Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation
15. Oktober 2019
Hier wird ein vereinfachtes Standard-Betriebsverfahren für die Mikrobiom-Profilierung mit 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung und Analyse mit frei verfügbaren Werkzeugen beschrieben. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, die neu im Mikrobiom-Bereich sind, sowie solchen, die Aktualisierungen von Methoden benötigen, um bakterielleS Profiling mit einer höheren Auflösung zu erreichen.
Die Profilierung von Mikrobiom ist der erste Schritt zur Definition der Rolle des Mikrobioms bei Gesundheit und Krankheit. Hier beschreiben wir ein einfaches Verfahren zur Isolierung hochwertiger bakterieller DNA aus der Fäkalprobenvorbereitungsbibliothek, die 16SR-RNA und eine metagenomische Sequenzierung und Mikrobiom-Datenanalyse durchführt. Dieses Protokoll wird Forschern, die neu im Mikrobiombereich sind, sowie Forschern, die im Bereich des Mikrobioms arbeiten, bei der Einrichtung der Mikrobiom-Pipeline in ihrem Labor helfen. Dieses Protokoll kann für die Profilierung von Mikrobiomen aus anderen Bio-Proben wie Nasen-, Mund- oder Hautproben von tierischen und menschlichen Probanden erweitert werden. Die Perlenauswahl ist der wichtigste Schritt, da alle nachgelagerten Schritte von hochwertiger DNA abhängen. Eine ordnungsgemäße Abdichtung der Konservenplatte ist wichtig, da eine unvollständige Versiegelung zur Unterdrückung des verstärkten Produkts führen kann, was zu datenniedrigen Sequenzierungsdaten von geringer Qualität führt. Zunächst die Trennkästen mit 70% Ethanol sterilisieren. Legen Sie die Mäuse in sterilisierte Trennkästen und lassen Sie sie normal für bis zu einer Stunde defäkieren. Verwenden Sie sterile Zangen, um die Fäkalienpellets in einem leeren voretikettierten 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu sammeln. Schließen Sie das Rohr sicher ein. Sterilisieren Sie die Zange mit 70% Ethanol, gefolgt von einem keimtötenden Einwegtücher, nachdem fäkal von jeder Maus gesammelt wurde. Wiegen Sie 200 Milligramm Fäkalienpellets in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 0,1 Milliliter Glasperlen und legen Sie das Perlenrohr in einen Perlenschlaghomogenisator und homogenisieren Sie die Proben 45 Sekunden lang bei Raumtemperatur bei einer Geschwindigkeit von 4,5 Metern pro Sekunde. Extrahieren Sie DNA gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers und elute DNA in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Nach der Isolierung der DNA, quantifizieren Sie die isolierte DNA durch Laden 1 Mikroliter der DNA auf einem Fluorometer. Einrichtung 16S ribosomale RNA-Genverstärkung PCR1 in einer 96-Well PCR-Platte mit einem Reaktionsvolumen von 25 Mikrolitern. Mit einer Mehrkanal-Pipette, fügen Sie 40 Nano Gramm DNA, 13,5 Mikroliter 2X High-Fidelity-Polymerase-Enzym-Mix, enthält Puffer, plus DNTPs in Vorwärts- und Reverse-Primer. Versiegeln Sie die PCR-Platte entlang aller vier Kanten ordnungsgemäß von oben nach unten. Und Zentrifuge bei 1000 mal G bei 20
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine detaillierte Methodik zur Mikrobiom-Profilierung mittels 16S-rRNA-Metagenom-Sequenzierung vor. Das Protokoll richtet sich sowohl an Anfänger als auch an erfahrene Forscher und bietet Einblicke, wie mithilfe zugänglicher Werkzeuge eine genaue bakterielle Profilierung erreicht werden kann.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Mikrobiom-Analyse
- Metagenomische Sequenzierung
- Bakterielle Profilierung
Hintergrund
- Die Rolle des Mikrobioms für Gesundheit und Krankheit
- Die Bedeutung der hochwertigen DNA-Isolierung
- Anwendungen an verschiedenen biologischen Proben
Verwendete Methoden
- 16S-rRNA-Sequenzierungsprotokoll
- Vorbereitung von Fäkalproben und DNA-Extraktion
- Verwendung frei verfügbarer Bioinformatik-Tools zur Analyse
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von hochwertiger bakterieller DNA
- Robuste Bibliotheksherstellung für die Sequenzierung
- Detaillierte Anleitung für Forschende zur Einrichtung von Mikrobiom-Analysenpipelines
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet ein umfassendes Protokoll zur Mikrobiom-Profilierung.
