Name: Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Lernen Sie die optimierte Präparation von circRNA-Sequenzierungsbibliotheken mit RNase R-Behandlung und Qualitätskontrolle. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifizierung zirkulärer RNAs in verschiedenen Proben.

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Wir danken dem Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) in Sun City, Arizona, für die Bereitstellung von menschlichem Hirngewebe. Das BBDP wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson es Disease and Related Disorders), dem National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer es Disease Core Center), dem Arizona Department of Health Services (Vertrag 211002, Arizona Alzheimer es Research Center), die Arizona Biomedical Research Commission (Verträge 4001, 0011, 05-901 und 1001 an das Arizona Parkinson es Disease Consortium) und das Michael J. Fox Foundation for Parkinson es Research27. Diese Studie wurde auch vom DHS und dem Bundesstaat Arizona unterstützt (ADHS-Stipendium ADHS14-052688). Wir danken auch Andrea Schmitt (Banner Research) und Cynthia Lechuga (TGen) für die administrative Unterstützung.

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Leitlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Hirngewebe wurde vom Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program in Sun City, AZ, bezogen. Die Operationen des Brain and Body Donation Program werden vom Western Institutional Review Board (WIRB-Protokoll #20120821) genehmigt. Alle Probanden oder ihre gesetzlichen Vertreter unterzeichneten die informierte Einwilligung. Kommerzielle (nicht-Gehirn) Biospecimen wurden von Proteogenex gekauft.
1. Rnase R Behandlung
HINWEIS: In den folgenden Schritten wird das Reaktionsvolumen auf ein Gesamtvolumen von 50 l eingestellt. Dies ist das minimale Probenvolumen, das im RNA-Bereinigungs- und Konzentrator-Kit verwendet werden soll (siehe Tabelle der Materialien). Zusätzlich ist das hier beschriebene optimierte Protokoll für eine Eingangsmenge von 4 g Gesamt-RNA. Für eine Eingangsmenge von >4 g wird eine längere Inkubationszeit für die RNase R-Behandlung empfohlen.
<ol><li>Verdünnen Sie die Gesamt-RNA in 39 l RNase-freiem Wasser in einem Mikrozentrifugenrohr auf 4 g und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.</li>
	<li>In einem separaten Rohr die RNase R auf eine Arbeitskonzentration von 2 U/L mit 1x RNase R-Reaktionspuffer verdünnen. Machen Sie nur genug für den sofortigen Gebrauch.</li>
	<li>Pipette 39 l der gesamten RNA und 5 l 10x RNase R Reaktionspuffer in ein 1,5 ml Reaktionsrohr und mischen Sie gut durch Pipettieren (50 l wird das gesamte Reaktionsvolumen sein). Als nächstes fügen Sie 6 l RNase R (2 U/L) hinzu.</li>
	<li>Stellen Sie die Pipette auf das volle Reaktionsvolumen (50 l) ein und mischen Sie sie gut, indem Sie 10-mal nach oben und unten pfeifen.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr 10 min in ein 37 °C-Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass das volle Reaktionsvolumen in das Wasserbad eingetaucht ist.</li>
	<li>Legen Sie die Röhre auf Eis und gehen Sie sofort mit RNA-Reinigung & Konzentration (Abschnitt 2) fort.</li>
</ol>2. Reinigung der RNA mit einem RNA Cleanup and Concentrator Kit
HINWEIS: Bei Verwendung hochwertiger RNA (RIN>8, DV200>80%) kann die RNase R-Behandlung zu einem Verlust von ca. 60% der RNA führen. Mit einem 4-g-Eingang wird geschätzt, dass nach Abschnitt 1 2–2,5 g behandelte RNA übrig bleiben.
<ol><li>Vor dem Start den RNA-Waschpuffer vorbereiten, indem Sie 48 ml 100% Ethanol in das Pufferkonzentrat geben und durch Pipettieren gut mischen. Platzieren Sie Reinigungssäulen in Sammelrohre (siehe Materialtabelle) und legen Sie sie in ein Rohrgestell. HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden Zentrifugationseinstellungen für alle folgenden Schritte: 10.000–16.000 x g. Wenn die Behandlung von DNase I bereits durchgeführt wurde, überspringen Sie die DNase I-Behandlung in diesem Stadium.</li>
	<li>Fügen Sie der von RNase R behandelten Probe 2 Volumen von RNA-Bindungspuffer hinzu und mischen Sie sie gut durch Pipettieren (Gesamtvolumen: 150 l).</li>
	<li>Fügen Sie dem mit DER RNA-Bindungspuffer und rNase R behandelten Probenmischung 1 Volumen von 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie sie gut durch Pipettieren (Gesamtvolumen: 300 l).</li>
	<li>Übertragen Sie das gesamte Volumen auf die Säule und zentrieren Sie die Säule für 30 s. Entsorgen Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Fügen Sie 400 L RNA-Vorbereitungspuffer direkt in die Spalte, zentrifugieren Sie die Säule für 30 s und entsorgen Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Fügen Sie der Säule 700 l RNA-Waschpuffer direkt hinzu, zentrifugieren Sie die Säule für 30 s und entsorgen Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Fügen Sie 400 l RNA-Waschpuffer direkt in die Säule, zentrifugieren Sie die Säule für 2 min und übertragen Sie die Säule in ein frisches RNase-freies 1,5 ml-Rohr.</li>
	<li>Fügen Sie 11 L RNase-freies Wasser direkt in die Säule ein, indem Sie die Pipettenspitze direkt über dem Säulenfilter halten und sicherstellen, dass Wasser nur auf dem Säulenfilter landet.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Säule für 1 min bei Raumtemperatur und Zentrifuge für 1 min.</li>
	<li>Bevor Sie die Spalte verwerfen, überprüfen Sie, ob der Durchfluss im RNase-freien Rohr durchfließt. Wenn die Elution erfolgreich war, lagern Sie die Probe bei -80 °C oder fahren Sie sofort mit der Bibliotheksvorbereitung fort. Für den Bibliotheksbau wird das endgültige Gesamtelutionsvolumen von ca. 10 l verwendet. HINWEIS: Haltepunkt: Lassen Sie die RNA bis zu 7 Tage bei -80 °C liegen, bevor Sie mit der Bibliotheksvorbereitung fortfahren.</li>
</ol>3. circRNA Library Prep
HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien für Kit, das die meisten reagenzien enthält, die in diesem Abschnitt verwendet werden.
<ol><li>rRNA-Erschöpfung und Fragmentierung<ol>
<li>Übertragen Sie 10 l gereinigte RNA von Schritt 2,10 auf einen sauberen Brunnen in einer neuen 96-well 0,3 ml PCR-Platte. Fügen Sie dem Brunnen 5 l rRNA-Bindungspuffer hinzu, gefolgt von 5 l rRNA Removal Mix. Sanft Pipette nach oben und unten 10 Mal zu mischen.</li>
