Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Dieses Protokoll ermöglicht es Ihnen, eine große Anzahl von funktionellen antigenspezifischen T-Zellen zu generieren, die ein gewünschter sicherer Ansatz bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie Ihnen einen hocheffizienten Transduktionsprozess und eine große Anzahl funktioneller T-Zellen bietet. Diese Technik kann erweitert werden, um Typ-1-Diabetes und andere Autoimmunerkrankungen zu behandeln, bei denen Antigene bekannt sind.

Darüber hinaus können CAR-T-Zellen eine vielversprechende Behandlung für bestimmte Krebsarten sein. Diese Methode kann verwendet werden, um Immunzellen zu erzeugen, die andere CARs exemitzen. Es ist wichtig, eine gute akzeptierte Technik zu haben, das gesamte Protokoll zu lesen und das gesamte Experiment im Voraus zu planen.

Dieses zweiwöchige Protokoll enthält Minischritte und der Erfolg hängt von der ordnungsgemäßen Leistung jedes Schritts ab. Visuelle Demonstrationen dieser Methode sind für die korrekte Befolgung der Lernenden von entscheidender Bedeutung. Bereiten Sie Phoenix-Zellen für die Transfektion vor, wie im Manuskript beschrieben.

Es ist eine gute Praxis, die Seitenwand zu markieren, wo Medium hinzugefügt und entfernt wird, um das Abblasen von Zellen zu minimieren. Am Tag Null den Überstand aus den Zellen aspirieren und mit fünf Millilitern PBS waschen. Sieben Milliliter reduziertes Serum mittels Tropfen an die Seitenwand der Platte geben und die Zellen zurück in den Inkubator übertragen.

Fügen Sie 1,5 Milliliter reduziertes Serummedium zu zwei 14 Millimeter runden unteren Polypropylen-Rohren hinzu. Fügen Sie 40 Mikrometer Transfektionsreagenz in eines der Röhrchen und 15 Mikrogramm Antikörper umgeleitet CAR Plasmid zusammen mit fünf Mikrogramm Verpackung Plasmid auf die andere. Inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für fünf Minuten und fügen Sie dann Transfektionsreagenz in das Plasmidrohr.

Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie dreimal nach oben und unten pfeifen, und bebrüten Sie sie bei Raumtemperatur für mindestens 20 Minuten. Fügen Sie drei Milliliter der Mischung zu den Phoenix-Zellen hinzu und legen Sie sie in einen Gewebekultur-Inkubator. Nach vier bis fünf Stunden einen Milliliter FCS in die Zellen geben und sie über Nacht bei 37 Grad Celsius kulturieren.

Am nächsten Tag den Überstand aus den Zellen entfernen und vier Milliliter frisches vorgewärmtes Kulturmedium hinzufügen. Ernten Sie das Virus am zweiten Tag, indem Sie das Virus, das Medium enthält, aus den Phoenix-Zellen sammeln und filtern, um Restzellablagerungen zu entfernen. Fügen Sie dem Virus rekombinanten menschlichen IL-2-Bestand für eine Endkonzentration von 200 internationalen Einheiten pro Milliliter hinzu und verwenden Sie es sofort für die Transduktion.

Fügen Sie vier Milliliter frisches Medium zu den Phoenix-Zellen hinzu und legen Sie sie über Nacht in den Inkubator. Wiederholen Sie die Virussammlung am nächsten Tag für eine zweite Transduktion und entsorgen Sie die Zellen. Einen Tag vor dem Aussaat murine CD8 T-Zellen, fügen Sie einen Milliliter einer Mischung aus Anti-Maus-CD3 und CD28-Antikörper n.Äns-Körper einer 24-Well-Platte hinzu und brüten die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am Tag Null, Ernten Maus Milz und legen Sie sie auf einem Zellsieb einweichen in 10 Milliliter PBS in einer Zellkulturschale auf Eis. Schneiden Sie in einer Zellkulturhaube jede Milz in drei bis fünf Teile und drücken Sie das Gewebe mit einem sterilen Kolben einer Spritze durch das Drahtgeflecht. Entfernen Sie vorsichtig rote Blutkörperchen, indem Sie Splenozyten in einem bis vier verdünnten Red-Zell-Lysepuffer wieder aufhängen und sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubieren und dann 10 Mikroliter der Zellsuspension mit Trypan Blue für die Zellzählung verdünnen.

Und pellet den Rest der Zellen durch Zentrifugieren bei 350 mal g für sieben Minuten. Verwenden Sie ein Maus-CD8-T-Zell-Isolationskit, um CD8-T-Zellen anzureichern und die Zellpellets in 400 Mikroliter Puffer mit 100 Mikroliter Biotin-Antikörper-Cocktail pro mal 10 bis zur achten Zelle aufzuhängen. Mischen Sie die Zellsuspension gut und inkubieren Sie sie für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um eine Antikörperbindung zu ermöglichen.

Dann fügen Sie 300 Mikroliter Etikettierpuffer und 200 Mikroliter Anti-Biotin MicroBeads pro mal 10 zu den achten Zellen hinzu. Gut mischen und weitere 10 Minuten bei vier Grad Celsius bebrüten. In der Zwischenzeit eine Trennsäule auf dem Separator einrichten und mit drei Millilitern Etikettierpuffer waschen.

