Hierarchische und programmierbare Ein-Topf-Oligosaccharid-Synthese
6. September 2019
Dieses Protokoll zeigt, wie die Auto-CHO-Software für die hierarchische und programmierbare Ein-Topf-Synthese von Oligosacchariden verwendet wird. Es beschreibt auch das allgemeine Verfahren für RRV-Bestimmungsexperimente und Ein-Topf-Glykosylierung von SSEA-4.
Wir zeigen, wie wir unsere neu entwickelte Software Auto-CHO für die hierarchische und programmierbare Ein-Topf-Oligosaccharid-Synthese einsetzen. Auto-CHO enthält Algorithmen für erweiterte Bausteine, wobei relative Reaktivitätswerte durch maschinelles Lernen vorhergesagt werden. Die Auto-CHO-Software bietet eine wertvolle Richtlinie für die Auswahl von Bausteinen und eine hierarchische Blaupause für die mehrfache Ein-Topf-Synthese komplexerer Glykane durch Fragmentzusammensetzung.
Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Krebs oder Infektionskrankheiten durch kohlenhydratbasierte Therapeutika. Bevor Sie Auto-CHO verwenden, stellen Sie bitte sicher, dass die Java Runtime Environment in einem PC oder Mac installiert ist. Die visuelle Demonstration der Auto-CHO-Softwaremanipulation und das damit verbundene Reaktivitätswert-Bestimmungsexperiment wird Chemikern helfen, dem Protokoll zu folgen und das Experiment schnell fortzusetzen.
Um die Softwareinitialisierung der Java-Runtime-Umgebung durchzuführen, gehen Sie auf die Auto-CHO-Website und laden Sie die Software entsprechend dem Betriebssystem herunter. Derzeit unterstützt Auto-CHO Windows, macOS und Ubuntu. Das neueste PDF-Benutzerhandbuch finden Sie auf der Auto-CHO-Website.
Entpacken Sie für Windows-Benutzer das Auto-CHO Windows. und doppelklicken Sie auf Auto-CHO. im Auto-CHO Windows-Ordner, um das Programm zu starten.
Geben Sie die gewünschte Glykanstruktur ein. Wählen Sie aus, ob Sie eine Glykanstruktur zeichnen oder eine vorhandene Strukturdatei lesen möchten. Um durch Zeichnen einzugeben, klicken Sie auf Glycan bearbeiten von GlycanBuilder oder den Bereich, um hier zu klicken, um das synthetische Ziel zu bearbeiten, um die Abfragestruktur von GlycanBuilder zu zeichnen und zu bearbeiten.
Verknüpfungs- und Chiralitätsinformationen sollten nicht ignoriert werden. Klicken Sie auf die Schaltflächen Globo-H, SSEA-4 oder OligoLacNAc, um die Beispiele anzuzeigen. Schließen Sie den GlycanBuilder-Dialog, um die Bearbeitung abzuschließen.
Definieren Sie die Suchparameter auf der Registerkarte Parametereinstellungen, um vernünftige Suchergebnisse zu erhalten. Klicken Sie auf die Schaltfläche okay, um neue Einstellungen zu aktivieren. Die Standardeinstellung ist, nur die experimentelle Bibliothek zu durchsuchen.
Wenn es gewünscht ist, sowohl die experimentelle als auch die virtuelle Bibliothek zu durchsuchen, wählen Sie die Registerkarte virtuelle Bausteinbibliothek aus. Wählen Sie experimentelle und virtuelle Bibliotheken verwenden, und wenden Sie Filter an, um virtuelle Bausteine mit bestimmten Kriterien anzuzeigen. Experimentelle und virtuelle Bausteine können zusammenarbeiten, um die Suchfähigkeit von Auto-CHO zu verbessern.