		<li>Dichtungsplatte und inkubieren Sie für 5 min bei 68 °C auf einem vorprogrammierten, vorgeheizten Thermocyclerblock. Nach Abschluss der 5 min Inkubation Platte auf die Bank legen und bei Raumtemperatur für 1 min inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Dichtung von der Platte. Fügen Sie 35 l wirbelnde Raumtemperatur rRNA Entfernungsperlen zu Probe. Stellen Sie die Pipette auf 45 l und die Pipette 10–20x nach oben und unten ein, um sie gründlich zu mischen. Inkubationsplatte für 1 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Platte auf einen Magnetischen Ständer übertragen und auf dem Ständer für 1 min oder bis die Lösung klar ist, inkubieren. Übertragen Sie den gesamten Überstand (ca. 45 l) auf einen neuen Brunnen auf derselben Platte oder eine neue Platte (je nachdem, mit wie vielen Proben Sie arbeiten).</li>
		<li>Wirbel die RNA-Reinigungsperlen (siehe Tabelle der Materialien) bis gut dispergiert, und fügen Sie 99 L Perlen zu jeder Probe. Pipette nach oben und unten 10x zu mischen. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
		<li>Übertragen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer und inkubieren Sie zusätzlich 5 min oder bis die Lösung klar ist. Entfernen und entsorgen Sie den gesamten Überstand aus dem Brunnen.</li>
		<li>Mit der Platte noch auf dem magnetischen Ständer, fügen Sie 200 l frisch zubereitete 80% EtOH in den Brunnen, ohne die Perlen zu stören. 30 s inkubieren, dann Ethanol entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie dies für insgesamt 2 Wähbe.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Bohrwert 11 L Elution Buffer und pipette nach oben und unten 10 Mal zum Mischen hinzu. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren und dann auf den magnetischen Ständer übertragen, bis sich die Lösung abklärt (1–5 min).</li>
		<li>Übertragen Sie 8,5 l des Überstandes vom Brunnen auf einen neuen Brunnen auf der gleichen Platte oder auf eine neue Platte. Fügen Sie jeder bohrenhaltigen Probe 8,5 l elute, Primer, Fragment High-Mischung hinzu. Pipette auf und ab 10 Mal gründlich mischen.</li>
		<li>Dichtungsplatte und inkubieren für 8 min bei 94 °C auf einem vorprogrammierten, vorgeheizten Thermocyclerblock. Entfernen Sie vom Thermocycler, wenn er 4 °C erreicht, und Zentrifuge kurz. HINWEIS: Fahren Sie sofort mit dem Synthesize First Strand cDNA-Protokoll fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthesize-cDNA<ol>
<li>Für jede zu erstellende Probe 9 L First Strand Synthesis Mix mit 1 L Reverse-Transkriptase mischen (siehe Materialtabelle). Fügen Sie der Probe 8 l der Mischung hinzu. Pipette nach oben und unten 6 mal zu mischen.<ol>
<li>Dichtungsplatte und Inkubation auf einem vorprogrammierten, vorgeheizten Thermocyclerblock mit folgenden Parametern: 25 °C für 10 min, 42 °C für 15 min, 70 °C für 15 min, 4 °C halten. Fahren Sie sofort zur zweiten Strangsynthese fort.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fügen Sie jeder Probe 5 L Resuspension-Puffer hinzu, gefolgt von 20 L des Master-Mixes "Second Strand Marking". Pipette das gesamte Volumen nach oben und unten 6 mal.</li>
		<li>Dichtungsplatte und Inkubation auf einem vorprogrammierten, vorgewärmten Thermocycler-Block auf 16 °C für 1 h eingestellt. Nach der Inkubation die Platte aus dem Thermocycler entfernen und auf Raumtemperatur ausdugieren lassen.</li>
		<li>Vortex PCR Reinigungsperlen (siehe Tabelle der Materialien) und fügen Sie 90 L Perlen zu jedem Brunnen der Probe. Pipette auf und ab 10 Mal gründlich mischen. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Die Perlen-/Probenmischung auf den magnetischen Stand übertragen und 5 min oder bis flüssigkeitsfrei wird, inkubieren. Entfernen und verwerfen Sie Überstand.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Probe 200 L von 80 % EtOH hinzu. Inkubieren Sie Proben auf dem magnetischen Ständer bei Raumtemperatur für 30 s. Verwerfen Überstand. Wiederholen Sie 1x.</li>
		<li>Lassen Sie Perlen bei Raumtemperatur für 6 min trocknen, und dann aus dem magnetischen Ständer entfernen.</li>
		<li>Resuspend Perlen in 19,5 l Resuspension Puffer. Pipette auf und ab 10 Mal gründlich mischen. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren, dann auf den magnetischen Stand übertragen und zusätzlich 1 min oder bis die Flüssigkeit abklarheitt, inkubieren.</li>
		<li>Übertragen Sie 17,5 l Überstand auf neue Gut/neue Platte. HINWEIS: Wenn die Proben nicht sofort fortgesetzt werden, können sie bis zu 7 Tage bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Bibliotheksvorbereitung<ol>
<li>Fügen Sie jedem Brunnen, der über einen Überstand enthält, 12,5 l A-Tailing Mix hinzu. Pipette das gesamte Volumen nach oben und unten 10 mal zu mischen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Reaktion auf einem vorprogrammierten, vorgewärmten Thermocycler-Block, der auf 37 °C eingestellt ist, mit den folgenden Parametern: 37 °C für 30 min, 70 °C für 5 min, 4 °C halten. Wenn die Proben 4 °C erreichen, fahren Sie sofort mit adapterligation fort.</li>
		<li>Zu jeder Probe fügen Sie 2,5 l Resuspension-Puffer, 2,5 l eines einzigartigen RNA-Adapters und 2,5 l Ligation Mix hinzu. Pipette nach oben und unten 10x zu mischen.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben auf einem vorprogrammierten, vorgewärmten Thermocyclerblock bei 30 °C für 10 min.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Probe und Pipette 5 L Stop Ligation Puffer nach oben und unten hinzu, um sie zu mischen.</li>
		<li>Fügen Sie 42 L gemischte PCR-Reinigungsperlen zu jeder Probe hinzu und mischen Sie sie gründlich. Befolgen Sie die Schritte 3.2.6 bis 3.2.10, ändern Sie jedoch das Resuspensionsvolumen auf 52 l und das Endelutionsvolumen auf 50 l.</li>
		<li>Wiederholen Sie das PCR-Reinigungs-Perlenprotokoll mit der 50-L-Elution ab Schritt 3.3.6 erneut, ändern Sie jedoch das Resuspensionsvolumen auf 22 l und das Endelutionsvolumen auf 20 l. HINWEIS: Wenn die Proben nicht sofort fortgesetzt werden, können sie bis zu 7 Tage bei -20 °C gelagert werden.</li>
