Name: Anti-RDL und Anti-mGlutR1-Rezeptoren Antikörpertests in Honeybee Brain Sections mit CRISPR-Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie CRISPR-Cas9 zur Modifikation von GABAA- und metabotropen Glutamatrezeptoren im adulten Honigbienengehirn eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Lernen und Gedächtnis sowie die Validierung von Antikörperspezifität.

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Diese Arbeit wurde durch die folgenden Auszeichnungen an BHS: Human Frontiers Science Program unterstützt; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Ideas Lab (1556337). Die Peptid- und Antikörper für DmGluRA wurden im Labor Dr. Serge Birman (Marseille, Luminy, Frankreich) entwickelt, als IS vom Programm d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 von der Fondation pour la Recherche Medicale unterstützt wurde. Wir danken Daniela Junqueira Marosi und Alex Hanter von Integrated DNA Technology (IDT) für die Hilfe bei der Entwicklung von RDL-Guides und qPCR-Drop-off-Assays.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Charakterisierung des Anti-RDL und Anti-MGlutR1 Zuerst charakterisierten wir die Anti-RDL- und Anti-MGlutR1-Antikörper durch Immunoblot und Voradsorption auf den Scheiben fester Honigbienengehirne. Jeder Antikörper wurde gemacht, um alle seine bekannten Isoformen zu erkennen, und westliche Analysen zeigen, dass sie Bänder erkennen, die ihren vorhergesagten Molekulargewichten entsprechen. Als nächstes wurden beide Antikörper durch das konjugierte Peptid blockiert, gegen das sie auf Honigbienen-Gehirnabschnitten produziert wurden.
Eines der ersten Ziele unserer Studie war es festzustellen, dass die Antikörper, die gegen das spezifische konjugierte Peptid produziert werden, spezifisch für sein Protein im festen Gehirngewebe sind. Dazu haben wir das CRISPR-Cas9-System genutzt. Wir haben spezielle Leitfäden für Honigbienen RDL und mGlutR1 entworfen und jeweils für die Kennzeichnung von CRISPR-Cas9 mit der Leuchtstoffsonde ATTO550 verwendet. Für jeden Rezeptor injizierten wir eine Mischung aus drei verschiedenen CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteinen in die Ocelli, um die Menge des zielgerichteten Proteins im erwachsenen Honigbienenhirn zu reduzieren, indem wir das entsprechende Gen in Zellen eliminieren, die unser entworfenes Cas9-System aufgriffen. In unserer Studie haben wir diesen Schritt erreicht.
Einer der ersten entscheidenden Schritte für den Erfolg dieser Experimente ist die Entwicklung der entsprechenden Guide RNAs. Wir empfehlen, bis zu fünf Führungs-RNAs zu entwerfen, die sich am Anfang, in der Mitte und am Ende der Gensequenz befinden. In unserer Vorarbeit haben wir sie in verschiedenen Kombinationen an drei bis fünf Bienen getestet. Wir haben auch verschiedene Konzentrationen von Injektionen versucht, sowie Zeiten nach der Injektion, und verschiedene Mischungen von RNP in den Injektionen. Wir sezierten Gehirne und verarbeiteten sie mit Anti-RDL- und Anti-MGlutR1-Antikörpern. In diesen ersten Tests haben wir die geeignete Kombination, die Zeit nach der Injektion, sowie die Konzentration und Menge von CRISPR-Cas9 für die Injektion ermittelt. Diese ersten Tests waren die Grundlage für die Einrichtung der Experimente, die wir hier ausführlich beschrieben haben.
Das Ziel war zweifach: 1) in einer Bienen zu zeigen, dass unsere Antikörperfärbung nach der Behandlung mit CRISPR-Cas9 reduziert wurde und 2) um die besten experimentellen Bedingungen für Verhaltensstudien zu durcharbeiten. So zeigen wir, dass, wenn viele Zellkerne CRISPR-Cas9 48 h nach der Injektion enthalten, die Reduktion der Anti-RDL- und Anti-MGlutR1-Färbung signifikant ist. Darüber hinaus zeigt dies, dass die getesteten Antikörper das mGlut1- und RDL-Protein in der Honigbienen-Gehirnpräparation gezielt erkennen und für Lokalisierungsstudien im Honigbienenhirn verwendet werden können.
Experimentelle Einstellung CRISPR-Cas9 für Verhaltensstudien Als nächstes haben wir die Experimente so eingerichtet, dass CRISPR-Cas9 in Verhaltensstudien eingesetzt werden kann. Acht oder neun Honigbienen wurden für Kontroll- und Versuchsbehandlungen gesammelt. Sie wurden vor und nach der Injektion verhaltensauffällig getestet, und dann wurden ihre Gehirne für ATTO550 und/oder Immunzytochemie verarbeitet, um die Hirnregionen zu bestimmen, die eine Reduktion des Zielproteins zeigten. Hier ist zu beachten, daß die Anzahl der Bienen, die für eine Reihe von Experimenten genommen wurden, für die Kontroll- und Versuchsbedingungen auf nicht mehr als 8-9 Bienen begrenzt war. Auf diese Weise konnten beide Bedingungen am selben Tag getestet werden. Auch, sobald wir die CRISPR-Cas9 Mischungen für die Injektion vorbereitet haben, froren wir sie nie ein. Die CRISPR-Cas9 Mischung änderte sich nicht in der Potenz, wenn sie 3 Tage hintereinander verwendet und bei 4-8 °C gehalten wird. Wir haben es jedoch nicht nach 3 Tagen getestet.
Wie wir im Abschnitt Ergebnisse für beide Sätze experimenteller Injektionen und für beide Antikörper beschrieben haben, zeigten nur drei bienen von 16 getesteten Bienen eine große Verteilung ATTO550 im Pilzkörper, Protocerebrum und Antennenlappen. Bei allen anderen Bienen beschränkte sich die Verteilung von CRISPR-Cas9 auf den Pilzkörper, den zentralen Komplex und/oder das hintere Protocerebrum. Es ist wichtig, für alle Verhaltensstudien zu verstehen, dass mit dieser Injektionsmethode die Reduktion des Zielproteins nur auf den Pilzkörper in den meisten Bienen beschränkt wird. Es erstreckt sich nicht auf den Antennenlappen oder subösophagealen Ganglion. So ist die Injektionstechnik, die wir verwenden, geeignet, die Wirkung der Reduktion von Rezeptoren im Pilzkörper und zentralen Komplex in Verhaltensexperimenten zu studieren, während eine andere Methode der Einführung von CRISPR-Cas9 besser geeignet für die Untersuchung anderer Hirnregionen sein wird.
Abschließend zeigte unsere Studie die erfolgreiche Anwendung von CRISPR-Cas9 als Kontrolle für die Antikörperfärbung im Gehirn. Bei beiden Antikörpern (Anti-RDL und Anti-MGlutR1) wurde bei erfolgreicher Aufnahme von mGlutR1-CRISPR-Cas9 oder RDL-CRISPR-Cas9 auch die entsprechende Antikörperfärbung deutlich reduziert. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Injektion in die Ocelli zu einer Verteilung von CRISPR-Cas9 im Gehirn führte, die nicht homogen war. Die Verteilung reichte von einer minimalen Fläche, die den Ocelli- und Pilzkörper umgab, bis hin zu vielen Zellen im gesamten Gehirn. Die Variabilität der mGlutR1-oder RDL-CRISPR-Cas9-Aufnahme durch die Zellen war wahrscheinlich auf Variationen in den Injektionen zurückzuführen. Unsere Daten zeigen, dass das CRISPR-Cas9-System bei Honigbienen funktioniert, aber die Injektionsmethode muss verbessert werden, um die Variabilität der CRISPR-Cas9-Aufnahme in den einzelnen Bienengehirnen zu reduzieren. Innerhalb dieser Beschränkungen ist es nun möglich, diese Technik zu verwenden, um Gene bei erwachsenen Bienen für Verhaltensexperimente zu manipulieren.

