Name: Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Erfahren Sie den Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung von Glutamatrezeptor-Trafficking in primären Hippocampus-Kulturen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Oberflächenrezeptoren und deren Internalisierung.

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Wir danken dem Northwestern Center for Advanced Microscopy für den Einsatz des Nikon A1 Konfokalmikroskops und deren Unterstützung bei der Planung und Analyse der Experimente. Diese Forschung wurde von NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) und NIA (R00AG041225) und einem NARSAD Young Investigator Grant von der Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.) unterstützt.

Die Arbeiten im Zusammenhang mit der Vorbereitung der Primärkultur im Hippocampus wurden vom Northwestern University Animal Care and Use Committee (Protokoll #IS00001151) überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung vor der Etikettierung
<ol><li>
Vorbereitung und Aufrechterhaltung der primären Hippocampuskulturen
	<ol>
<li>Bereiten Sie primäre Hippocampuskulturen mit einer Dichte von 150.000 Zellen vor, die auf poly-D-Lysin-beschichteten (0,1 mg/ml) 18 mm Deckgläsern plattiert sind. Ausgezeichnete Anleitungen für dissoziierte neuronale Kulturvorbereitung sind verfügbar7,8. HINWEIS: Bei Bedarf können die Kulturen mit Zytosin-Arabinosid (Ara-C, 10 mM von DIV1) behandelt werden, um eine Gliaproliferation in der Zubereitung zu vermeiden. HINWEIS: Anstelle von Poly-D-Lysin können alternative Beschichtungsreagenzien wie Fibronectin (1 mg/ml) oder Laminin (5 mg/ml) verwendet werden.</li>
		<li>Bewahren Sie die Kulturen in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5% CO2 in 2 ml/Well neurobasaler Medien, ergänzt durch B27 und 2 mM L-Glutamin. HINWEIS: Ersatzstoffe für L-Glutamin (z.B. Glutamax) können auf Wunsch verwendet werden.</li>
		<li>Auf wöchentlicher Basis, entfernen Sie die Hälfte der Menge der Medien und ersetzen Sie mit dem gleichen Volumen von ergänzten neurobasalen Medien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OPTIONAL: Transfektion mutierter und/oder epitopmarkierter Rezeptoren HINWEIS: Neuronen sollten mindestens 3 bis 4 Tage vor dem Analysezeitpunkt transfiziert werden, um eine Rezeptorexpression zu ermöglichen. Die Verwendung junger Neuronen [Tage in vitro 6–9 (DIV6–9)] führt zu einer besseren Transfektionseffizienz als ältere (DIV15–20) Neuronen, aber eine ausreichende Anzahl von transfizierten Zellen (>20) kann unabhängig von der verwendeten DIV erreicht werden.<ol>
<li>Für jeden Brunnen einer 12-Well-Platte 1,5 g Plasmid verdünnen, das das Konstrukt von Interesse in 100 l frischen neurobasalen Medien ohne B27 oder Glutamin-Supplementierung in einem Mikrozentrifugenrohr enthält, und durch schnelles Wirbeln mischen. HINWEIS: Für eine erfolgreiche Transfektion ist es wichtig, dass die verwendeten neurobasalen Medien so frisch wie möglich sind, idealerweise weniger als 1 Woche nach dem Flaschenöffnen.</li>
		<li>In einem zweiten Mikrozentrifugenrohr 1 L eines geeigneten Lipofektionsreagenzes in 100 l frischen neurobasalen Medien mischen und sanft mischen. HINWEIS: Wirbeln Sie die Lipofektionsreagenzmischung nicht. Die Verwendung von frischen Lipofektionsreagenzien kann die Transfektionseffizienz verbessern.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Rohre für 5 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
		<li>Fügen Sie die Lipofection Reagenz Mischung tropfenweise in die DNA-Mischung, mischen Sie sanft, und inkubieren für 20 min bei RT.</li>
		<li>Passen Sie die Medienlautstärke in jedem Brunnen auf 1 ml konditionierte Medien an.</li>
		<li>Fügen Sie das Lipofection-Reagenz -DNA-Mischung tropfenweise in den Brunnen.</li>
		<li>Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und lassen Sie mindestens 3 bis 4 Tage für die Proteinexpression ein. HINWEIS: Für die zwecke der unten beschriebenen Internalisierungs- und Recyclingprotokolle wurden Hippocampus-Neuronen bei DIV11–12 mit Konstrukten transfiziert, die GluN2B mit GFP in der extrazellulären Domäne (GFP-GluN2B) kenngegliedert und bei DIV15–16 abgebildet sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OPTIONAL: Inkubation von Zellen mit Medikamenten (chronisch oder akut) in den konditionierten Medien bis zur Fixierung. HINWEIS: Für die akute Behandlung beginnen Sie mit der Behandlung von Zellen vor der Etikettierung. Je nach verwendetem Arzneimittelbehandlungsprotokoll können Zellen in medikamentenhaltigen Medien während Abschnitt 2 aufrechterhalten werden. In unserem Beispiel waren DIV21-Zellen einem cLTP-Protokoll unterworfen, um die Oberfläche exprimierte AMPAR9zu erhöhen.<ol>
<li>Exchange-Konditionierte Medien für extrazelluläre Lösung (ECS).</li>