		<li>Fügen Sie jeweils 5 L PCR Primer Cocktail und 25 l PCR Master Mix zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 10 mal. Inkubieren Sie die Reaktion auf einem vorprogrammierten, vorgewärmten Thermocyclerblock unter Verwendung der folgenden Parameter: 98 °C für 30 s; dann 8 Zyklen von 98 °C für 10 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; dann 72 °C für 5 min, dann 4 °C halten. HINWEIS: Die Optimierung der Gesamtzahl der PCR-Zyklen kann erforderlich sein, um ausreichende Mengen an Bibliothek für die Sequenzierung zu generieren.</li>
		<li>Folgen Sie dem Protokoll zur PCR-Perlenreinigung (Schritte 3.2.4 bis 3.2.9), außer fügen Sie 50 L gut gemischte PCR-Reinigungsperlen hinzu und ändern Sie das Resuspensionsvolumen auf 32,5 l bei einem endendgültigen Elutionsvolumen von 30 l. HINWEIS: Die Proben sollten bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantifizierung und Qualitätskontrolle mit einem Nukleinsäureanalysator<ol>
<li>Bänder und Reagenzien bei Raumtemperatur 30 min ausdünnen lassen.</li>
		<li>Mischen Sie 2 L Bibliothek mit 2 L HS D1000 Puffer, und fügen Sie zu einer kompatiblen Well-Platte.</li>
		<li>Dicht fest mit kompatibler Foliendichtung und Wirbel für 1 min bei 2.000 Umdrehungen/min versiegeln.</li>
		<li>Drehen Sie die Anzeige und laden Sie die Platte auf den Analysator, nachdem Software-Eingabeaufforderungen angezeigt werden. HINWEIS: Bibliotheken sollten etwa 260 bp groß sein.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenanalyse-Workflow
<ol><li>Sequenz-RNA-seq-Bibliotheken (siehe Tabelle der Materialien), um 82 bp paired-end-Lesevorgänge zu generieren. Konvertieren Sie unformatierte Sequenzierungsdaten in Form von Basecall-Dateien (.bcl) in FASTQs mit dem Tool bcl2fastq (v0.2.19).</li>
	<li>Erkennen Sie circRNAs. HINWEIS: Basierend auf zuvor berichteten Beweisen, dass ein Ensemble-CircRNA-Erkennungsansatz besser funktioniert als mit einem einzigen Detektionstool21,22, empfehlen wir die Verwendung mehrerer Werkzeuge für die circRNA-Erkennung. Hier wurden circRNAs mit sechs vorhandenen circRNA-Vorhersagealgorithmen identifiziert: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE und DCC, wobei die empfohlenen Parametereinstellungen für jeden Algorithmus angewendet wurden.<ol>
<li>Laden Sie jeden circRNA-Erkennungsalgorithmus auf einem Linux-Hochleistungs-Computing-Cluster herunter und installieren Sie ihn unter Verwendung der von den Entwicklern bereitgestellten Anweisungen.</li>
		<li>Richten Sie DIE FASTQs von RNA-seq an dem Referenzgenom (GRCh37) aus, wobei der für jedes Werkzeug empfohlene Aligner verwendet wird.</li>
		<li>Führen Sie nach der Ausrichtung circRNA-Erkennungsalgorithmen aus, indem Sie die jeweils empfohlenen Parametereinstellungen anwenden.</li>
		<li>Jedes Tool gibt eine mehrspaltige Ergebnisdatei mit der Liste der erkannten circRNAs aus, extrahiert die circRNA-Koordinaten und die Anzahl der unterstützenden Lesevorgänge daraus, um die Anzahl der in jeder Probe/Testbedingung erkannten Kandidaten zu quantifizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konvertieren Sie die von CIRI, Mapsplice und DCC ausgegebenen circRNA-Koordinaten in 0-basierte Koordinaten, um mit den anderen drei Algorithmen konsistent zu sein.</li>
	<li>Wählen Sie circRNAs mit zwei oder mehr unterstützenden Lese- oder Nachflussanalysen und -vergleichen aus. Tabelle 1 fasst alle in unserer Studie ausgewerteten Parameter zusammen mit der Gesamtzahl der für jede Stichprobe generierten Sequenzierungslesevorgänge zusammen.</li>
	<li>Zählen Sie für jede Beispiel-/Testbedingung die Anzahl der erkannten circRNAs, die normalisiert wurden, auf die Anzahl der zugeordneten Lesevorgänge, die für diese Bibliothek generiert wurden, pro Million. Fassen Sie die Ergebnisse über die verschiedenen Werkzeuge/Beispiele in Box-Plots zusammen, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben.</li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733(2012).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li>
<li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li>
<li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrambled+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li>
<li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777(2013).</li>
<li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li>
<li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li>
<li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li>
<li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p%2FmiR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919(2016).</li>
<li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIRI%3A+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573(2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MapSplice%3A+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178(2010).</li>
<li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695(2015).</li>
<li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sequence-mediated+exon+circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li>
<li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant%2C+conserved%2C+and+dynamically+expressed%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li>
<li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li>
<li>Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58(2016).</li>
<li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420(2017).</li>
<li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACValidator%3A+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li>
<li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circular+RNAs%3A+bioinformatic+and+experimental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li>
<li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2(2019).</li>
<li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In dieser Studie wurden zwei kommerziell erhältliche Bibliotheksvorbereitungskits, Vorbehandlungsoptionen und Eingangs-RNA-Mengen getestet, um ein circRNA-Anreicherungsprotokoll für den Bau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken zu optimieren. Basierend auf den Bewertungen dieser Studie sind eine Reihe wichtiger Aspekte und kritische Schritte bei der Erstellung von circRNA-Sequenzierungsbibliotheken offensichtlich. Unsere Bewertung bestätigt den Nutzen der RNase R-Vorbehandlung, was sich in der erhöhten Anzahl der nachge...