Das kürzlich entdeckte CRISPR/Cas9-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet wurde, um genomische DNA in verschiedenen Modellsystemen und Organismen zu verändern. Es hat die biomedizinische Forschung und wichtige technologische Durchbrüche beschleunigt, indem es die Genommodifikation effizienter und robuster als frühere Methoden1gemacht hat. Das systemisch in S. pyogenes-Bakterien beheimatete System stützt sich auf eine Cas9-Endonuklease, deren Aktivität zu doppelsträngigen Brüchen (DSBs) in der DNA führt, und eine Guide-RNA (gRNA), die das Cas9-Protein an einen bestimmten, sequenzabhängigen Ort leitet2. Doppelsträngige Pausen, die von CRISPR/Cas9 erzeugt werden, können über nicht-homologe Endjoining (NHEJ) repariert werden, ein fehleranfälliger Prozess, der zu Frameshifts oder homologiedirekte Reparatur führen kann, wenn eine Spendervorlage vorhanden ist. Die gRNA selbst besteht aus einer zielspezifischen CRISPR RNA (crRNA) und einer universellen transaktivierenden crRNA (tracrRNA), die chemisch synthetisiert und mit gereinigtem Cas9-Nuklease als Ribonukleoproteinkomplex (RNP)2,3geliefert werden kann. Die fluoreszierende Kennzeichnung der gRNA- oder Cas9-Nuklease kann den Nachweis und die intrazelluläre Visualisierung molekularer Komponenten mittels fluoreszierender Mikroskopie4ermöglichen.
In unserer aktuellen Arbeit nutzen wir das CRISPR-Cas9-System, um den Proteingehalt in erwachsenen Honigbienengehirnen zu reduzieren. Wir untersuchten den metabotropen Glutamatrezeptor (mGluR) und Anti-MGlutR1-Rezeptor-Antikörper und die GABA-A-Rezeptor-Untereinheit RDL und Anti-RDL-Antikörper. Wir entwickelten eine einfache Methode, um die Menge an Protein im Gehirn der erwachsenen Honigbiene zu reduzieren und nutzten sie, um zusätzliche Tests der Antikörper zu fördern, die gegen die entsprechenden Proteine entwickelt wurden. Die Überwachung der Fluoreszenz von CRISPR-Cas9 ermöglichte es uns, die Bereiche und Zellen zu schätzen, die an der Reduktion des Proteins beteiligt sind.
Mit dieser Methode charakterisierten wir auch die Anti-MGlutR1-Antikörper, die bei Kaninchen gegen das konjugierte Peptid hergestellt wurden. Das Honigbienengenom kodiert einen hochkonservierten AmGluRA (nach NCBI-Nomenklatur mGlutR1 genannt) metabotropen Glutamatrezeptor5. Das Honigbienen-MGlutR1-Gen hat laut NCBI-Datenbank vier vorhergesagte Spleißvarianten. Es wurde berichtet, dass es im zentralen Nervensystem (ZNS) sowohl der Pupal- als auch der Erwachsenen-Bienenstadien ausgedrückt wird und an der Langzeitgedächtnisbildung beteiligt ist5. Antikörper, die gegen mGlutR1 entwickelt wurden, können ein wesentliches Werkzeug für das Studium des glutamatergen Systems im Lern- und Gedächtnisprozess bei Honigbienen sein.
In unseren Studien charakterisierten wir auch Anti-RDL-Antikörper, die bei Kaninchen entwickelt wurden, die mit konjugierten Peptiden aus der Untereinheit Apis mellifera RDL-Rezeptoren immunisiert wurden. Das Honigbienen-Rdl-Gen AmRdl (XM_006565102.3, NCBI-Datenbank) hat 14 vorhergesagte Spleißvarianten. Ein teilweise geklontes Fragment wurde in der NCBI-Datenbank AF094822.1 gemeldet. Die RDL-Rezeptorfunktion und ihre Physiologie ist gut bei Insekten6,7,8, einschließlich Honigbienen9,10,11untersucht. Antikörper gegen Anti-RDL entwickelt kann ein wesentliches Werkzeug für das Studium der GABAergen System in der Lern-und Gedächtnisprozess bei Honigbienen.
Eine frühere Studie über die Rolle von Oktopamin und Tyramin-Rezeptoren verwendet RNAi in das Gehirn mit einem anschließenden Test der Menge an Protein durch Western Blot12,13. RNAi hat jedoch einige erhebliche Einschränkungen. Es gibt nur ein kurzes Zeitfenster nach der RNAi-Injektion, in dem eine Reduktion des Proteins13auftritt. CRISPR-Cas9 wurde erst vor kurzem in Honigbienenembryonen verwendet, um Gene im gesamten Tier zu löschen oder zu modifizieren14,15,16. Wir berichteten über die Verwendung von CRISPR-Cas9, um die Menge des Proteins in der erwachsenen Honigbiene zu reduzieren. Wir entwickelten diesen Ansatz für Honigbienen wegen der Fähigkeit, es mit Verhaltensstudien des Lernens und Gedächtnisses unter kontrollierten Laborbedingungen 17 zu koppeln17.
In der vorliegenden Arbeit entwickelten wir Antikörper gegen zwei Rezeptoren und testeten sie an den erwachsenen Honigbienen-Gehirnabschnitten, nachdem das Protein durch CRISPR-Cas9-Injektion reduziert wurde. Gleichzeitig haben wir ein experimentelles Design etabliert, das die Anwendung der Methode für Verhaltensexperimente ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Acrylamid-bis Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>wird mit destilliertem Wasser verwendet, um das Gehirn von Honigbienen in Blöcken zu fixieren</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Research Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>Sekundärantikörper zur Aufdeckung der Primärantikörper aus Kaninchen</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO</td><td>IDT</td><td>1075934</td><td>mit designierter Guide-RNA, bildet es gRNA</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuklease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td> Enzym, das <td>zur Herstellung von Ribonukleoprotein für das CRISPR-System verwendet wird</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-mGlutR1-Antikörper</td><td>Covalab (FRANKREICH)/Biochemikalie des 21. Jahrhunderts</td>, <td>charakterisiert von den Autoren in der vorliegenden Arbeit</td><td>Verwendung für die primäre Inkubation von mGlut 1 in Honigbienen</td></tr><tr><td>Anti-RDL-Antikörper</td> des <td>21. Jahrhunderts Biochemikalie</td><td>, charakterisiert von den Autoren in der vorliegenden Arbeit</td><td>Verwendet für die primäre Inkubation von RDL in Honigbienen</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Barraquer Iris Schere 7mm Klinge Scharfe Spitze</td><td>World Precision Instruments</td><td>14128-G</td><td>zum Sezieren von Honigbienengehirn</td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Klinge (zerbrechlich) für Klingenhalter</td><td>Fine Science Tool</td><td>10050-00</td><td>Dissektion für Western Blotting</td></tr><tr><td>Klingenhalter und -brecher</td><td>Fine Science Tool</td><td>15309</td><td>Dissektion für Western Blotting</td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>für Injektionsverfahren</td></tr><tr><td>Chemilumineszierendes Western Blot Detektionssubstrat</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>DNA easy kit</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>DNA-Extraktion</td></tr><tr><td>DNA-freies Kit</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>Zur Entnahme von DNA</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus Pipette, 3er-Pack</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Well Polystyrol Multiwell</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>Multiwell</td></tr><tr><td>Einbettkapseln mit flachem Boden,</td> Polyethylen-Elektronenmikroskopie <td> Science</td><td>70021</td><td>Korb für Hirnschnitte</td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5 (Paar)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11254-20</td><td>für die Dissektion des Gehirns von Honigbienen vom Kopf</td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5S (Paar)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11252-00</td><td>zur Reinigung des Gehirns von der Luftröhre vor der Dissektion</td></tr><tr><td>Genexpression Master Mix</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1055770</td><td>qPCR Drop-off-Assay</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>zur Herstellung von Peptidkonjugaten zur Kontrollpeabsorption</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td><td>Western Blotting, Embedding</td></tr><tr><td>Medium Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hydrophobes gefiltertes Nylonmesh</td><td>Spectrum Labs</td><td>145910</td><td>für den Boden des Korbs für Gehirnschnitte</td></tr><tr><td>Isopropyl Alkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50 ml RNA-Isolierung</td><td></td></tr><tr><td>Schlüsselloch-Napfschnecke Hämocyanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td><td>zur Herstellung von Konjugaten für die Kontrolle</td></tr><tr><td>LSM800 kofokales Mikroskop Zeiss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>entworfene Guide-RNA für CRISPR-Cas 9. Target-mGlutR1-Genomsequenzen</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 2</td><td>IDT-designte</td><td></td><td>Guide-RNA für CRISPR-Cas 9. Target-mGlutR1-Genomsequenzen</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 3</td><td>IDT-designte</td><td></td><td>Guide-RNA für CRISPR. Ziel-mGlutR1-Genomsequenzen:</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td>, <td>Western Blotting</td></tr>, <tr><td>96-Well-PCR-Mikroplatte</td>, <td>Angewandtes Biosystem,</td><td>4346907</td><td>qPCR-Drop-off-Assay und qRT-PCR</td></tr>, <tr><td>384-Well-PCR-Mikrotiterplatte</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr>, <tr><td>Mineralöl</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>M5904_500mL</td><td>für das Injektionsverfahren</td></tr><tr><td>Modell p87 Flammender brauner Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Kapillarpräparat</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>zur Einbettungslösung</td></tr><tr><td>Nanoliter 2000</td><td>World Precision Instruments Nanoliter</td><td></td><td>Injektionsapparat</td></tr><tr><td>Normales Eselserum</td><td>Jackson Research Laboratories</td><td>AB_2337258</td><td>Blockierungsmittel für die Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Nicht-immunes Ziegenserum</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>Blockierungsmittel für das Immunblotting</td></tr><tr><td>Nukleasefreier Puffer</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>Nukleasefreier Puffer, der bei der Vorbereitung der CRISPR-Cas9-Injektion verwendet wird</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>IDT</td><td>AM9337</td><td>Nukleasefreies Wasser, das bei der Vorbereitung des CRISPR-Cas 9-Systems verwendet wird</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemat, Paraformaldehyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>zur Herstellung von Fixiermitteln für Bienengehirne</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Verwendung mit Paraformaldehyd als Fixiermittel; Puffer für Antikörper</td></tr></tbody></table>