		<li>Behandeln Sie Zellen mit 300 M Glycin in ECS für 3 min bei RT. Behandeln Sie als Kontrolle einen Schwesterdeckel mit ECS (ohne Glycin).</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit 37 °C ECS und geben Sie die Zellen in ECS (ohne Glycin) 20 min lang in den Zellinkubator zurück, bevor Sie mit Abschnitt 2 fortfahren. ANMERKUNG: ECS (in mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Glucose, 0.001 TTX, 0.01 Strychnine und 0.03 Picrotoxin bei pH 7.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Live-Etikettierung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren
<ol><li>
Vorbereiten von Coverlips für die Etikettierung
	<ol>
<li>Um Reagenzien zu speichern und die Manipulation zu erleichtern, transferieren Sie Dielipse auf der Zellseite bis zu einem paraffinfilmbedeckten Fach. HINWEIS: Es ist wichtig, die Proben niemals austrocknen zu lassen.</li>
		<li>Speichern und pflegen Sie konditionierte Medien bei 37 °C für Inkubations- und Waschschritte. HINWEIS: Für einen 18-mm-Abdeckungsschlupf wird eine Inkubation mit 75–100 l Medien für die Antikörperkennzeichnung und 120–150 l für die Internalisierung/Recycling empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren mit Primärantikörpern
	<ol>
<li>Inkubieren Sie Zellen mit primärem Antikörper, der in konditionierten Medien für 15 min bei RT verdünnt wird. HINWEIS: Für GFP-markierte Rezeptoren wurde ein Anti-GFP-Antikörper gegen Kaninchen bei einer Verdünnung von 1:1000 verwendet. Für endogenes GluA1 wurde Maus anti-GluA1 bei einer Verdünnung von 1:200 verwendet.</li>
		<li>Saugen Sie die antikörperhaltigen Medien vorsichtig mit einer Vakuumpipette ab und waschen Sie Zellen dreimal mit konditionierten Medien. HINWEIS: Wenn konditionierte Medien nicht verfügbar sind, können alle Waschschritte mit PBS+ [Phosphatgepufferte Saline (PBS) mit 1 mM MgCl2 und 0,1 mM CaCl2] durchgeführt werden. Die manuelle Aspiration mit einer Mikropipette kann durchgeführt werden, wenn keine schonende Vakuumaspiration verfügbar ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Oberflächenausdruck (Abbildung 2)
<ol><li>
Sekundäre Antikörperkennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren
	<ol>
<li>Einmal mit PBS+ waschen.</li>
		<li>Fixzellen durch Inkubation mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und 4% Saccharose in PBS für 7–8 min. HINWEIS: Im Gegensatz zu anderen Fixierungsmethoden wie der Methanolinkubisierung durchdringt PFA die Plasmamembran nicht und eignet sich daher für die Oberflächenexpressionsanalyse. Für optimale Ergebnisse verwenden Sie frisch zubereitetes PFA. Die kurzfristige Lagerung von PFA bei 4 °C oder eine Langzeitlagerung (bis zu 30 Tagen) bei -20 °C ist für eine angemessene Fixierung zulässig. ACHTUNG: PFA ist ein bekanntes Karzinogen. Verwenden Sie bei der Handhabung die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Schutzhaube.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen dreimal mit regulären PBS. HINWEIS: Alternativ kann 0,1 M Glycin zum Waschen von PFA anstelle von PBS verwendet werden, da Glycin alle verbleibenden Fixierungen, die den Hintergrund in der Zubereitung erhöhen können, abschrecken.</li>
		<li>Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie mit 10% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS für 30 min bei RT inkubieren. HINWEIS: Die Sperrzeit kann ohne nachteilige Auswirkungen auf die Etikettierung verlängert werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie mit fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird, um primäre Antikörper-markierte Rezeptoren (d. h. oberflächenausgedrückt) zu kennzeichnen. HINWEIS: In diesen Beispielen wurde eine 1:500 Verdünnung von Alexa 555-konjugierten Sekundärantikörpern verwendet: Ziegen-Anti-Kaninchen für GFP-markierte Rezeptoren und Ziegenantimaus für GluA1.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen mit PBS 3x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kennzeichnung von intrazellulären Rezeptoren
	<ol>
<li>Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min bei RT. HINWEIS: Um zu überprüfen, ob die anfängliche Runde der Antikörperkennzeichnung alle Oberflächenepitope einnimmt, kann dieser Permeabilisierungsschritt in einer Schwesterkultur übersprungen werden. In diesem Fall sollte kein Signal für intrazelluläre Rezeptoren erhalten werden. Um zu überprüfen, ob im vorherigen Abschnitt 2 keine internen Rezeptoren gekennzeichnet wurden (d. h. die Integrität der Plasmamembranen in der Kultur zeigen), kann der Permeabilisierungsschritt in einer Schwesterkultur übersprungen werden, und ein primärer Antikörper gegen intrazelluläres Protein (z. B. PSD-95 oder MAP2) kann in Schritt 2.2.1 verwendet werden. Unter diesen Bedingungen sollte kein Signal von diesem Primär erhalten werden. In diesem Fall wurde ein Kaninchen Anti-PSD-95 Antikörper (1:500) verwendet.</li>