Circular RNAs (CircRNAs) sind endogene, nicht-kodierende RNAs, die aufgrund ihrer allgegenwärtigen Expression im eukaryotischen Transkriptom1,2,3Aufmerksamkeit erlangt haben. Sie werden gebildet, wenn exons zurück zueinander und daher wurden zunächst als spleißende Artefakte4,5. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass CircRNAs Zelltyp, Gewebe und Entwicklungsstadium spezifische Expression3,6 aufweisen und evolutionär konserviert sind2,3. Darüber hinaus sind sie an der Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen7, Mikro-RNA (miRNA) Bindung3,8,9,10, und Regulierung der elterlichen Gentranskription beteiligt11.
Bei der klassischen RNA-Sequenzierung (RNA-seq) können CircRNAs während des Bibliotheksbaus als Folge der Poly-A-Auswahl für mRNAs vollständig verloren gehen oder aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwer zu isolieren sein. Jüngste CircRNA-Charakterisierungsstudien haben jedoch einen Vorbehandlungsschritt mit RNase R integriert, um für circRNAs2,12,13anzureichern. RNase R ist eine Exoribonuklease, die lineare RNAs verdaut und kreisförmige RNA-Strukturen hinterlässt. CircRNA-Anreicherungsprotokolle wurden optimiert, indem Daten aus zwei kommerziell erhältlichen Gesamt-Transkriptom-Bibliotheksbausätzen mit und ohne RNase R-Vorbehandlungsschritt generiert und verglichen wurden und unterschiedliche Mengen an RNA-Eingang (1 bis 4 g) verwendet wurden. Das optimierte Protokoll wurde als nächstes verwendet, um die Häufigkeit von CircRNAs in fünf verschiedenen Hirnregionen (Kleinhirn [BC], minderwertiger parietaler Lappen [IP], mittlerer zeitlicher Gyrus [MG], okzipitaler Kortex [OC] und überlegener frontaler Gyrus [SF]) und vier anderen Gewebetypen (Leber [LV], Lunge [LU], Lymphknoten [LN] und Bauchspeicheldrüse [PA]) zu bewerten. RNA-Seq-Bibliotheken wurden am Ende sequenziert und die Daten wurden mit sechs verschiedenen circRNA-Vorhersagealgorithmen analysiert: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17und CIRCexplorer18. Basierend auf unserer Analyse wurde die höchste Anzahl einzigartiger CircRNAs bei der Verwendung eines gestrandeten gesamten RNA-Bibliotheksvorbereitungskits mit RNase R-Vorbehandlung und 4 g Gesamt-Input-RNA nachgewiesen. Das optimierte Protokoll wird hier beschrieben. Wie bereits berichtet19,20, wurde die höchste Anreicherung von CircRNAs im Gehirn im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.