anti-rdl und anti-mglutr1-rezeptoren antikörpertests in honeybee brain sections mit crispr-cas9

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-assoziiertes Protein 9 (Cas9) ist eine Gen-Editing-Technik, die in Studien zur Genfunktion weit verbreitet ist. Wir verwenden diese Methode in dieser Studie, um die Spezifität von Antikörpern zu überprüfen, die gegen das Insekt GABA A-Rezeptor-Subunit Resistenz gegen Dieldrin (RDL) und einen metabotropen Glutamatrezeptor mGlutR1 (mGluRA) entwickelt wurden. Die Antikörper wurden bei Kaninchen gegen die konjugierten Peptide speziell für Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) sowie gegen Honigbienen (Apis mellifera) erzeugt. Wir verwendeten diese Antikörper in Honigbienen-Gehirnabschnitten, um die Verteilung der Rezeptoren in Honigbienengehirnen zu untersuchen. Die Antikörper wurden gegen das Peptid gereinigt und mit Immunoblotting und der klassischen Methode der Preadsorption mit Peptidkonjugaten getestet, um zu zeigen, dass die Antikörper spezifisch für die entsprechenden Peptidkonjugate sind, gegen die sie angehoben wurden. Hier haben wir die CRISPR-Cas9-Technik entwickelt, um die Reduktion von Proteinzielen im Gehirn 48 h nach CRISPR-Cas9-Injektion mit Guide RNAs für den entsprechenden Rezeptor zu testen. Die CRISPR-Cas9-Methode kann auch bei Verhaltensanalysen bei erwachsenen Bienen eingesetzt werden, wenn ein oder mehrere Gene verändert werden müssen.