Derzeit stellt Auto-CHO mehr als 50.000 virtuelle Bausteine mit vorhergesagten RRVs in der Bibliothek bereit. Überprüfen Sie einen oder mehrere gewünschte virtuelle Bausteine, die der Benutzer für die Suche verwenden möchte. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgewählte virtuelle Bausteine anzeigen, um nur die ausgewählten virtuellen Bausteine anzuzeigen.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Gefilterte virtuelle Bausteine anzeigen, um nur virtuelle Bausteine mit bestimmten vom Benutzer definierten Kriterien anzuzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle virtuellen Bausteine anzeigen, um alle verfügbaren virtuellen Bausteine anzuzeigen, und setzen Sie den Filter zurück. Wählen Sie die Registerkarte Abfragestruktur aus und klicken Sie auf die Schaltfläche "Suchbausteinbibliothek", um die synthetischen One-Pot-Lösungen für die Abfragestruktur zu finden.
Bestätigen Sie dann die Parametereinstellungen. Suchen Sie den Ergebnisbetrachter. Das Suchergebnis wird auf der Registerkarte Ergebnisvisualisierung angezeigt.
Die reduzierenden Endaktoren unterschiedlicher Rückstandsnummern werden in der reduzierenden Endannahmespalte angezeigt. Wählen Sie als Nächstes einen reduzierenden Endakzeptor aus. Lösungen werden in der Liste der synthetischen Lösungen angezeigt.
Fragmente werden in der Fragmentliste angezeigt, um zu suggerieren, wie viele Fragmente in der Synthese verwendet werden sollen. Das System liefert detaillierte Informationen über jedes Fragment, einschließlich des RRV des Fragments, der Rechenausbeute, sowie der, welche Schutzgruppe für die Verwendung des Fragments in der Ein-Topf-Reaktion degeschützt werden sollte. Die Bausteine, die zum Zusammenbau des ausgewählten Fragments verwendet werden, und die Fragmentverbindungsinformationen werden ebenfalls angezeigt.
Für experimentelle Bausteine, sehen und überprüfen Sie chemische Strukturen der ausgewählten Bausteine in der chemischen Struktur der Bausteinregion, und sehen Sie sich die detaillierten Informationen Baustein-Browser. Kombinieren Sie in einem 10-Milliliter-Rundkolben die beiden Thioglykosidspender, absolutes Methanol und Driedrit in DCM. Dann bei Raumtemperatur eine Stunde rühren.
Nehmen Sie ein 30-Mikroliter-Aliquot dieser Mischung und injizieren Sie das Gemisch in drei separate Injektionen in die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Messen Sie den Koeffizienten zwischen der Absorption und Konzentration des Spendermoleküls unter den basislinien getrennten Bedingungen. Fügen Sie eine Lösung von 0,5 Mol N-Iodosuccinimid in Acetonitril in das Reaktionsgemisch, gefolgt von Zugabe einer 0,1 moligen Trifluormethansulfonsäurelösung.
Rühren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Als nächstes verdünnen Sie die Reaktionsmischung mit vier Millilitern DCM. Filtern und waschen Sie die Reaktion mit gesättigtem wässrigem Natriumthiosulfat, das 10% Natriumhydrogencarbonat enthält.
Jetzt extrahieren Sie die wässrige Schicht dreimal mit fünf Milliliter DCM. Kombinieren Sie alle organischen Schichten und waschen Sie mit fünf Milliliter Sole. Anschließend trocknen Sie die kombinierten Schichten mit ca. 200 Milligramm wasserfreiem Magnesiumsulfat.
Schütteln Sie die Mischung 30 Sekunden lang mild und filtern Sie sie durch einen Trichter mit einem geriffelten Filterpapier, um das Magnesiumsulfat zu entfernen. Dann das Filtrat in einem 25-Milliliter runden Bodenkolben sammeln. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer.
Lösen Sie den Rückstand in einem Milliliter DCM auf. Nehmen Sie ein 30-Mikroliter-Aliquot dieser Mischung, und injizieren Sie es in Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie in drei separaten Injektionen. Messen Sie die Konzentrationen der verbleibenden Spender durch HPLC unter den gleichen Trennungsbedingungen.
Messen Sie die relative Reaktivität. Basierend auf dem relativen Reaktivitätswert von DR4 beträgt der relative Reaktivitätswert von DX1 drei. Das Auto-CHO-Suchergebnis basierend auf Denser-Parametereinstellungen gibt an, dass SSEA-4 durch eine Zwei-plus-eins plus drei-Ein-Topf-Reaktion synthetisiert werden kann.