<table><tbody><tr><td>1.000 & Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L Pipettenspitzen</td><td>Rainin</td><td>SR L 10F</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Pipettenspitzen</td><td>Rainin</td><td>SR L 200F</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Zubehör (Folienabdeckungen)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5154</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Zubehör (Spitzen)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5153</td><td></td></tr><tr><td>Klebefolie für Mikrotiterplatten</td><td>VWR</td><td>60941-064</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads 450 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>PCR-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Platten</td><td>VWR</td><td>951020401</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 Reagenzien</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td><td>Illumina</td><td>PE-410-1001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 Zyklen)</td><td>Illumina</td><td>FC-410-1002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000 Sequenziersystem</td><td>Illumina</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td><td>Illumina</td><td>PE-402-4002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 Zyklen)</td><td>Illumina</td><td>FC-402-4022</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Total RNA Kit</td><td>Roche</td><td>KK8400</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol in molekularbiologischer Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Supply Center von Thermo Fischer</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td><td>Supply Center von Thermo Fischer</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Aufreinigungs- und Konzentrator - 5</td><td>Zymo</td><td>RCC-100</td><td>Enthält Aufreinigungssäulen und Sammelröhrchen</td></tr><tr><td>RNAClean XP Beads</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td></td><td>RNA Cleanup Beads</td></tr><tr><td>Rnase R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transkriptase 10.000 Einheiten</td><td>ThermoFisher (LifeTech)</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Nukleinsäure-Analysator</td></tr><tr><td>TElowE</td><td>VWR</td><td>10128-588</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Vorbereitungskit für die Gesamt-RNA-Bibliothek</td><td>Illumina</td><td></td><td>20020596 Kit, das in Abschnitt 3 verwendet wird</td></tr><tr><td>Geteiltes Tablett mit zwei Kammern</td><td>VWR</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasserversorgungszentrum</td><td>von Thermo Fischer</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Universalkontroll-RNA</td><td>Agilent</td><td>740000</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von kreisförmigen rnas mittels rna-sequenzierung