Anti-RDL-Antikörpertests Die Antikörper wurden gegen die RDL-Peptidkonjugate hergestellt, wie in Abbildung 1Adargestellt. Der erste Schritt bei der Charakterisierung der Anti-RDL-Antikörper besteht darin, das Homogenat des aus dem Bienenhirn extrahierten Proteins mit einem Western-Blot mit Anti-RDL-Antikörpern und einem HRP-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper zu überprüfen (Abbildung 1A, Einfügen). Beide Anti-RDL-Antikörper erkannten das Band bei 50-60 kD (Pfeil), was dem geschätzten Gewicht der Isoformproteine der RDL-Untereinheit entspricht. Um zu zeigen, dass Anti-RDL-Antikörper das Peptid in den Gehirnscheiben erkannten, verwendeten wir eine Preadsorptionskontrolle (Abbildung 1B,C). Wenn Antikörper mit konjugierten Peptiden vorinkubiert wurden, fehlte die Färbung auf dem Abschnitt. Dies zeigte, dass die Anti-RDL-Antikörper das konjugierte Peptid erkannten, gegen das sie erhoben wurden. Um zu zeigen, dass die Anti-RDL-Antikörper das Protein im festen Hirngewebe erkennen, haben wir CRISPR-Cas9 verwendet, um das RDL-Gen auszuschalten, das das RDL-Protein in den Zellen produziert. Abbildung 1D1-3zeigt kontrollfrontale Bienenhirnabschnitte, die mit Anti-RDL-Antikörpern beschriftet wurden. Diese Bee wurde nicht mit RDL-CRISPR-Cas9 RNP injiziert. In Abbildung 1D1bezeichnet Anti-RDL Neuropils im frontalen Bereich des Bienenhirns. Derselbe frontale Abschnitt in Abbildung 1D2 zeigt das Fehlen von Fluoreszenz von ATTO550, da der RDL-CRISPR-Cas9-Komplex nicht injiziert wurde.
Abbildung 1E1-E3 zeigt einen Hirnschnitt aus einer Mitspritze mit RDL-CRISPR-Cas 9, die dann mit der gleichen Menge an Antikörpern wie das Kontrollhirn in Abbildung 1D1-D3verarbeitet wurde. Die Anti-RDL-Färbung wurde im gesamten Gehirn 48 h nach der Injektion signifikant reduziert, und die Verteilung der ATTO550 Färbung im Gehirn (Abbildung 1E2) zeigt den Erfolg der RDL-CRISPR-Cas 9-Injektionen im Bienenmedian-Ocelli. Die mehrfach verstreuten Zellen des Gehirns zeigen ATTO550. Die erfolgreiche Injektion von RDL-CRISPR-Cas 9 reduzierte die Proteinexpression im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 1E1-3). Von acht immunbefleckten Bienenhirnen hatte nur ein Gehirn eine hohe Verteilung des RDL-CRISPR-Cas9 in den Zellen von Pilzkörper, Protocerebrum und Antennenlappen, während andere Gehirne Zellfärbung mit ATTO550 im Pilzkörper-Calyx hatten, zentraler Komplex, aber nicht Antennenlappen. Es ist wichtig zu beachten, dass bei diesen Bienen die Reduktion der Anti-RDL-Immunfärbung nicht so dramatisch war wie im Gehirn, die in Abbildung 1E1gezeigt wurde.
Als nächstes haben wir einen qPCR-Drop-off-Test durchgeführt, bei dem die Drop-off-Sonde so konzipiert wurde, dass sie dem Bereich eines der RDL gRNAs entspricht. In diesen Experimenten entsprach die relative Reduktion der Fluoreszenz in den mit RDL-CRISPR-Cas 9 injizierten Bienenhirnen der Anzahl der modifizierten gDNA in den Proben. In unseren Tests betrug der Bereich, der diesem Leitfaden in gDNA bei 12 mit RDL-CRISPR-Cas9 injizierten Bienen entsprach, 64 % (mittelwert 30 % SD) im Vergleich zu gDNA bei nicht injizierten Bienen(Abbildung 3A).
Um den Gehalt der RDL-RNA in den Bienen 48 h nach der Injektion zu schätzen, führten wir qRT-PCR in einer separaten Bienengruppe durch (Abbildung 3B). Wir verglichen den Gehalt an RDL-RNA von RDL-CRISPR-Cas 9 injizierten Bienen (n = 19) mit dem RNA-Niveau bei Bienen, die nicht injiziert wurden (n = 12). In diesen Experimenten betrug die relative Reduktion der mRNA RDL 59 % (mittelwert 15 % SE) im Vergleich zum RNA-Niveau bei nicht injizierten Bienen. Bei der Untersuchung des Niveaus der RDL-RNA in jeder Bienen einzeln zeigten nur 13 von 19 Bienen eine signifikante Reduktion der RNA. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Injektion von RDL-CRISPR-Cas9 durch das Ocelli möglicherweise nicht immer eine große Anzahl von Gehirnzellen erreicht, was die Daten mit RDL immunbefleckten RDL-CRISPR-Cas9 injizierten Bienen bestätigt. Bei diesen Präparaten hatte nur eine von 8 Bienen RDL CRISP-Cas9 in vielen Gehirnzellen (Pilzkörper, Protocerebrum und Antennenlappen) im Vergleich zu anderen Bienenhirnen, wo die Verteilung des RDL-CRISPR-Cas9 in Zellen im Protocerebrum (Pilzkörper-Calyx und Zentralkomplex) konzentriert war, nicht aber der Antennenlappen (Abbildung 4A-D).