		<li>Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.</li>
		<li>Etikettieren Sie intrazelluläre Rezeptoren durch Inkubation permeabilisierter Zellen mit demselben primären Antikörper, der in Abschnitt 2.2 verwendet wird, verdünnt in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT. HINWEIS: Die Antikörperverdünnung zur Kennzeichnung intrazellulärer Rezeptoren kann anders sein als die, die für die Kennzeichnung oberflächenausgedrückter Rezeptoren erforderlich ist. Im Beispiel von GluA1 wurde die gleiche Antikörperverdünnung (1:200) verwendet.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.</li>
		<li>Etikett mit zweitem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird. HINWEIS: In diesen Beispielen wurde eine 1:500 Verdünnung der Ziegenantimaus Alexa 647-konjugierten Sekundärantikörper (für GluA1) verwendet.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Internalisierung (Abbildung 3)
<ol><li>
Internalisierung von Antikörper-markierten Oberflächenrezeptoren
	<ol>
<li>Nach der Kennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren und Antikörperwäsche (Abschnitt 2.2) zellenin konditionierten Medien ohne Antikörper pflegen und an den Inkubator (37 °C) zurückgeben, um eine Internalisierung zu ermöglichen. HINWEIS: Für NMDA-Rezeptoren wird 30 min zur Internalisierung empfohlen. Als Kontrolle kann eine Schwesterkultur mit konditionierten Medien bei 4 °C während des Internalisierungsprozesses aufrechterhalten werden. Minimale Rezeptor-Internalisierung sollte unter diesen Bedingungen auftreten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren
	<ol>
<li>Einmal Zellen mit PBS+ waschen.</li>
		<li>Fix Zellen mit 4% PFA und 4% Saccharose in PBS für 7-8 min. ACHTUNG: Verwenden Sie beim Umgang mit PFA die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Schutzhaube.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit regulären PBS.</li>
		<li>Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT, um unspezifische Bindung zu verhindern.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben mit fluoreszierend markiertem sekundären Antikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wurde, um primäre Antikörper-markierte Rezeptoren (d. h. oberflächenausgedrückte Rezeptoren, die nicht internalisiert wurden) zu kennzeichnen. HINWEIS: In diesem Beispiel wurde Alexa 555-konjugierter Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kennzeichnung von internalisierten Rezeptoren
	<ol>
<li>Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min.</li>
		<li>Blockieren Sie unspezifische Bindung durch Inkubation mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben mit fluoreszierend markiertem sekundären Antikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird, um internalisierte Antikörper-markierte Rezeptoren zu kennzeichnen. HINWEIS: In diesem Beispiel wird Alexa 647-konjugierter Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Recycling (Abbildung 4)
<ol><li>
Internalisierung von Antikörper-markierten Oberflächenrezeptoren
	<ol>
<li>Nach der Kennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren und Antikörperwäsche (Abschnitt 2.2) zellenin konditionierten Medien ohne Antikörper pflegen und an den Inkubator (37 °C) zurückgeben, um eine Internalisierung zu ermöglichen. HINWEIS: Für NMDA-Rezeptoren wird 30 min zur Internalisierung empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blockierung stabiler Oberflächenexprimoren
	<ol>
<li>Um die Epitope des primären Antikörpers zu blockieren, der an oberflächenexprimierten Rezeptoren befestigt ist, die nicht internalisiert wurden, inkubieren Zellen mit unkonjugierten Fab-Anti-IgG-Antikörperfragmenten (gegen die in Abschnitt 2.2 verwendeten primär verwendeten) in konditionierten Medien ( 20 g/ml) für 20 min bei RT. Diese Behandlung verhindert zukünftige Wechselwirkungen mit sekundären Antikörpern. HINWEIS: Für dieses Beispiel wurden Ziegenanti-Kaninchen Fab-Fragmente verwendet. HINWEIS: Kontrollexperiment: Um sicherzustellen, dass eine vollständige Blockierung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren stattgefunden hat, können Schwesterabdeckungen mit und ohne Fab inkubiert werden. Kulturen sollten unmittelbar nach der Fab-Behandlung fixiert werden, und beide Kulturen werden mit Alexa 555-konjugiertem Sekundärantikörper inkubiert. Kein Alexa 555 Signal in den Fab-inkubierten Zellen weist auf eine ordnungsgemäße Antikörperblockierung hin.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit konditionierten Medien.</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen mit konditionierten Medien, die 80 M Dynasore enthalten, um eine weitere Internalisierung zu verhindern und Zellen in den Inkubator (37 °C) zurückbringen, um das Recycling von internalisierten Rezeptoren zu ermöglichen. Dynasore ist ein GTPase-Hemmer, der Dynamin hemmt und somit eine Internalisierung verhindert. HINWEIS: 45 min für NMDAR-Recycling wird empfohlen. Beachten Sie, dass Dynasore ausschließlich den dynaminabhängigen Internalisierungsprozess blockiert (z. B. NMDARs Internalisierung). Jedoch, Internalisierung von anderen synaptischen Protein (dynamin-unabhängig) kann immer noch in Gegenwart von Dynasore auftreten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kennzeichnung von recycelten Rezeptoren