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circular RNAs (circRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierenden RNAs, die an Funktionen wie Mikro-RNA-Regulierung (miRNA), Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulierung der elterlichen Gentranskription beteiligt sind. In der klassischen RNA-Sequenzierung der nächsten Generation (RNA-seq) werden CircRNAs in der Regel als Ergebnis der Poly-A-Auswahl während des Aufbaus von mRNA-Bibliotheken übersehen oder sind in sehr geringer Häufigkeit zu finden und daher schwer zu isolieren und zu erkennen. Hier wurde ein circRNA-Bibliotheksbauprotokoll optimiert, indem Bibliotheksvorbereitungskits, Vorbehandlungsoptionen und verschiedene gesamte RNA-Eingangsmengen verglichen wurden. Getestet wurden zwei handelsübliche Volltranskriptom-Bibliotheksvorbereitungskits mit und ohne RNase R-Vorbehandlung und unter Verwendung variabler Mengen des gesamten RNA-Eingangs (1 bis 4 g). Schließlich, mehrere Gewebetypen; einschließlich Leber, Lunge, Lymphknoten und Bauchspeicheldrüse; sowie mehrere Hirnregionen; einschließlich des Kleinhirns, des minderwertigen parietalen Lappens, des mittleren zeitlichen Gyrus, des okzipitalen Kortex und des überlegenen frontalen Gyrus; wurden verglichen, um die Häufigkeit von ZirkRNA über Gewebetypen hinweg zu bewerten. Die Analyse der generierten RNA-Seq-Daten mit sechs verschiedenen circRNA-Detektionswerkzeugen (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC und CIRCexplorer) ergab, dass ein gestrandetes Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitungskit mit RNase R-Vorbehandlung und 4-g-RNA-Eingang der optimale Methode zur Identifizierung der höchsten relativen Anzahl von circRNAs. Im Einklang mit früheren Befunden wurde die höchste Anreicherung von CircRNAs in Hirngeweben im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.