Anti-mGlutR1 Antikörpertests Wir verwendeten die Anti-mGlutR1-Antikörper, die bei Kaninchen gegen konjugierte Peptide spezifisch für Drosophila melanogaster hergestellt wurden (Abbildung 2A). Die Sequenz dieses Peptids zeigt eine 94%-Identität mit dem Bienenpeptid (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Abbildung 2A. Zuerst überprüften wir die Antikörper gegen das Bienenhirnprotein mittels Immunoblotting. Das Bienenhirnhomogenat wurde durch 10% SDS-PAGE getrennt und elektrophoretisch von einer Nitrocellulosemembran übertragen und mit Anti-MGlutR1 gefärbt. Der Einsatz in Abbildung 2A zeigt zwei Bänder mit geschätzten Gewichtungen (103 und 83 kD), die zwei Isoformen entsprechen. Als wir diesen Antikörper an Honigbienengehirnen getestet haben, fanden wir heraus, dass sie Neuropilar-Profile und -Zellen in den Bienenhirnabschnitten kennzeichnen, wie in Abbildung 2B,Ddargestellt. Nach der Preadsorption des Anti-mGlutR1-Antikörpers mit konjugiertem-mGlutR1-Peptid verschwand die spezifische Färbung in der Bienenhirnscheibe (Abbildung 2C). Dies bestätigt, dass Anti-mGlutR1-Antikörper das Peptid erkennen (Abbildung 2C). Als nächstes injizierten wir eine Mischung aus mGlutR1-CRISPR-Cas9 in den Median ocelli und verwendeten die Steuerung noguideRNA. Bei Kontrollbienen (n = 7) war die Fluoreszenz von ATTO550 nicht in den Zellen konzentriert. Einige Gehirne hatten eine verstreute Fluoreszenz ATTO550-Kennzeichnung. So zeigt das Kontrollpräparat in Abbildung 2D1-3 Anti-MGlutR1-Färbung im Gehirn, nicht aber die ATTO550-Fluoreszenz. Als mGlutR1-CRISPR-Cas9 in das Ocelli injiziert und von vielen Zellen aufgenommen wurde, wurde der Fluoreszenzspiegel der sekundären Antikörper in dem Bereich, der die funktionelle mGlutR1RNP aufnimmt, signifikant reduziert (Abbildung 2E1-3). Die Bienen wurden 48 h lang überwacht, und eine Bee aus jedem Versuchszustand wurde tot aufgefunden. So haben wir in diesem Experiment sieben Kontrollbienen und acht CRISPR-Cas9 Bienen überprüft. Alle mit CRISPR-Cas9 injizierten Bienen hatten Zellen, die mGlutR1-CRISPR-Cas9 aufnahm. Die meisten dieser Zellen waren in den Pilz Körper Calyx, zentralen Komplex, und hintere protocerebrum. Nur zwei von sieben Bienen zeigten ATTO550-Kennzeichnung in vielen Zellen im Pilzkörper, Zentralkomplex und Antennenlappen. Ein Beispiel für eine dieser Bienen ist in Abbildung 2E dargestellt. Die Verringerung des MGlutR1-Färbungsspiegels in diesen Präparaten war signifikant. Die anderen fünf Bienen haben eine ATTO550-Kennzeichnung entsprechend der erfolgreichen Lieferung des mGlutR1 CRISPR-Cas9 im Pilzkörper und hinteren Protocerebrum, aber nicht in den Antennenroben.
Um den Gehalt der modifizierten mGlutR1 gDNA in den Bienen 48 h nach der Injektion zu schätzen, führten wir einen qPCR-basierten Drop-off-Test durch, bei dem die Drop-off-Sonde im Bereich in der Nähe der mGlutR1-Führung liegen sollte. In diesen Experimenten betrug die relative Veränderung der gDNA bei 12 Bienen in den mit mGlutR1-CRISPR-Cas 9 injizierten Bienenhirnen 59 % (Mittelwert 33 %SD) im Vergleich zu gDNA bei nicht injizierten Bienen(Abbildung 3A).
Diese Ergebnisse wurden auch durch qRT-PCR-Tests in einer anderen Gruppe von Bienen bestätigt, wo wir die mGlutR1-RNA-Spiegel mit qRT-PCR bei den Bienen 48 h nach Injektionen mit RNPmGlutR1mix schätzten (Abbildung 3B). Wir verglichen den Gehalt an mGlutR1-RNA der mGlutR1-CRISPR-Cas9 injizierten Bienen (n = 6) mit den RNA-Spiegeln bei Bienen, die nicht injiziert wurden (n = 6). In diesen Experimenten betrug die relative Reduktion der mRNA mGlutR1 bei injizierten Bienen 53 % (Mittelwert 18 % SE) im Vergleich zu nicht injizierten Bienen(Abbildung 3B).
Der Abschnitt von vier verschiedenen Bienen, die den RNP RDL-CRISPR-Cas9 in der Kenyon-Zelle des Pilzkörpers ausdrückten, ist in Abbildung 4A-Ddargestellt. Die Beispiel-Bienen mit ATTO550-Fluoreszenz im Pilzkörper und dem Antennenlappen sind in Abbildung 4E,Fdargestellt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Führer</td>
			<td>Sequenzen</td>
			<td>gRNA</td>
			<td>Rnp</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>[guideRNA:tracrRNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 Nuklease]</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide1</td>
			<td>ACCGTAACGCGACCCCCGCT</td>
			<td>GRDL1</td>
			<td>RRDL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide2</td>
			<td>AACGTCGATCGACTTGACGT</td>
			<td>GRDL2</td>
			<td>RRDL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide3</td>
			<td>CCATGACGAAACACGTGCCC</td>
			<td>GRDL3</td>
			<td>RRDL3</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAAGTTATCTGACGGTGT</td>
			<td>GMGL1</td>
			<td>RMGL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 2</td>
			<td>TTCAACGAGAGCAAGTTCAT</td>
			<td>GMGL2</td>
			<td>RMGL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGTAGGAGTGA</td>
			<td>GMGL3</td>
