analysis software such as CellProfiler and Fiji.
- Dependent on consistent imaging conditions including laser power, Z-step size, and antibody labeling for reliable quantification.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition and analysis protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying quantitative morphology assays to different tissue types or model organisms.
- Limited by the need for transgenic reporters or fluorescent tags to define structures of interest, as noted in synaptic region definition via tagRFP.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:59
Slide Preparation
1:48
Assessing Synaptic Morphology
2:47
Quantification of the Synaptic Region
3:45
Measurement of Muscle Cell Area
4:36
Segmentation and Quantification of Myosin Fiber Length
6:39
Results: Function of MEC-17 in the Nervous System
8:14
Conclusion