Legen Sie ein 40-Mikrometer-Zellsieb auf die Oberseite einer Säule und geben Sie einen Milliliter der Perlen- und Zellmischung durch das Sieb in die Trennsäule. Sammeln Sie den Durchfluss in ein vorgechilltes 15-Milliliter-Rohr und waschen Sie die Säule entsprechend den Anweisungen des Herstellers, indem Sie Abwässer in das gleiche Rohr sammeln. Zählen Sie die Zellen und sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 350 mal g für fünf Minuten.

Waschen Sie sie mit zwei Millilitertduden t-Zellmedium und Zentrifuge erneut. Dann setzen Sie sie in vorgewärmten T-Zellmedium in einer Konzentration von 250, 000 bis 500, 000 Zellen pro Milliliter. Waschen Sie die zuvor vorbereiteten CD3- und CD28-Antikörper-beschichteten Platten dreimal mit einem Milliliter sterilem PBS und fügen Sie jedem Brunnen zwei Milliliter der Zellsuspension hinzu.

Verwenden Sie eine wirbelnde Bewegung, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Zur Steuerung die gleiche Anzahl von CD8-T-Zellen in einen einzigen nicht beschichteten Brunnen der Platte zu geben und die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem 10%igen Kohlendioxid-Gastank-Inkubator zu brüten. Bereiten Sie am ersten Tag menschliche Fibronectin-Fragment-beschichtete Platten vor, indem Sie 0,5 Milliliter Fibronectin in die Brunnen einer 24-Well-Platte geben und sie über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten.

Am nächsten Tag entfernen Sie die Fibronectin-Lösung und fügen Sie einen Milliliter 2%BSA und PBS pro Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten und waschen Sie die behandelten Brunnen mit einem Milliliter sterilen PBS. Die Platte ist nach dem Entfernen der Waschlösung einsatzbereit.

Zählen Sie die aktivierten CD8 T-Zellen mit Trypan Blue. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation. Und setzen sie bei fünf Millionen lebensfähigen Zellen pro Milliliter für die Transduktion aus.

Fügen Sie 100 Mikroliter der aktivierten CD8-Zellsuspension zu jedem Brunnen der Fibronectin-beschichteten Platte hinzu. Dann 1,5 bis zwei Milliliter des zuvor vorbereiteten Virus mit Medium hinzufügen und mit einer wirbelnden Bewegung mischen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Versiegeln Sie die Platte in einem Ziploc-Beutel und zentrieren Sie sie bei 2.000 mal g für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge und bringen Sie sie in einen biologischen Sicherheitsschrank. Entfernen Sie vorsichtig die Plastiktüte und stellen Sie sicher, dass die Außenseite der Platte nicht mit Medium kontaminiert ist. Übertragen Sie die Platte auf einen 37 Grad Celsius Kohlendioxid-Inkubator.

Nach vier Stunden einen Milliliter Medium aus jedem Brunnen entfernen, durch einen Milliliter vorgewärmten kompletten T-Zellmedium ersetzen und die Platte wieder in den Inkubator legen. Die kritischen Aspekte dieses Protokolls sind ein High Titer Virus, gesunde aktivierte T-Zellen und die entsprechende Transduktionsmethode. Die Zellen wurden mit PE-Größe sieben konjugiert Anti-CD8, AF647 konjugierte Anti-CD3 und BV 421 konjugierte Anti-CD28 für Strömung zytometrische Analyse.

Ungefähr 70% der CD8-T-Zellen ko-exprimiert GFP, die CAR-Expression anzeigt. Sie drückten auch CD28 und CD3 aus. Wichtig ist, dass alle GFP-positiven Testzellen auch mit I-Ag7 Insulin BR3 Tetrameren ko-gefärbt werden, was auf die Expression von CAR auf der Zelloberfläche, aber nicht mit dem Kontrolltetramer hinweist.

Darüber hinaus sezernierten die sortierten TEST- und Kontroll-CAR-T-Zellen jeweils hohe Interferon-Gamma-Werte erst nach Kokultur mit Zielzellen, die ihre Cognate-Ninenden exdrückten, was bestätigt, dass die transducierten Zellen einen CD8-Effektor T-Zell-Phänotyp haben, der auf das Ziel der übergeordneten Antikörper gerichtet ist. Die Transduktion von Virus-Produzentenzellen, die Isolierung von primären CD8-T-Zellen und die Aktivierung dieser T-Zellen sind die wichtigsten Schritte dieses Experiments. Eine gesunde Aktivierung der T-Zellen und die Transduktion dieser T-Zellen mit geeigneten Reagenzien sorgen für günstige Ergebnisse.

Diese Methode kann verwendet werden, um andere T-Zellen zu transduzieren, muss jedoch für den spezifischen T-Zelltyp angepasst werden. Dieses Protokoll ebnet den Weg für die Prävention von Typ-1-Diabetes mit antigenspezifischer chimer Antigenrezeptor-T-Zelltherapie.