			<td>RMGL3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Nukleotidsequenzen von Hilfslinien für RDL und mGlutR1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg"> Abbildung 1: Charakterisierung von Anti-RDL-Antikörpern. (A) Schematic der RDL-Untereinheit, wo die rosa Kreise die Lokalisation von Peptid 2 (extrazellulärer CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amid) im N-Terminus und Peptid 1 (intrazellulärCVRFKVHDPKAHSKGGTL-amid) im C-terminus anzeigen. Die Einfügung in A zeigt die Bänder im Western-Blot von Honigbienen-Gehirnextrakten, die mit entsprechenden Anti-RDL-Antikörpern (eines mit Anti-RDL-Pep1 und Anti-RDL-Pep2) verarbeitet werden. Jeder Immunoblot zeigt die scheinbare Größe des Proteins 50-60 kD, entsprechend den geschätzten Gewichten der verschiedenen Isoformen der RDL-Untereinheiten. (B,C) Preadsorption der Anti-RDL-Antikörper mit konjugiertem Peptid 1. Das Bild in C zeigt eine Verringerung der Färbung im Abschnitt, wenn die Antikörper mit konjugiertem Peptid 1 vorinkubiert wurden. Der fächerförmige Körper (Fb) und der Ellipsoidkörper (eb) sind zentrale komplexe Strukturen im Gehirn. M = medialer Lappen des Pilzkörpers. (D1-3) Anti-RDL Färbung einer Kontrolle, nicht injizierte Bienenhirn Abschnitt nach 48 h. Grün zeigt das Anti-RDL positives Profil im Gehirn. (D2) Diese Eisbe wurde nicht injiziert und enthält keine ATTO550-Fluoreszenz. (D3) Zusammengeführte Bilder von D1 und D3. (E1-3) Die Injektion von RDL-CRISPR-Cas9 reduzierte die Anti-RDL-Färbung nach 48 h. (E2) ATTO550 Fluoreszenz in den Zellkernen deutete auf eine erfolgreiche RDL-CRISPR-Cas9-Entbindung hin. (E3) Das zusammengeführte Bild von Anti-RDL (grün) und ATTO550 (rot). Skala bar = 100 'm (B-E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg"> Abbildung 2: Charakterisierung von Anti-MGlutR1-Antikörpern. (A) Schematisches von GCPR mGluR, das das Drosophila melanogaster Peptid zur Immunisierung zeigt. Zum Vergleich: Das Apis-Mellifera-Peptid wird unten gezeigt. Der Kreis zeigt die Lokalisation des Peptids im N-Terminus der extrazellulären Domäne des mGlutR1-Rezeptors an. Die Einfügung in A zeigt, dass die Anti-mGlutR1-Antikörper zwei Bänder im westlichen Fleck des Bienengehirns mit 103 kD und 83 kD erkannten, die den geschätzten Gewichten bekannter Isoformen entsprechen. (B,C) Preadsorption-Kontrolle des Anti-mGlutR1-Antikörpers in zwei aufeinanderfolgenden Abschnitten des Antennenlappenglomeruli. Das Bild von Anti-mGlutR1 im Antennen-Glomeruli-Abschnitt in C zeigt die Reduktion der Färbung infolge der Vorinkubation des Anti-MGlutR1-Peptids mit dem Anti-mGlutR1-Antikörper. Dieses Verfahren bewirkt, dass der Antikörper aus der Lösung herausfällt, was die Färbung im Vergleich zu B abschafft (Kontrolle, Fehlen des Peptids in der Vorinkubation). (D1) zeigt die Färbung von Anti-MGlutR1 in einer Bienenhirnscheibe nach einer Kontrollinjektion im Median ocellus. Dieser Injektion fehlte die mGlutR1 gRNA, die den Abstoß von mGlutR1-Rezeptoren durch CRISPR-Cas9 ermöglicht, und so wurde die Färbung des Anti-mGlutR1-Antikörpers nicht reduziert (grün). (D2) Das Fehlen von ATTO550 Fluoreszenz zeigt das Fehlen von funktionellem CRISPR-Cas9 im Gehirn. (D3) Zusammengeführte Bilder von Anti-mGlutR1 und ATTO550. (E1-E3) zeigen die Färbung von Anti-mGlutR1 in einem Hirnbereich, in dem mGlutR1 nach der Injektion mit mGlutR1-CRISPR-Cas 9 im Median ocellus dauerhaft 48 h niedergeschlagen wurde. So wird die Färbung in diesem Gehirn durch den erfolgreichen Knockout des mGlutR1 in vielen Zellen stark reduziert. (E2) ATTO550 Färbung in vielen Zellkernen im Bienenhirn deutet darauf hin, dass die Injektion von mGlut1-CRISPR-Cas 9 erfolgreich war. (E3) Zusammengeführtes Bild von ATTO550 (rot) und Anti-MGlutR1 (grün). Skala bar = 10 m (B,C); 100 m (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg"> Abbildung 3: Auswertung der modifizierten gDNA und Expression von mRNA von RDL und mGlutR1 mRNA im Bienenhirn 48 h nach Injektion mit 345 nL des entsprechenden RPN CRISPR-Cas9. (A) Der qPCR-basierte Drop-off-Assay-Test zur Bewertung der menge an gDNA mit einem Modmodumumwird wurde mit der2-Ct-Methode berechnet und gegen Kontrolle normalisiert, nicht injizierte Gehirne. Die Daten werden als Mittelwert + SD ausgedrückt. (B) Der qRT-PCR-Test wurde verwendet, um die Menge an mRNA in CRISPR-Cas9 injizierten und nicht injizierten Bienen zu bewerten. AmActin wurde als Referenzgen verwendet. Die relative Genexpression wurde mit 2--Ct-Methoden berechnet und gegen Kontrolle normalisiert, nicht injizierte Gehirne. Die Daten werden als Mittelwert + SE ausgedrückt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg"> Abbildung 4: Beispiel für die Verteilung von RNP CRISPR-Cas9 in Bienengehirnen über ATTO550-Fluoreszenz. (A-D) Die Hirnabschnitte von vier verschiedenen Bienen, die das RNP RDL-CRISPR-Cas9 in der Kenyon-Zelle des Pilzkörpers ausdrückten. (E,F) Beispiel für zwei Gehirne 48 h nach Injektion mit RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Skalenbalken = 150 m (A-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier wird ein Protokoll zur Verwendung des CRISPR-Cas9-Systems zur Reduzierung der Produktion eines Proteins im erwachsenen Honigbienenhirn zur Erprobung der Antikörperspezifität vorgestellt.