	<ol>
<li>Einmal Zellen mit PBS+ waschen.</li>
		<li>Fix Zellen mit 4% PFA und 4% Saccharose in PBS für 7-8 min. ACHTUNG: Verwenden Sie beim Umgang mit PFA die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Schutzhaube.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.</li>
		<li>Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT, um unspezifische Bindung zu verhindern.</li>
		<li>Etikettzellen mit erstem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird. HINWEIS: Für dieses Beispiel wurde Alexa 555-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit PBS. HINWEIS: Längere Wässerungen mit PBS (5–10 min) können helfen, den Hintergrund in der Vorbereitung zu reduzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kennzeichnung von internalisierten Rezeptoren
	<ol>
<li>Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min.</li>
		<li>Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.</li>
		<li>Etikett mit zweitem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird. HINWEIS: Für dieses Beispiel wurde Alexa 647-konjugierter Ziegen-Antikaninchen-Antikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Montage und Bildgebung von Proben
<ol><li>Montieren Sie Zellen, indem Sie die Abdeckungslipsen-Zellseite vorsichtig auf 12–15 ml des entsprechenden Montagemediums nach unten legen. HINWEIS: Die Aspiration von überschüssigen Montagemedien wird die Qualität der Bilder verbessern.</li>
	<li>Bildzellen auf einem geeigneten konfokalen Mikroskop. HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Z-Stack bei 60-facher Vergrößerung mit 0,35 m Schritten abzubilden, der die gesamte Dicke des Neurons umfasst.</li>
</ol>7. Zeitüberlegungen
<ol><li>Dies ist ein langes Protokoll, das an mehreren Punkten angehalten werden kann. Wenn gewünscht, führen Sie Blockierungs- und Primärantikörperinkubationsschritte über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer durch.</li>
	<li>
Alternativ, wenn gewünscht, verwenden Sie einen Mikrowellen-Gewebeprozessor, um die Inkubationszeiten nach der Fixierung erheblich zu beschleunigen. Verwenden Sie für alle Schritte 150 W bei 30 °C für die "Ein"-Einstellungen.
	<ol>
<li>Um zu blockieren, führen Sie den Prozessor bei 2 min "Ein", 1 min "Aus" und 2 min "Ein".</li>
		<li>Führen Sie den Prozessor für primäre und sekundäre Antikörperinkubationsschritte bei 3 min "Ein", 2 min "Aus" und 3 min "Ein" aus. HINWEIS: Wir beobachten keinen Qualitätsunterschied, indem wir die oben genannten Änderungen am Protokoll vornehmen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Bildanalyse
<ol><li>Es wird empfohlen, FIJI <https://fiji.sc/> zu verwenden, um Bildanalysen durchzuführen, da sie mit mehreren Dateiformaten kompatibel sind. Für unsere Daten wurden Bilder im Nikon ND2-Dateiformat aufgenommen.</li>
	<li>Für die einfache Batch-Quantifizierung verschiedener Parameter, die von FIJI vorab ausgewählt wurden, wird ein Makroskript bereitgestellt. Die folgenden Schritte sind im Makro enthalten: HINWEIS: Für diese Beispiele wurde die "integrierte Intensität" gemessen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bilddateien in FIJI und separate Kanäle.</li>
	<li>Z-Projekt jedes Kanalstapels als maximale Intensitätsprojektion.</li>
	<li>Legen Sie einen niedrigeren Schwellenwert für jeden Kanal fest. HINWEIS: Für jeden experimentellen Datensatz sollten empirisch Schwellenwerte ermittelt werden. Obwohl jeder Kanal einen separaten niedrigeren Schwellenwert haben kann, ist es entscheidend, dass Kanalschwellenwerte für alle Bilder desselben Datensatzes konsistent beibehalten werden.</li>
	<li>Wählen Sie drei bis fünf sekundäre oder tertiäre Dendriten aus und speichern Sie sie als Interessengebiete (ROIs).</li>
	<li>Messen Sie die integrierte Dichte jedes ROI in Oberflächen- und intrazellulären Kanälen.</li>
	<li>Normalisieren Sie das Signal für jeden ROI, indem Sie den integrierten Dichtewert des Oberflächenkanals durch den intrazellulären Kanal dividieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Messungen für alle Kontroll- und Versuchsbilder und normalisieren Sie experimentelle Werte, um Werte (z. B. GluN2B WT oder No-Glycin-Bedingungen) zu steuern.</li>
</ol>

