Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Dieses Protokoll ist das Ergebnis der Bewertung wichtiger Aspekte der CircRNA-Bibliotheksvorbereitung, wie Kit-Typ, RNase-R-Behandlung, Eingangsmengen und deren Auswirkungen auf die circRNA-Erkennung. Es ermöglicht eine optimale circRNA-Erkennung und liefert Daten zu einstellbaren Parametern, die von den Bedürfnissen des Benutzers abhängen. Die Identifizierung von CircRNAs in verschiedenen Probentypen wird uns helfen, die Verteilung ihrer Expression besser zu verstehen und die Voraussetzungen für die Abgrenzung der funktionellen Rolle dieser Moleküle zu stellen.

Diese Methode kann auf jede gesamte RNA-Probe angewendet werden. Es ist wichtig, RNA-Proben vor Beginn des Protokolls auf Eis zu halten. Bewerten Sie die RIN- und DV200-Werte auf dem Agilent Bioanalyzer oder TapeStation vor der Vorbereitung, und befolgen Sie die entsprechenden Verfahren bei der Arbeit mit RNA.

Beginnen Sie mit der Verdünnung der gesamten RNA auf vier Mikrogramm in 39 Mikroliter RNase-freiem Wasser und pipetieren Sie es nach oben und unten, um es zu mischen. Verwenden Sie in einem separaten Rohr den 1x RNase R Buffer, um die RNase R auf eine Arbeitskonzentration von zwei Einheiten pro Mikroliter zu verdünnen. Pipette 39 Mikroliter gesamter RNA und fünf Mikroliter 10x RNase R Reaktionspuffer in ein 1,5-Mikroliter-Reaktionsrohr und mischen.

Fügen Sie sechs Mikroliter der verdünnten RNase R.Dann stellen Sie die Pipette auf volles Reaktionsvolumen, und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren nach oben und unten 10 mal. Legen Sie das Rohr 10 Minuten lang in ein 37-Grad-Wasserbad, um sicherzustellen, dass das volle Reaktionsvolumen in das Wasserbad eingetaucht ist. Dann legen Sie die Röhre auf Eis, und gehen Sie sofort mit RNA-Reinigung und Konzentration.

Vor dem Start den RNA-Waschpuffer vorbereiten, indem Sie das Konzentrat mit 48 Millilitern 100% Ethanol mischen und Reinigungssäulen in Sammelrohre legen. Wenn Sie bereit sind, fügen Sie der RNase R-behandelten Probe zwei Bände RNA-Bindungspuffer hinzu und mischen Sie sie gut. 150 Mikroliter 100% Ethanol in das Gemisch für insgesamt 300 Mikroliter geben, das gesamte Volumen auf die Säule übertragen und 30 Sekunden zentrifugieren.

Entfernen Sie den Durchfluss, und fügen Sie 400 Mikroliter RNA Prep Buffer direkt zur Spalte hinzu. Zentrifuge für 30 Sekunden, und entsorgen Sie den Fluss durch. Fügen Sie dann 700 Mikroliter RNA-Waschpuffer in die Spalte, Zentrifuge für 30 Sekunden, und entsorgen Sie den Durchfluss durch.

Fügen Sie weitere 400 Mikroliter des Waschpuffers, Zentrifuge für zwei Minuten, und übertragen Sie die Säule auf eine frische RNase-freie 1,5-Milliliter-Rohr. Fügen Sie vorsichtig 11 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt in die Säule ein, indem Sie die Pipettenspitze direkt über dem Säulenfilter halten. Lassen Sie die Probe eine Minute bei Raumtemperatur sitzen, und zentrifugieren Sie sie dann für eine Minute.

Stellen Sie sicher, dass in der 1,5-Milliliter-Röhre durchgeflossen ist, und entsorgen Sie die Spalte. Die gereinigte RNA-Probe kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert oder sofort zur Bibliotheksvorbereitung verwendet werden. Übertragen Sie 10 Mikroliter der gereinigten Gesamt-RNA in einen sauberen Brunnen in einer 96-Well-PCR-Platte.

Fügen Sie fünf Mikroliter rRNA Binding Buffer gefolgt von fünf Mikroliterr rRNA Removal Mix hinzu, dann sanft Pipetten nach oben und unten, um die Reagenzien zu mischen. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie sie fünf Minuten lang bei 68 Grad Celsius auf einem vorprogrammierten und vorgeheizten Thermocyclerblock. Nach der Inkubation die Platte eine Minute bei Raumtemperatur sitzen lassen.