Anti-RDL und Anti-mGlutR1-Rezeptoren Antikörpertests in Honeybee Brain Sections mit CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Zum ersten Mal haben wir eine Modifikation der Gene für ionotrope GABAA und metabotrope Glutamat-Rezeptoren in Teilmengen von Neuronen im erwachsenen Honigbienengehirn kodiert etabliert. DIE CRISPR-Cas9-Genbearbeitung kann verwendet werden, um ein oder mehrere Gene in erwachsenen Bienengehirnen zu modifizieren, um ihre Rolle beim Lernen und Gedächtnis unter kontrollierten Laborbedingungen zu erforschen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Funktion bestimmter Proteine bei erwachsenen Bienen zu untersuchen und die Spezifität von Antikörpern gegen ihre entsprechenden Proteine zu testen.Demonstrieren das Verfahren mit Irina Sinakevitch werden Lev Kurtzman und Hyun Choi, ehemalige Studenten aus meinem Labor. Um die Expression von RDL und mGlutR1 durch immunzytochemische Analyse nach CRISPR-Cas9-Injektion zu testen, verwenden Sie zunächst ein Online-Tool CRISPR-Cas9, um die Leitfäden mit der Leit-DNA-Sequenz von apis mellifera, RDL und mGlutR1 zu entwerfen. Um für jede Führungs-RNA eine Führungs-RNA vorzubereiten, beschriften Sie ein Reagenzglas für jede Führungs-RNA mit dem Namen der Guide-RNA und fügen Sie 92 Mikroliter Nukleotid-freien Puffer, vier Mikroliter 100 mikromolares Fluorophor, transaktivierende CRISPR-RNA, und vier Mikroliter der entsprechenden Führungs-RNA-Lösung zu jeder Röhre hinzu.Wenn alle Materialien hinzugefügt wurden, mischen Sie die Lösungen sanft und drehen Sie den Rohrinhalt in einer Tischzentrifuge für fünf Sekunden, um die Lösung zu sedimentieren. Halten Sie dann die Lösungen fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius, um einen RNA-Führungskomplex zu erstellen, gefolgt von einer 10-minütigen Abkühlung bei Raumtemperatur. Zur Herstellung des Ribonukleoproteins fügen komplexe Formationen sechs Mikroliter jeder Führungs-RNA-Lösung und sechs Mikroliter 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter SP-Cas9-Nuklease V3 in die entsprechend gekennzeichneten Röhrchen ein.Nach sanftem Mischen die Lösungen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren Um RNP-Ribonukleoprotein-Mischungen zur Injektion herzustellen, fügen Sie am Ende der Inkubation vier Mikroliter jedes Ribonukleoproteins in die entsprechende RDL ein. Um eine Kontrolle zu ermöglichen, mischen Sie eine no-guide RNA-Lösung vier Mikroliter Tracer-RNA mit 92 Mikroliter Puffer und vier Mikroliter Wasser. Nach dem Zusatz von Wasser, halten Sie die Lösung für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius und lassen Sie die Mischung abkühlen, bis sie Raumtemperatur erreicht.Mischen Sie dann sechs Mikroliter der NO-Guide-RNA-Lösung mit sechs Mikrolitern von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter Cas9 Nuklease V3. Bei der Ribonukleoprotein-Mischungsinjektion, nach der Erfassung einzelner Bienen in Fläschchen mit einem kleinen Loch in den Kappen, die Bienen nicht mehr als drei Minuten auf Eis immobilisieren und jede Bee in zuvor hergestellten Metallhaltern mit Klebeband sichern. Mit dem Rücken Thorax, Flügel und Kopf ausgesetzt. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, um die Bienen mit einer einmolaren Saccharoselösung zu füttern, bis sie nicht mehr hungrig sind, und legen Sie die gesicherten Bienen in eine Schachtel mit einem nassen Papiertuch für Feuchtigkeit.Als nächstes legen Sie Wachs auf die Innenseite der Deckel von zwei 35 Milliliter Petrischalen und legen Sie die Böden der Gerichte auf das Wachs. Injizieren Sie eine MolarSaccharose zwischen der Abdeckung und dem Boden jeder Schale, und legen Sie eine Fütterung Petrischale in eine weiße Box mit einer Glasrutsche und legen Sie die andere in eine schwarze Box mit einer Glasrutsche. Legen Sie dann einen kleinen Kamm in jede Box und laden Sie ein Mikroinjektionssystem mit dem RDL CRISPR-Cas9-Gemisch.Bei der RDL CRISPR-Cas9-Injektion den Median-Ocelli von acht Bienen mit 345 NanoliterN Ribonukleoprotein-RDL-Mix injizieren, gefolgt von der Fütterung mit einer Molarensaccharsarose, bevor die Bienen in die schwarze Versuchsbox freigesetzt werden. Füttern Sie einen zweiten Satz von acht Bienen als Steuerung ohne Injektionen und lassen Sie sie in die weiße Steuerbox. Legen Sie dann beide Kisten in einen Polystyrolbehälter mit nassem Papier und beobachten Sie die Bienen zweimal täglich, um sicherzustellen, dass sie genügend Nahrung und eine gute Luftfeuchtigkeit haben.48 Stunden nach der Injektion, immobilisieren Sie die Bienen auf Eis für 30 Sekunden und verwenden Sie eine Schere, um jedes Insekt zu enthaupten. Legen Sie die Köpfe in 4%Paraformaldehyd IN PBS unter einem Sezierendes Mikroskop in einer Dunstabzugshaube und verwenden Sie barraquer IrisSchere, um die Antennen, zusammengesetzten Augen und das obere Exoskelett sorgfältig, aber schnell zu entfernen. Lassen Sie die Köpfe 10 Minuten in der fixativen Lösung sitzen, bevor Sie den Rest des Exo-Skeletts vom Kopf und die gesamte verbleibende Luftröhre entfernen.Dann legen Sie jedes Gehirn in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, das mindestens einen Milliliter 4% Paraformaldehyd über Nacht bei vier bis acht Grad Celsius enthält. Am nächsten Morgen 3,8 Gramm Argrose zu 50 Milliliter destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben und Mikrowelle nieren, bis die Argbrose liiert. Übertragen Sie drei bis vier feste Honigbienengehirne in eine neue 35-Millimeter-Petrischale und verwenden Sie Tissuepapier, um die überschüssige Fixierung zu entfernen.Gießen Sie die flüssige Argrose vorsichtig über das Gehirn und orientieren Sie die Proben innerhalb der Argrose so, dass die Antennenlappen nach oben gerichtet sind. Nachdem die Argrose verfestigt hat, verwenden Sie ein Skalpell, um einzelne Blöcke von Argrose mit einem einzigen Gehirn auszuschneiden und füllen Sie jeden Brunnen einer 24-Well-Platte mit einem Korb mit einem hydrophoben Netzboden und 600 Mikroliter PBS pro Brunnen geladen. Verwenden Sie dann ein Vibratome, um 70 Mikrometer Querschnitte des Hirngewebes aus jedem Argrosenblock zu erwerben.Platzieren der Abschnitte von einem einzelnen Gehirn auf das Netz desselben Korbes, wie sie erworben werden. Nach der Kennzeichnung der Abschnitte mit fluorophorkonjugierten Antikörpern, nach Standardprotokollen, betten Sie jedes Dia mit Abschnitten aus einem einzigen Gehirn mit einem Tropfen Montagemedium ein und visualisieren die Proben durch Fluoreszenzmikroskopie. Anti-RDL kennzeichnet Neuropils im frontalen Bereich des Wildtyps, aber nicht CRISPR-Cas9 RDL Knockout Bienengehirne.Eine ähnliche Spezifität wurde bei Anti-MGlutR1-Antikörpern beobachtet. In diesen repräsentativen, quantitativen PCR-Drop-off-Tests in Bienengehirnen, die mit RDL CRIPSR-Cas9 injiziert wurden, entsprach die relative Reduktion der Fluoresenz der Anzahl der modifizierten Führungs-DNA in der Probe. Nach der mGlutR1 CRISPR-Cas9-Injektion betrug die relative Modifikation der Führungs-DNA im Gehirn der injizierten Bienen etwa 59 % im Vergleich zur Führungs-DNA, die im Gehirn von nicht injizierten Bienen beobachtet wurde.In dieser quantitativen RT-PCR-Ina-Gruppe von Bienen betrug die relative Reduktion der Boten-RNA RDL etwa 59% im Vergleich zum RNA-Niveau bei nicht injizierten Bienen, und die relative Reduktion der Botenstoff-mGlutR1-RNA bei injizierten Bienen betrug etwa 53%. Zum Beispiel hatte bei diesen Präparaten nur einer von acht RDL CRISPR-Cas9 in einer großen Anzahl von Gehirnzellen im Vergleich zu anderen Bienengehirnen. Mit dem RDL CRISPR-Cas9 konzentriert in den Zellen des Protocerebrum, aber nicht der Antennenlappen.Achten Sie darauf, gefrorene und eingefrorene RNA zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Bienen nicht zu überkühlen. Nutze sie sofort, sobald sich der Stopp in der Durchstechflasche bewegt.Diese Technik kann verwendet werden, um die Auswirkungen der Reduktion von hemmenden ionotropen und metabotropen Rezeptoren im Pilzkörper und zentralen Komplex auf das Verhalten der Honigbiene zu studieren.