Die daten, die mit einer kommerziell erhältlichen Universal Control RNA (UC) und mit zwei Bibliotheksvorbereitungskits generiert wurden, die beide einen Ribo-Erschöpfungsschritt in ihren Protokollen enthalten, wurden zuerst ausgewertet. Mit Hilfe eines analytischen Workflows (Datenanalyse-Workflow, Abschnitt 4) wurde insgesamt eine höhere Anzahl von circRNAs in den TruSeq-Datasets im Vergleich zu den Kapa-Datasets erkannt (Abbildung 1). Obwohl die ribosomalen RNA-Prozentsätze (rRNA) in Daten...

Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Dieses Protokoll ist das Ergebnis der Bewertung wichtiger Aspekte der CircRNA-Bibliotheksvorbereitung, wie Kit-Typ, RNase-R-Behandlung, Eingangsmengen und deren Auswirkungen auf die circRNA-Erkennung. Es ermöglicht eine optimale circRNA-Erkennung und liefert Daten zu einstellbaren Parametern, die von den Bedürfnissen des Benutzers abhängen. Die Identifizierung von CircRNAs in verschiedenen Probentypen wird uns helfen, die Verteilung ihrer Expression besser zu verstehen und die Voraussetzungen für die Abgrenzung der funktionellen Rolle dieser Moleküle zu stellen.Diese Methode kann auf jede gesamte RNA-Probe angewendet werden. Es ist wichtig, RNA-Proben vor Beginn des Protokolls auf Eis zu halten. Bewerten Sie die RIN- und DV200-Werte auf dem Agilent Bioanalyzer oder TapeStation vor der Vorbereitung, und befolgen Sie die entsprechenden Verfahren bei der Arbeit mit RNA.Beginnen Sie mit der Verdünnung der gesamten RNA auf vier Mikrogramm in 39 Mikroliter RNase-freiem Wasser und pipetieren Sie es nach oben und unten, um es zu mischen. Verwenden Sie in einem separaten Rohr den 1x RNase R Buffer, um die RNase R auf eine Arbeitskonzentration von zwei Einheiten pro Mikroliter zu verdünnen. Pipette 39 Mikroliter gesamter RNA und fünf Mikroliter 10x RNase R Reaktionspuffer in ein 1,5-Mikroliter-Reaktionsrohr und mischen.Fügen Sie sechs Mikroliter der verdünnten RNase R.Dann stellen Sie die Pipette auf volles Reaktionsvolumen, und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren nach oben und unten 10 mal. Legen Sie das Rohr 10 Minuten lang in ein 37-Grad-Wasserbad, um sicherzustellen, dass das volle Reaktionsvolumen in das Wasserbad eingetaucht ist. Dann legen Sie die Röhre auf Eis, und gehen Sie sofort mit RNA-Reinigung und Konzentration.Vor dem Start den RNA-Waschpuffer vorbereiten, indem Sie das Konzentrat mit 48 Millilitern 100% Ethanol mischen und Reinigungssäulen in Sammelrohre legen. Wenn Sie bereit sind, fügen Sie der RNase R-behandelten Probe zwei Bände RNA-Bindungspuffer hinzu und mischen Sie sie gut. 150 Mikroliter 100% Ethanol in das Gemisch für insgesamt 300 Mikroliter geben, das gesamte Volumen auf die Säule übertragen und 30 Sekunden zentrifugieren.Entfernen Sie den Durchfluss, und fügen Sie 400 Mikroliter RNA Prep Buffer direkt zur Spalte hinzu. Zentrifuge für 30 Sekunden, und entsorgen Sie den Fluss durch. Fügen Sie dann 700 Mikroliter RNA-Waschpuffer in die Spalte, Zentrifuge für 30 Sekunden, und entsorgen Sie den Durchfluss durch.Fügen Sie weitere 400 Mikroliter des Waschpuffers, Zentrifuge für zwei Minuten, und übertragen Sie die Säule auf eine frische RNase-freie 1,5-Milliliter-Rohr. Fügen Sie vorsichtig 11 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt in die Säule ein, indem Sie die Pipettenspitze direkt über dem Säulenfilter halten. Lassen Sie die Probe eine Minute bei Raumtemperatur sitzen, und zentrifugieren Sie sie dann für eine Minute.Stellen Sie sicher, dass in der 1,5-Milliliter-Röhre durchgeflossen ist, und entsorgen Sie die Spalte. Die gereinigte RNA-Probe kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert oder sofort zur Bibliotheksvorbereitung verwendet werden. Übertragen Sie 10 Mikroliter der gereinigten Gesamt-RNA in einen sauberen Brunnen in einer 96-Well-PCR-Platte.Fügen Sie fünf Mikroliter rRNA Binding Buffer gefolgt von fünf Mikroliterr rRNA Removal Mix hinzu, dann sanft Pipetten nach oben und unten, um die Reagenzien zu mischen. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie sie fünf Minuten lang bei 68 Grad Celsius auf einem vorprogrammierten und vorgeheizten Thermocyclerblock. Nach der Inkubation die Platte eine Minute bei Raumtemperatur sitzen lassen.Entfernen Sie die Dichtung von der Platte, und fügen Sie 35 Mikroliter wirbelnden Raumtemperatur rRNA Entfernungsperlen in die Probe. Stellen Sie die Pipette auf 45 Mikroliter und die Pipette 10 bis 20 Mal nach oben und unten ein, um sie gründlich zu mischen. Lassen Sie die Platte eine Minute bei Raumtemperatur sitzen.Übertragen Sie die Platte auf einen magnetischen Ständer, und inkubieren Sie sie dort für eine Minute oder bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Brunnen auf dem Teller. Dann übertragen Sie die Platte vom magnetischen Ständer auf den Plattenständer.Vortex RNA Cleanup Perlen, bis sie gut dispergiert sind, und fügen Sie 99 Mikroliter Perlen in die Probe. Pipette nach oben und unten zu mischen, und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Übertragen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer, und lassen Sie es dort für fünf Minuten oder bis die Lösung klar, dann entfernen und entsorgen Sie alle Überstand aus dem Brunnen.Mit der Platte noch auf dem magnetischen Ständer, fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitet80%Ethanol in den Brunnen, ohne die Perlen zu stören. Lassen Sie das Ethanol 30 Sekunden im Brunnen, entfernen sie und entsorgen Sie es. Fügen Sie 11 Mikroliter Elution Buffer in den Brunnen, und Pipette es nach oben und unten zu mischen.Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Minuten, dann übertragen Sie sie zurück auf den magnetischen Stand, und halten Sie sie dort, bis die Lösung klar ist. 8,5 Mikroliter des Überstandes auf einen neuen Brunnen auf derselben Platte übertragen und 8,5 Mikroliter Elute, Primer, Fragment High Mix zu jedem Brunnen hinzufügen, der eine Probe enthält. Pipette 10 Mal nach oben und unten, um gründlich zu mischen, versiegeln Sie die Platte, und inkubieren Sie es für acht Minuten in einem Thermocycler vorgewärmt auf 94 Grad Celsius.Kühlen Sie die Probe auf vier Grad Celsius, entfernen Sie die Platte aus dem Thermocycler und zentrifugieren Sie sie kurz. Zwei Bibliotheksvorbereitungskits, TruSeq und KAPA, wurden für dieses Protokoll bewertet. Insgesamt wurde bei der Verwendung des TruSeq-Kits eine höhere Anzahl von kreisförmigen RNAs und ein geringerer Prozentsatz ribosomaler RNA nachgewiesen, so dass TruSeq für weitere Experimente ausgewählt wurde.Die Signifikanz der RNase R-Vorbehandlung wurde durch den Vergleich der Daten aus vorbehandelten und nicht vorbehandelten Bibliotheken bewertet. Wie erwartet wurde in den vorbehandelten Bibliotheken eine höhere Anzahl von kreisförmigen RNAs im Vergleich zu nicht vorbehandelten Bibliotheken einheitlich identifiziert. Die Menge der Eingangs-RNA wurde optimiert, um eine höhere Vielfalt an kreisförmigen RNAs zu erkennen.Bibliotheken wurden mit einem, zwei und vier Mikrogramm Input-RNA erstellt, und die höchste Vielfalt an kreisförmigen RNA-Arten wurde beobachtet, wenn vier Mikrogramm gesamter RNA verwendet wurden. Das optimierte Protokoll wurde verwendet, um kreisförmige RNA-Überfluss in fünf Hirnregionen von vier gesunden Spendern und für andere Gewebetypen von sechs gesunden Spendern zu vergleichen. Insgesamt wurde eine höhere Fülle von kreisförmiger RNase im Gehirn im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, bei der Arbeit mit RNA geeignete Verfahren zu befolgen, einschließlich des Tragens von Handschuhen, gründlicher Reinigung der Bank und Pipetten mit RNase-Tüchern oder Spray, bevor Sie das Protokoll beginnen, und die RNA vorher auf Eis zu halten. Nach diesem Verfahren kann eine orthogonale Validierung wie die Sanger-Sequenzierung identifizierter CircRNA-Knoten durchgeführt werden. Die Entdeckung neuer CircRNAs und weitere Beweise für ihre Anwesenheit erschließen ein neues Forschungsgebiet für die Erforschung ihrer biologischen Funktionen.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung endogener RNA-Bindungsstellen oder "Footprints" von RNA:Protein(RNP)-Komplexen aus Säugetierzellen vor. Dieser Ansatz umfasst zwei Immunpräzipitationen von RNP-Untereinheiten und wird daher als RNA-Immunpräzipitation im Tandem (RIPiT) bezeichnet.