Wenn ein trisaccharidreduzierender Endakzeptor ausgewählt ist, zeigt das Programm vier mögliche Lösungen für die Abfrage an. Die erste Lösung hat ein Fragment, und seine berechnete Ausbeute beträgt etwa 94%Das Fragment kann durch zwei Bausteine synthetisiert werden. Der RRV des ersten Disaccharid-Bausteins ist 1462 und der RRV des zweiten Monosaccharids 32,0.
Die chemische Struktur des ersten vorgeschlagenen Bausteins, der bei der Ein-Topf-Reaktion verwendet wird, wird ebenfalls gezeigt. Das Ein-Topf-Experiment zeigt, dass SSEA-4 durch diesen Vorschlag erfolgreich in 43% Ausbeute synthetisiert werden kann. SSEA-4 kann durch drei von Auto-CHO vorgeschlagene Einheiten synthetisiert werden.
Zu diesen Einheiten gehören Sileledisaccharid-Baustein eins, Monosaccharid-Baustein zwei und die Reduzierung des Endakzeptors drei. Für Parametereinstellungen empfehlen wir, Parameter mit strengeren Kriterien am Anfang festzulegen. Für die Auswahl der Bausteinbibliothek empfehlen wir, die experimentelle Bibliothek zunächst nur zu durchsuchen.
Durch diese Demonstration hoffen wir, dass wichtigere Glykane, wie tumorassoziierte Kohlenhydratantigene, durch den Ein-Topf-Ansatz für weitere Studien synthetisiert werden können. Nach diesem Verfahren kann die Synthese aller dieser Antigene durchgeführt werden, um kohlenhydratbasierte Krebsimpfstoffe zu entwickeln. Wir hoffen auch, dass künstliche Intelligenz und Computeralgorithmen die automatisierte Glykansynthese erleichtern können, um die Behandlung und Prävention von Krankheiten zu unterstützen.
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Übersicht
Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung der Auto-CHO-Software für die hierarchische und programmierbare Einschritt-Synthese von Oligosacchariden. Es beinhaltet eine visuelle Darstellung der Softwarebedienung und der RRV-Bestimmungsexperimente.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Synthese von Oligosacchariden
- Softwareentwicklung
- Anwendungen des maschinellen Lernens
Hintergrund
- Die Auto-CHO-Software unterstützt die Oligosaccharidsynthese.
- Algorithmen sagen relative Reaktivitätswerte mithilfe von maschinellem Lernen voraus.
- Es werden Richtlinien zur Auswahl von Bausteinen bereitgestellt.
- Auswirkungen für therapeutische Anwendungen bei Krebs und Infektionskrankheiten.
Zweck der Studie
- Die Funktionsweise der Auto-CHO-Software demonstrieren.
- Einen Protokollansatz für die Eintopf-Glykosylierung bereitstellen.
- Die Synthese komplexer Glykane durch Fragmentzusammensetzung erleichtern.
Verwendete Methoden
- Hierarchische Synthese von Oligosacchariden.
- Algorithmen des maschinellen Lernens zur Vorhersage von Reaktivitätswerten.
- Visuelle Demonstrationen der Softwareanwendung.
- Experimente zur Bestimmung des RRV.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Demonstration der Einschritt-Oligosaccharidsynthese.
- Effektive Leitlinien zur Auswahl der Bausteine.
- Klare visuelle Anleitungen für Chemiker.
- Hervorgehobene potenzielle therapeutische Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Die Auto-CHO-Software ist ein wertvolles Werkzeug für die Oligosaccharid-Synthese.
- Das maschinelle Lernen verbessert den Syntheseprozess.