anti-rdl-anti-mglutr1-receptors-antibody-testing-honeybee-brain

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Strategien, die gleichzeitig zwei Gene unterdrücken (doppelte Gen Knockdown) in Honigbienen. Dann präsentieren wir, wie die Rüssel extension response (PER) Test, um die Wirkung der doppelten Gen Knockdown auf Honigbiene geschmacklichen Wahrnehmung studieren verwenden.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Dieses Manuskript beschreibt mehrere Protokolle für pharmakologische Mittel zur Verabreichung von Honigbienen, einschließlich einfacher nicht-invasive Methoden zur freifliegenden Bienen, sowie mehr invasive Varianten, die eine präzise lokalisierte Behandlung von zurückhaltender Bienen ermöglichen.

Neuropharmakologische Manipulation von Verhaltene und Free-Fliegen-Honig-Bienen,<em&gt; Apis mellifera</em

Dieses Papier beschreibt ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll, insbesondere für Low-Level-exprimierte Odorant Receptor (OR) -Gen sowie andere Gene in Insektenantennen unter Verwendung von Digoxigenin (DIG) -markierten oder Biotin-markierten Sonden.

Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung

Um die hemmende Wirkung von pharmakologische Agenten auf Phospholipase C (PLC) in verschiedenen Regionen des Gehirns Honigbiene zu testen, stellen wir einen biochemischen Assays um PLC-Aktivität in diesen Regionen zu messen. Dieser Test könnte nützlich für den Vergleich von PLC-Aktivität bei Geweben, sowie bei den Bienen, die unterschiedliche Verhalten ausstellen.

Erkennung von Phospholipase C Aktivität im Gehirn Homogenat von der Honigbiene

Viele Merkmale der Insekten-Eusozialität beruhen auf der Kommunikation innerhalb der Kolonie und der Arbeitsteilung. Die genetische Manipulation wichtiger regulatorischer Gene in Ameisenembryonen durch Mikroinjektion und CRISPR-vermittelte Mutagenese liefert Einblicke in die Natur altruistischen Verhaltens bei eusozialen Insekten.

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Wir haben einen Duplex-in-situ-Hybridisierungsassay zur Kartierung der Insulinrezeptor-Isoformen IR-A und IR-B im murinen Plexus choroideus etabliert und damit die Einschränkungen traditioneller Methoden überwunden. Dieser hochauflösende Ansatz enthüllt die isoformspezifische Expression und bietet neue Einblicke in die Insulinsignalisierung im Gehirn und potenzielle isoform-gezielte Therapien für neurologische Erkrankungen.

Präzise Visualisierung der Insulinrezeptoren A und B im Gehirn von Mäusen mit einem RNA In Situ Hybridisierungsassay

Hier beschreiben wir ein einfaches und schnelles Verfahren zum Nachweis von DNA von Bienenpathogenen, wie z.B. Lotmaria passim und Nosema ceranae, unter Verwendung einer amplifikationsbereiten Zelllyse, einer Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und CRISPR/Cas12a-Assays.

Vor-Ort-DNA-Nachweis von Trypanosomatiden-Parasiten und Nosema ceranae durch alkalische Lyse gekoppelt mit RPA/CRISPR/Cas12a-System

Erfahren Sie, wie CRISPR-Cas9 zur Modifikation von GABAA- und metabotropen Glutamatrezeptoren im adulten Honigbienengehirn eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Lernen und Gedächtnis sowie die Validierung von Antikörperspezifität.

Anti-RDL und Anti-mGlutR1-Rezeptoren Antikörpertests in Honeybee Brain Sections mit CRISPR-Cas9

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