- Sie vertieft das Verständnis mikrobiombezogener Methoden, die für die Gesundheitsforschung relevant sind.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Mikrobiom-Profilierung ist ein grundlegender Schritt bei der Zielvalidierung für entzündliche und metabolische Erkrankungen und ermöglicht die Erstellung von Hypothesen über den Beitrag von Mikroben zur Pathogenese. Dieses Protokoll unterstützt die Entwicklung präklinischer Modelle, indem es hochauflösende taxonomische Daten aus komplexen biologischen Proben bereitstellt und die mechanistische Absicherung von auf das Mikrobiom abzielenden Interventionen fördert. Der standardisierte Arbeitsablauf verbessert die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen in therapeutischen Programmen zur Modulation des Mikrobioms.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem spezifische bakterielle Taxa in präklinischen Modellen mit Krankheitsphänotypen verknüpft werden.
- Operationaler Wert: Bietet reproduzierbare Profilierung mikrobieller Gemeinschaften, um die Priorisierung von Zielstrukturen und die Aufklärung von Signalwegen zu unterstützen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, hochauflösende taxonomische Ergebnisse, die für die Standardisierung von Assays und die Entdeckung von Biomarkern geeignet sind.
- Operationaler Wert: Schafft eine skalierbare, wiederverwendbare Pipeline zur Untersuchung von Mikrobiomveränderungen über verschiedene Probenarten und Behandlungsbedingungen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Charakterisierung krankheitsrelevanter Systeme, indem sie die langfristige Verfolgung von Mikrobiomveränderungen als Reaktion auf therapeutische Kandidaten ermöglicht.
- Operationaler Wert: Fördert die Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Fachbereichen durch standardisierte Datenformate und Analysetools wie DADA2 und Phyloseq.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode lässt sich in frühe Entdeckungsworkflows integrieren, indem sie handlungsrelevante Mikrobiomdaten liefert, die vor der Optimierung von Wirkstoffkandidaten die Auswahl von Zielstrukturen und mechanistische Studien unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Klärung von Wirkwegen durch präzise taxonomische Zuordnung auf Gattungs- und Artenebene.
- Screening: Liefert versuchstaugliche, reproduzierbare mikrobielle Profile, die einen zuverlässigen Vergleich experimenteller Bedingungen ermöglichen.
- Analysen: Bietet quantitative Sequenzvarianten und Diversitätskennzahlen, die statistische Vergleiche und die Korrelation von Biomarkern unterstützen.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse aus der Entdeckungsforschung mit der präklinischen Validierung, indem eine konsistente Überwachung des Mikrobioms über verschiedene Studienphasen hinweg ermöglicht wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte, über Abteilungen hinweg anwendbare Kapazität für die Analyse des Mikrobioms, die auf mehrere therapeutische Bereiche übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in Wirt-Mikrobe-Interaktionen reduziert werden.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit sicher durch standardisierte zweistufige PCR und bioinformatische Analyse.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem eine frühzeitige Erkennung mikrobiomvermittelter störender Faktoren in Krankheitsmodellen ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem datengestützte Einblicke in die Gültigkeit mikrobiombezogener Wirkmechanismen bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Molekularbiologie und Bioinformatik für die PCR-Setup- und DADA2-basierte Analyse.
- Hängt von dem Zugang zu Next-Generation-Sequenzierungsinfrastruktur und Rechenressourcen für die metagenomische Verarbeitung ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Probenhandhabung, DNA-Extraktion und Vorbereitung der Sequenzierbibliotheken.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf nicht-fäkale Biospezimen wie orale oder Hautproben ausgeweitet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen im Zusammenhang mit PCR-Bias und Sequenzierungstiefe, die die Detektion seltener Taxa beeinflussen.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:25
Extraction of DNA from Fecal Sample
2:29
16S rRNA Gene Amplification (PCR1) and DNA Library Construction (PCR2)
3:57
Clean-up of Indexed PCR (PCR2) and Quantification
6:03
Sequence Analysis
7:49
Results: Quality Profile and Statistical Analysis
9:29
Conclusion