- Das Protokoll ermöglicht eine schnelle Durchführung von Experimenten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die programmierbare Eintopf-Synthese von Oligosacchariden ermöglicht eine schnelle Herstellung komplexer Glykane zur Validierung therapeutischer Zielstrukturen und verkürzt so die Entwicklungszeiten für kohlenhydratbasierte Wirkstoffkandidaten. Die Auto-CHO-Software bietet eine vorhersagende Auswahl von Bausteinen und eine hierarchische Syntheseplanung, die eine mechanistische Risikominimierung in der frühen Entdeckungsphase unterstützt. Dieser Ansatz verbessert die Portfolio-Priorisierung, indem er das Vertrauen in die Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Glykanen vor Investitionen in die präklinische Phase erhöht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die schnelle Synthese definierter Glykanstrukturen wie SSEA-4 zur Validierung von Stammzellmarkern.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch die Herstellung homogener Oligosaccharidchargen für funktionelle Target-Validierungsassays.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Abbildung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen, um Glykan-Epitope mit therapeutischem Potenzial bei Krebs- und Infektionskrankheiten gezielt zu priorisieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte Glykanpräparationen, die für die Entwicklung von Kohlenhydrat-Mikroarrays und Bindungsassays geeignet sind.
- Quantitative Ausgaben: Liefert messbare Ausbeuten und Reinheitsprofile, die eine zuverlässige Untersuchung von Verbindungen gegenüber glykanbindenden Proteinen ermöglichen.
- Plattformwiederverwendung: Ermöglicht eine iterative Verbesserung von Bausteinsammlungen durch Nutzerfeedback zu virtuellen Bausteinen und verbessert so die langfristige Skalierbarkeit von Screening-Verfahren.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Die nachgewiesene Synthese von SSEA-4, einem Marker für pluripotente Stammzellen, unterstützt die Biomarker-Abstimmung in der regenerativen Medizin und der gezielten Bekämpfung von Krebsstammzellen.
- Translationale Kontinuität: Bietet einen Weg von der entdeckungsorientierten Synthese zur präklinischen Bewertung tumorassoziiierter Kohlenhydrat-Antigene für die Impfstoffentwicklung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die strukturbestimmte Herstellung von Glykanen, um Unklarheiten bei der immunologischen Wirksamkeits- und Sicherheitsbewertung zu verringern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie eine hypothesengetriebene Glykansynthese ermöglicht, zur Identifizierung von Leitstrukturen durch definierte antigene Strukturen beiträgt und die präklinische Validierung durch reproduzierbare Glykanproduktion unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die mechanistische Entlastung von Risiken, indem biosynthetische Wege geklärt und Glykan-Ziele durch definierte chemische Synthese validiert werden.
- Screening: Erzeugt assaysbereite Glykan-Panels mit quantifizierten Ausbeuten für das Hochdurchsatz-Screening von Glykan-Protein-Interaktionen.
- Analytik: Stellt relative Reaktivitätswerte und berechnete Ausbeuten als quantitative Messgrößen bereit, um die Effizienz synthetischer Routen zu vergleichen und den Erfolg vorherzusagen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht den Anschluss an präklinische Arbeiten durch die Synthese tumoriassoziiierter Kohlenhydrat-Antigene zur Bewertung von Impfstoffkandidaten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Kapazität durch die von Rückmeldungen gesteuerte, virtuelle Bibliothekserweiterung von Auto-CHO und reduziert so redundante Planung von Synthesen über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten bezüglich der Funktion von Glykanen verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Oligosaccharid-Herstellung durch standardisierte Ein-Schritt-Reaktionsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem eine schnelle Struktur-Wirkungs-Untersuchung ermöglicht wird und somit das Risiko biologischer Fehlschläge in späteren Entwicklungsstadien verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung glykanbasierter Kandidaten durch definierte Vorhersagen zur synthetischen Zugänglichkeit und Ausbeute.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kohlenhydratchemie und der Interpretation von Glykanstrukturen für eine effektive Auswahl der Bausteine.
- Benötigt Zugang zu HPLC und einer Standardinfrastruktur für die organische Synthese zur Bestimmung der RRV und Überwachung von Reaktionen.
- Setzt eine standardisierte Nomenklatur für Glykane und einheitliche Formate für strukturelle Eingabedaten über Teamgrenzen hinweg voraus, um konsistente Auto-CHO-Anfragen zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf nicht-thioglycosidische Bausteine oder alternative Schutzgruppenstrategien erweitert wird.
- Ist durch die Genauigkeit der maschinell gelernten, vorhergesagten RRVs für neue Bausteine begrenzt, weshalb eine experimentelle Validierung für Vorhersagen mit hoher Zuverlässigkeit erforderlich ist.