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

Wir präsentieren eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie, indem wir kreisförmige RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung und Northern Blot kombinieren. Dieses Protokoll enthält einen Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren, und es eignet sich zur Unterscheidung und Kartierung der primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt werden.

Diskrimintion und Mapping der primären und verarbeiteten Transkripte in Mais mitochondrion mit einer kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte Methode der digitalen Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zur präzisen Quantifizierung von zirkulären RNA (circRNA)-Spiegeln in Zellen unter Verwendung divergenter Primer.

Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR

Das hier eingereichte Protokoll erläutert die vollständige In-silico-Pipeline , die für die Vorhersage und funktionelle Charakterisierung von circRNAs aus RNA-Sequenzierungs-Transkriptomdaten zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen erforderlich ist.

In Silico Identifizierung und Charakterisierung von circRNAs während Wirt-Pathogen-Interaktionen

Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Einzelne Zell Sequenzierung ist ein immer beliebter und zugängliches Werkzeug für genomische Veränderungen bei hoher Auflösung Adressierung. Wir bieten ein Protokoll, das einzelne Zelle Sequenzierung verwendet Kopienzahl Veränderungen in einzelnen Zellen zu identifizieren.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Hier beschreiben wir die Methode des S- Zensierens von P- Soralen-vernetzten, l- igierten und S- gewählten H- Ybriden (SPLASH), die eine genomweite Abbildung von intramolekularen und intermolekularen RNA-RNA-Wechselwirkungen in vivo ermöglichen. SPLASH kann angewendet werden, um RNA-Interaktome von Organismen einschließlich Hefe, Bakterien und Menschen zu untersuchen.

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Galaxy und DAVID haben als beliebte Werkzeuge entstanden, die Ermittler ohne Bioinformatik Ausbildung ermöglichen RNA-Seq Daten zu analysieren und zu interpretieren. Wir beschreiben ein Protokoll für C. elegans Forscher RNA-Seq Versuche, den Zugang und verarbeiten die Daten - Set mit Galaxy und erhalten aussagekräftige biologische Informationen aus den Gen - Listen mit DAVID auszuführen.

Transkriptom-Analyse von<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequenzierung Daten durch die Tuxedo Suite auf dem Galaxy-Projekt

Wir beschreiben eine original Transfer-RNA-Analyse-Plattform namens SPOt (optimierte Plattform für die Beobachtung der tRNA). Ort und Stelle misst simultan zelluläre Ebenen alle tRNAs in biologischen Proben, in nur drei Schritten und in weniger als 24 Stunden.

Metabolische Etikettier- und Profilierung des Transfer-RNAs mit Macroarrays

Lernen Sie die optimierte Präparation von circRNA-Sequenzierungsbibliotheken mit RNase R-Behandlung und Qualitätskontrolle. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifizierung zirkulärer RNAs in verschiedenen Proben.

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

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