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<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067(2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Interaktion zwischen einer Zelle und ihrer Umgebung (z. B. Kommunikation mit anderen Zellen, Reaktion auf unterschiedliche Reize usw.) beruht stark auf der korrekten Expression von Rezeptoren an der Zelloberfläche. Die schnelle und fein abgestimmte Regulierung des oberflächenausgedrückten Rezeptorinhalts ermöglicht eine angemessene zelluläre Reaktion auf eine sich ständig verändernde Umgebung. Im besonderen Fall von Neuronen, Veränderungen in der Anzahl, Lokalisierung und Untereinheit Zusammensetzung der synaptisch e...

Zellen nutzen den aktiven Prozess des Menschenhandels, um Proteine zu bestimmten subzellulären Lokalisationen zu mobilisieren und eine strenge raumzeitliche Regulierung über ihre Funktion auszuüben1. Dieser Prozess ist besonders wichtig für Transmembran-Rezeptoren, da zelluläre Reaktionen auf verschiedene Umweltreize auf intrazellulären Kaskaden beruhen, die durch Dieoraktivierung ausgelöst werden. Zellen sind in der Lage, diese Reaktionen zu ändern, indem sie die Dichte, Lokalisierung und Zusammensetzung der Untereinheiten von Rezeptoren ändern, die an der Zelloberfläche über die subzelluläre HandelsverordnungdesRezeptors 2 ausgedrückt werden. Das Einsetzen von neu synthetisierten Rezeptoren in die Plasmamembran, zusammen mit Endozytose und Recycling bestehender Rezeptoren sind Beispiele für Menschenhandelsprozesse, die den Netzpool von oberflächenausgedrückten Rezeptoren bestimmen2. Viele molekulare Mechanismen arbeiten zusammen, um den Proteinhandel zu regulieren, einschließlich Protein-Protein-Wechselwirkungen und posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung, Ubiquitination oder Palmitoylierung2.
Die Regulierung des Rezeptorhandels ist insbesondere in stark polarisierten Zellen mit hochspezialisierten Strukturen erforderlich. Das paradigmatische Beispiel ist die Kontrolle der neuronalen Funktion durch regulierten Handel mit Glutamatrezeptoren (GluRs)3,4. Glutamat, der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter, bindet und aktiviert oberflächenexprimierte GluRs, um grundlegende physiologische neuronale Funktionen wie synaptische Neurotransmission und synaptische Plastizität zu steuern. Die Tatsache, dass veränderter GluR-Handel in einem breiten Spektrum von Neuropathien beobachtet wurde, von neuroentwicklungsbedingten Störungen bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen, unterstreicht die Bedeutung dieses Prozesses5. Daher ist das Verständnis der molekularen Ereignisse, die den GluR-Handel kontrollieren, in vielen Forschungsbereichen von Interesse.
In diesem Protokoll wird eine Antikörper-Fütterungsmethode verwendet, um den Gehalt an oberflächenausgedrückten GluRs in primären Hippocampus-Neuronen zu quantifizieren und zu bewerten, wie Veränderungen der Internalisierung und des Recyclings zur beobachteten Nettooberflächenexpression führen. Die Verwendung von Pharmakologie und/oder Überexpression von exogenen Rezeptoren mit spezifischen Mutationen macht dieses Protokoll zu einem besonders leistungsfähigen Ansatz für die Untersuchung molekularer Mechanismen, die der neuronalen Anpassung an verschiedene Umweltreize zugrunde liegen. Ein letztes Beispiel für den Nutzen dieses Protokolls ist die Untersuchung, wie sich multifaktorielle Veränderungen in der Umwelt (z. B. bei Krankheitsmodellen) durch die Untersuchung der Oberflächenexpression in solchen Modellen auf den GluR-Handel auswirkt.
Anhand spezifischer Beispiele wird zunächst demonstriert, wie eine pharmakologische Manipulation, die physiologische synaptische Stimulation imitiert [chemische LTP (cLTP)] die Oberflächenexpression der endogenen GluA1-Untereinheit des AMPA-Typs von GluRs (AMPARs) erhöht. 6. Der Handel mit einer überexprimierten phospho-mimetischen Form der GluN2B-Untereinheit von GluRs (NMDARs) vom Typ NMDA wird ebenfalls analysiert, um zu veranschaulichen, wie dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Regulierung des GluR-Handels durch spezifische posttranslationale Änderungen. Obwohl diese spezifischen Beispiele verwendet werden, kann dieses Protokoll leicht auf andere GluRs und andere Rezeptoren und Proteine angewendet werden, die antigene extrazelluläre Domänen besitzen. Für den Fall, dass keine Antikörper für extrazelluläre Domänen verfügbar sind, können Überexpression von extrazellulären Epitop-Tags (z. B. Flag-, Myc-, GFP-taggt, etc.) Proteine bei der Proteinkennzeichnung helfen.
Das aktuelle Protokoll enthält Anweisungen zur Quantifizierung der spezifischen GluR-Subtypdichte und des Menschenhandels mit spezifischen Antikörpern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um 1) die gesamte GluR-Oberflächenexpression, 2) GluR-Internalisierung und 3) GluR-Recycling zu untersuchen. Um jeden Prozess einzeln zu studieren, wird empfohlen, mit den Abschnitten 1 und 2 zu beginnen und entweder mit Abschnitt 3, 4 oder 5 fortzufahren. In allen Fällen mit den Abschnitten 6 und 8 beenden (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td>18 mm Ø #1,5 dicke Deckgläser</td><td>Neuvitro</td><td>GG181.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-konjugierte Ziegen gegen Maus</td><td>sekundär Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-konjugierte Ziegen gegen Kaninchen sekundär</td><td>Life Technologies</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-konjugierte Ziegen gegen Maus</td><td>sekundär Life Technologies</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärwaffe</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Zellkulturplatten mit flachem Boden</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Dynasore</td><td>Tocris</td><td>2897</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Tocris</td><td>0219</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Fab Fragmente</td><td>Sigma</td><td>SAB3700970</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-GluA1-Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB2263</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Media</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Abcam</td><td>Ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pelco BioWave</td><td>Ted Pella</td><td>36500</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Tocris</td><td>1128</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-GFP-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-PSD-95 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>2507</td><td></td></tr><tr><td>Strychnin</td><td>Tocris</td><td>2785</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