Entfernen Sie die Dichtung von der Platte, und fügen Sie 35 Mikroliter wirbelnden Raumtemperatur rRNA Entfernungsperlen in die Probe. Stellen Sie die Pipette auf 45 Mikroliter und die Pipette 10 bis 20 Mal nach oben und unten ein, um sie gründlich zu mischen. Lassen Sie die Platte eine Minute bei Raumtemperatur sitzen.

Übertragen Sie die Platte auf einen magnetischen Ständer, und inkubieren Sie sie dort für eine Minute oder bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Brunnen auf dem Teller. Dann übertragen Sie die Platte vom magnetischen Ständer auf den Plattenständer.

Vortex RNA Cleanup Perlen, bis sie gut dispergiert sind, und fügen Sie 99 Mikroliter Perlen in die Probe. Pipette nach oben und unten zu mischen, und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Übertragen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer, und lassen Sie es dort für fünf Minuten oder bis die Lösung klar, dann entfernen und entsorgen Sie alle Überstand aus dem Brunnen.

Mit der Platte noch auf dem magnetischen Ständer, fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitet80%Ethanol in den Brunnen, ohne die Perlen zu stören. Lassen Sie das Ethanol 30 Sekunden im Brunnen, entfernen sie und entsorgen Sie es. Fügen Sie 11 Mikroliter Elution Buffer in den Brunnen, und Pipette es nach oben und unten zu mischen.

Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Minuten, dann übertragen Sie sie zurück auf den magnetischen Stand, und halten Sie sie dort, bis die Lösung klar ist. 8,5 Mikroliter des Überstandes auf einen neuen Brunnen auf derselben Platte übertragen und 8,5 Mikroliter Elute, Primer, Fragment High Mix zu jedem Brunnen hinzufügen, der eine Probe enthält. Pipette 10 Mal nach oben und unten, um gründlich zu mischen, versiegeln Sie die Platte, und inkubieren Sie es für acht Minuten in einem Thermocycler vorgewärmt auf 94 Grad Celsius.

Kühlen Sie die Probe auf vier Grad Celsius, entfernen Sie die Platte aus dem Thermocycler und zentrifugieren Sie sie kurz. Zwei Bibliotheksvorbereitungskits, TruSeq und KAPA, wurden für dieses Protokoll bewertet. Insgesamt wurde bei der Verwendung des TruSeq-Kits eine höhere Anzahl von kreisförmigen RNAs und ein geringerer Prozentsatz ribosomaler RNA nachgewiesen, so dass TruSeq für weitere Experimente ausgewählt wurde.

Die Signifikanz der RNase R-Vorbehandlung wurde durch den Vergleich der Daten aus vorbehandelten und nicht vorbehandelten Bibliotheken bewertet. Wie erwartet wurde in den vorbehandelten Bibliotheken eine höhere Anzahl von kreisförmigen RNAs im Vergleich zu nicht vorbehandelten Bibliotheken einheitlich identifiziert. Die Menge der Eingangs-RNA wurde optimiert, um eine höhere Vielfalt an kreisförmigen RNAs zu erkennen.

Bibliotheken wurden mit einem, zwei und vier Mikrogramm Input-RNA erstellt, und die höchste Vielfalt an kreisförmigen RNA-Arten wurde beobachtet, wenn vier Mikrogramm gesamter RNA verwendet wurden. Das optimierte Protokoll wurde verwendet, um kreisförmige RNA-Überfluss in fünf Hirnregionen von vier gesunden Spendern und für andere Gewebetypen von sechs gesunden Spendern zu vergleichen. Insgesamt wurde eine höhere Fülle von kreisförmiger RNase im Gehirn im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, bei der Arbeit mit RNA geeignete Verfahren zu befolgen, einschließlich des Tragens von Handschuhen, gründlicher Reinigung der Bank und Pipetten mit RNase-Tüchern oder Spray, bevor Sie das Protokoll beginnen, und die RNA vorher auf Eis zu halten. Nach diesem Verfahren kann eine orthogonale Validierung wie die Sanger-Sequenzierung identifizierter CircRNA-Knoten durchgeführt werden. Die Entdeckung neuer CircRNAs und weitere Beweise für ihre Anwesenheit erschließen ein neues Forschungsgebiet für die Erforschung ihrer biologischen Funktionen.