ein antikörper-fütterungsansatz zur untersuchung des schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären hippocampuskulturen

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Zelluläre Reaktionen auf äußere Reize hängen stark von der Reihe von Rezeptoren ab, die zu einem bestimmten Zeitpunkt an der Zelloberfläche ausgedrückt werden. Dementsprechend passt sich die Population der oberflächenausgedrückten Rezeptoren ständig an und unterliegt strengen Regulationsmechanismen. Das paradigmatische Beispiel und eines der am meisten untersuchten Handelsereignisse in der Biologie ist die regulierte Kontrolle der synaptischen Expression von Glutamatrezeptoren (GluRs). GluRs vermitteln die überwiegende Mehrheit der exzitatorischen Neurotransmission im zentralen Nervensystem und steuern physiologische aktivitätsabhängige funktionelle und strukturelle Veränderungen auf synaptischer und neuronaler Ebene (z. B. synaptische Plastizität). Veränderungen in der Anzahl, Lage und UntereinheitZusammensetzung der Oberfläche ausgedrückt GluRs tief beeinflussen neuronale Funktion und in der Tat, Veränderungen in diesen Faktoren sind mit verschiedenen Neuropathien verbunden. Präsentiert hier ist eine Methode zur Untersuchung des GluR-Handels mit dissoziierten Hippocampus-Primärneuronen. Ein "Antikörper-Feeding"-Ansatz wird verwendet, um GluR-Populationen, die an der Oberfläche und den inneren Membranen ausgedrückt werden, differenziell zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren auf lebenden Zellen und deren Fixierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten, um Rezeptoren-Endozytose und/oder Recycling zu ermöglichen, können diese Handelsprozesse evaluiert und selektiv untersucht werden. Dies ist ein vielseitiges Protokoll, das in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen oder Überexpression veränderter Rezeptoren verwendet werden kann, um wertvolle Informationen über Reize und molekulare Mechanismen zu gewinnen, die den GluR-Handel beeinflussen. In ähnlicher Weise kann es leicht angepasst werden, um andere Rezeptoren oder oberflächenausgedrückte Proteine zu untersuchen.

Dieses Protokoll zur Untersuchung des Schmieramrezeptorhandels basiert auf der Differentialkennzeichnung von Rezeptoren, die an der Zelloberfläche ausgedrückt werden, und solchen, die in internen Membranen ausgedrückt werden. Die Segregation wird durch die Kennzeichnung der Rezeptoren vor und nach der Membranpermeabilisierung unter Verwendung desselben primären Antikörpers, aber eines sekundären Antikörpers, der mit einem anderen Fluorophor konjugiert ist, erreicht. Wie in den optionalen ...

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels (GluR) in dissoziierten primären Hippocampuskulturen vor. Mit einem Antikörper-Fütterungsansatz zur Kennzeichnung endogenes oder überexprimierter Rezeptoren in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen ermöglicht diese Methode die Identifizierung molekularer Mechanismen zur Regulierung der GluR-Oberflächenexpression durch Modulation Internalisierungs- oder Recyclingprozesse.

Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Zelluläre Reaktionen auf äußere Reize hängen stark von der Menge an Proteinen ab, die in einem bestimmten Moment auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Dementsprechend werden die Anzahl, die subzelluläre Lokalisierung und die Zusammensetzung dieser Proteine dynamisch gesteuert. Hier werden wir einen Antikörper-Fütterungsansatz verwenden, um den Gehalt an oberflächenausgedrückten Rezeptoren in Zellkulturen zu quantifizieren, solange die Internalisierung und das Recycling wieder aufgenommen werden.Dies ist ein sehr vielseitiges Protokoll, das mechanistische Informationen über die Regulierung von oberflächenausgedrückten Proteinen liefert. In unserem Beispiel werden wir Glutaminrezeptoren in primären Hippocampus-Neuronen untersuchen. Dieses Protokoll kann an jedes Protein angepasst werden, das ein anagenes extrazelluläres Epitop besitzt, wenn Antikörper nicht verfügbar sind, kann die Transvtion von markierten Konstrukten sowohl für die Kennzeichnung als auch für das Studium spezifischer Mutationen nützlich sein.In unseren Beispielen verwenden wir Antikörper gegen endogenes GluA1 und mit Glu12 B.To dieses Verfahren zu beginnen, die Abdeckung rutscht Zellseite bis zu einem Paraffinfilm bedeckt Tablett, reagenzien zu speichern, und Manipulation zu erleichtern. Speichern und pflegen Sie konditionierte Medien bei 37 Grad Celsius für Inkubations- und Waschschritte. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern, die in konditionierten Medien bei Raumtemperatur 15 Minuten verdünnt werden.Danach verwenden Sie eine Vakuumpipette, um den medienhaltigen Antikörper sorgfältig abzusaugen und die Zellen dreimal mit konditionierten Medien zu waschen. Wenn die Untersuchung der Oberflächen- und intrazellulären Rezeptorexpression die Zellen nach diesem Schritt mit Paraformaldehyd fixieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Pflegen Sie die Zellen in konditionierten Medien ohne Antikörper, und geben Sie sie bei 37 Grad Celsius an den Inkubator zurück, um eine Internalisierung zu ermöglichen.Wenn Sie den Internalisierungsprozess untersuchen, fixieren Sie die Zellen nach diesem Schritt mit Paraformaldehyd, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Epitope auf dem primären Antikörper zu blockieren, der an der Oberfläche exprimierte Rezeptoren, die nicht internalisiert wurden, inkubieren Zellen mit unkonjugierten Fab Anti-IgG Antikörperfragmente in konditionierten Medien verdünnt, für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Danach die Zellen dreimal mit konditionierten Medien waschen.Inkubieren Sie die gewaschenen Brunnen mit konditionierten Medien, die 80 Mikromolar Dynasore enthalten, bei 37 Grad Celsius, um das Recycling von internalisierten Rezeptoren zu ermöglichen. Nach Abschluss der Modifikationen an lebenden Zellen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS plus. Fügen Sie den Zellen eine Lösung von 4% Paraformaldehyd und 4%Saccharose in PBS hinzu und in einer Dunstabzugshaube bei Raumtemperatur sieben bis acht Minuten zu brüten, um die Zellen zu fixieren.Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit regelmäßigen PBS. Fügen Sie den Zellen eine Lösung von 10% Normal Goat Serum in PBS hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszierend markiertem sekundären Antikörper, der in 3%NGS in PBS bei Raumtemperatur für eine Stunde verdünnt wird, um primäre Antikörper-Label-Rezeptoren zu kennzeichnen.Danach die Zellen dreimal mit PBS waschen. Um mit der Etikettierung der intrazellulären Rezeptoren zu beginnen, fügen Sie eine Lösung von 0,25%TritonX in PBS hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für fünf bis zehn Minuten, um die Zellen zu permeabilisieren. Dann mit 10%NGS bei Raumtemperatur für 30 Minuten blockieren.Wenn Sie Oberfläche im Vergleich zur Gesamtmenge untersuchen, inkubieren Sie die Zellen mit dem gleichen primären Antikörper, der zuvor verwendet wurde, verdünnt mit 3%NGS in PBS, bei Raumtemperatur für eine Stunde, um die intrazellulären Rezeptoren zu kennzeichnen. Als nächstes waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Etikett mit zweitem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, verdünnt in 3%NGS in PBS, bei Raumtemperatur für eine Stunde.Danach waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Legen Sie zunächst die Abdeckungsrutschen, Zellseite nach unten, auf 12 bis 15 Mikroliter des entsprechenden Montagemediums, um die Zellen zu montieren. Dann stellen Sie die Zellen auf dem entsprechenden konfokalen Mikroskop ab, und analysieren Sie die Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben.Dieses Protokoll zur Untersuchung des Schmieramatrezeptorhandels basiert auf der Differenzkennzeichnung von Rezeptoren, die an der Zelloberfläche ausgedrückt werden, und solchen, die in internen Membranen ausgedrückt werden. Nach dem Erfassen konfokaler Bilder kann das fluoreszierende Signal leicht quantifiziert werden, um eine Zunahme der Oberflächenexpression im Verhältnis zur intrazellulären Population nach chemischer LTP zu zeigen. In nicht permeabilisierten Zellen kann kein Signal für PSD-95 empfangen werden, was die Integrität der Plasmamembran demonstriert.Dies deutet darauf hin, dass das für die Oberfläche GluA1 erhaltene Signal tatsächlich oberflächenausgedrückten Rezeptoren entspricht. Wichtig ist, dass ein minimales Signal für internalisiertegluA1 unter Nicht-Permeabilisierungsbedingungen beobachtet werden kann, was zeigt, dass alle Oberflächenepitope durch die anfängliche Runde der Antikörperkennzeichnung belegt sind. Rezeptoren, die verinnerlicht wurden, werden dann identifiziert.Dieses Beispiel zeigt, dass GluN2B-Phosphorylierung bei S1480 die Verinnerlichen von Rezeptoren fördert. Da die phosphomimetische Mutante S1480E ein viel höheres Internalisierungsverhältnis im Vergleich zu Wildtyp-Rezeptoren zeigte. Wie erwartet, wird kein Signal für internalisierte Rezeptoren in der Steuerung erhalten.Als nächstes werden recycelte Rezeptoren und internalisierte Rezeptoren identifiziert. Das erzeugte Recyclingverhältnis zeigt, dass GluN2B S1480E keinen Einfluss auf das NMDAR-Recycling hat. Bei der Steuerung kann bei der Oberfläche, die GluN2B in Abwesenheit einer Fab-Blockierung ausdrückt, ein starkes Signal beobachtet werden.Dieses Signal verschwindet in Fab-behandelten Kulturen, was zeigt, dass das Blockierungsprotokoll ausreicht, um die oberflächenausgedrückten Epitope vollständig zu blockieren, und dass die nach dem Recycling beobachteten Oberflächensignale tatsächlich Rezeptoren entsprechen, die an die Plasmamembran zurückgeführt werden. Das aktuelle Protokoll ist nur eine der Methoden, die zur Untersuchung der Regulierung von oberflächenausgedrückten Proteinen zur Verfügung stehen. Es können andere Ansätze zur Erweiterung oder Überprüfung der hier erhaltenen Daten ergriffen werden.Dazu gehören biochemische Methoden, wie Biotinylierung, Lebensbildgebungstechniken oder funktionelle Ansätze wie Elektrophysiologie oder Kalziumbildgebung. Wir verwenden PFA, um die Lokalisation von Rezeptoren einzufrieren, aber PFA ist ein bekanntes Karzinogen, daher ist es wichtig, Schritte mit PFA unter einer Dunstabzugshaube durchzuführen, während entsprechende PSA getragen wird.

an-antibody-feeding-approach-to-study-glutamate-receptor-trafficking

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt einen Antikörper-Fütterungsansatz, um den Transport von Glutamatrezeptoren in primären neuronalen Kulturen im Hippocampus zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht die Beobachtung von Rezeptorpopulationen sowohl an der Plasmamembran als auch an der inneren Membran. Die Unterscheidung zwischen diesen Untergruppen wird durch die Markierung der Rezeptoren vor und nach der Membranpermeabilisierung erreicht, wobei derselbe Primärantikörper, aber Sekundärantikörper verwendet werden,...

Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung des Glutamatrezeptor-Handels in Hippocampus-Neuronen

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Hier zeigen wir die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff Alexa gekoppelt α-Bungarotoxin an GABA A-Rezeptor-Oberflächenlokalisierung und Endozytose in hippocampalen Neuronen zu messen. Durch die Verwendung von Konstrukten, die mit einem kurzen extrazellulären Tag, das α-Bungarotoxin, kann die Analyse der Plasma-Membran-Protein endozytischen Handel erreicht werden, bindet.

Mit Hilfe eines α-Bungarotoxin Binding Site Tag an GABA A-Rezeptor-Membranlokalisierung und Handel Studieren

Die molekularen Mechanismen, die während der Ontogenese koordinieren die Bildung von inhibitorischen GABAergen Synapsen sind weitgehend unbekannt. Um diese Prozesse zu untersuchen, haben wir eine Co-Kultur-Modellsystem, das embryonale mittelgroßen Projektions GABAergen Neuronen zusammen mit stabil transfizierten humanen embryonalen Nieren-293 (HEK293-Zellen) exprimieren funktionellen GABA-A-Rezeptoren enthält, kultiviert entwickelt.

Hemmende Synapse Formation in einer Co-Kultur Modell mit GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA A Receptors

Kulturen mit niedriger Dichte von primären hippokampalen Neuronen benötigen normalerweise eine Glia-Feeder-Schicht, um neurotrophe Faktoren zu liefern und die Langlebigkeit zu erhalten. Wir beschreiben hier eine vereinfachte Methode zur Kultivierung von Neuronen mit extrem niedriger Dichte auf Glasdeckgläsern in Gegenwart einer neuronalen Feeder-Schicht mit hoher Dichte, die die Untersuchung spezifischer neuronal-autonomer Mechanismen erleichtert.

Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Dieser Artikel zeigt, wie die Expression von Neurotransmitterrezeptoren quantifiziert und das Muster an Synapsen mit identifizierten prä- und postsynaptischen Elementen analysiert werden kann, indem eine Kombination aus viraler Transduktion optogenetischer Werkzeuge und der Freeze-Fracture-Replica-Immunmarkierungstechnik verwendet wird.

Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

Hier beschreiben wir die Setup - Software Navigation, und die Datenanalyse für eine räumlich und zeitlich genaue Methode der tonischen und phasische extrazellulären Glutamat Veränderungen in vivo Messung unter Verwendung von enzymgekoppelten Mikroelektrodenarrays (MEA).

Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

Neuronale Erregbarkeit kann durch einen dynamischen Prozess der Endo- und Exozytose von exzitatorischen Ionotropic Glutamat-Rezeptoren moduliert werden. Hier beschriebenen ist ein leicht zugängliche, High-Content Assay zur Quantifizierung der Oberfläche und interne Rezeptor Bevölkerung Pools.

Ein High-Content-Assay für die Überwachung der AMPA Rezeptor Menschenhandel

Autoimmunenzephalitis ist eine neue Kategorie von Antikörper-vermittelten Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Hippocampus-Neuronen können verwendet werden, um diese Antikörper zu entdecken und zu charakterisieren. Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die primäre Zellkultur und Immunfärbung zur Bestimmung von Autoantikörpern im Serum und in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten.

Hippocampus-neuronale Kulturen zum Nachweis und zur Untersuchung neuer pathogener Antikörper, die an der Autoimmunenzephalitis beteiligt sind

Erfahren Sie den Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung von Glutamatrezeptor-Trafficking in primären Hippocampus-Kulturen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Oberflächenrezeptoren und deren Internalisierung.

Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

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