Eine direkte und einfache Methode zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Drosophila melanogastervom Embryo zum Erwachsenen
27. August 2019
Dieses Protokoll soll die Lebensfähigkeit von Drosophila in jeder Entwicklungsphase vom Embryo bis zum Erwachsenen bewerten. Die Methode kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit verschiedener Genotypen oder Wachstumsbedingungen zu bestimmen und zu vergleichen.
Der Hauptvorteil dieses Assays ist die Einfachheit und Genauigkeit, da es keine Embryospülung erfordert, um auf die Lebensmitteldurchstechflasche zu übertragen, und die Verluste durch technische Fehler vermeidet. Dieses Protokoll erfordert keine fachkundigen technischen Fähigkeiten. Das richtige Timing und die sorgfältige Wasserübertragung sind jedoch wichtig für ihre Genauigkeit und Reproduzierbarkeit.
Demonstriert wird dieses Verfahren von Antonio Rockwell, einem kürzlich abgeschlossenen Doktoranden aus meinem Labor. Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, gießen Sie Traubenagar in eine 35-Millimeter-Petrischale halb voll und lassen Sie den Agar für eine Stunde erstarren. Wenn der Agar erstarrt ist, verwenden Sie ein kleines Plastikmesser, um die Oberfläche des Agars an der Außenseite der Platte sanft zu kratzen, sodass die Mitte der Platte frei von Kratzern bleibt.
Dann legen Sie eine kleine Menge frisch zubereitethefe Paste in die Mitte der Schale und legen Sie die Schale in eine Embryo-Sammlung Mini-Käfig. Für die Embryo-Sammlung, ersten Platz zwei jungfrauen Drosophila Weibchen und ein junges Männchen in der Sammlung Käfig für 24 Stunden. Am nächsten Tag den Boden der Agarplatte inspizieren, um nach Embryonen zu suchen.
Wenn Embryonen verlegt wurden, übertragen Sie die Agarplatte in eine feuchte Kammer und bedecken Sie die Platte mit dem Deckel, um Austrocknung zu vermeiden. Wenn mehrere Tage der Verlegung erzielt werden sollen, legen Sie eine neue Agarplatte in den Sammelkäfig. Verwenden Sie das Mikroskop, um die Anzahl der geschlüpften Embryonen und L1-Larven zu bestimmen, und geben Sie die Embryonen bei Raumtemperatur in die feuchte Kammer zurück, bis alle Embryonen geschlüpft sind und sich zu L1-Larven entwickelt haben.
Zählen Sie nach 48 Stunden die Anzahl der geschlüpften Embryonen und L1-Larven und verwenden Sie einen Spachtel, um die Scheibe des Traubenagars vorsichtig aus der Petrischale zu entfernen, indem Sie die Scheibe L1-Seite auf dem Lebensmittel in einer Lebensmitteldurchstechflasche platzieren, die groß genug ist, um die Scheibe aufzunehmen. Dann die Petrischale sorgfältig auf restliche Larven untersuchen. Überwachen Sie die Lebensmitteldurchstechflasche täglich ungefähr zur gleichen Zeit jeden Tag, um zu bestätigen, dass die L2- und L3-Larven beobachtet werden können, die ihren Weg zum Essen finden.
Erfassen Sie die Anzahl der Pupae und erwachsenen Drosophila, weiterhin zählen, bis keine Erwachsenen mehr beobachtet werden und vermeiden, die nachfolgende Generation zu zählen. Führen Sie dann eine Chi-Quadrat-Analyse durch. Die Nullhypothese geht von einer 100%igen Lebensfähigkeit aus, so dass die Anzahl der Erwachsenen der Anzahl der ursprünglich aufgezeichneten und auf die Nahrungsfläschchen übertragenen Fläschchen entspricht.
Wenn der Agar auf der Seite der Durchstechflasche platziert wird, reifen viele der Embryonen und Larven nicht zu Erwachsenen, wahrscheinlich aufgrund der Austrocknung der Traubenagarscheibe. Wenn der Traubenagar mit dem Gesicht nach unten in der Durchstechflasche in direktem Kontakt mit der Nahrungsoberfläche platziert wird, gehen in der Regel weniger als 6% der Nachkommen verloren, da der Agar hydratisiert bleibt, während er mit der Feuchtigkeit der Instantnahrung in der Durchstechflasche in Berührung kommt. In diesem repräsentativen Experiment, das die Entwicklung von Wildtyp und mutierter Nachkommen verglichen, reiften etwa 91% der mutierten Nachkommen mit dieser Methode bis zum Erwachsenenalter, verglichen mit 94% der Nachkommenschaft von Wildtypfliegen.
Denken Sie daran, die Agarscheibe Embryo-Seite nach unten in die Nahrungsdurchstechflasche zu übertragen und dann, um die leere Petrischale auf alle verbleibenden Larven zu überprüfen, die nicht übertragen wurden. Ein weiterer entscheidender Schritt ist die Übertragung der Agarscheibe auf eine Lebensmitteldurchstechflasche spätestens 48 Stunden nach dem Entfernen der Trauben-Agar-Platte aus der Embryo-Sammlung Mini-Käfige, um Austrocknung zu verhindern.
Übersicht
Dieses Protokoll bewertet die Lebensfähigkeit von Drosophila in allen Entwicklungsstadien, von der Embryonalentwicklung bis zum erwachsenen Tier. Es ermöglicht den Vergleich der Lebensfähigkeit zwischen verschiedenen Genotypen oder Wachstumsbedingungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Der Test ist einfach und genau und verzichtet auf das Spülen der Embryonen, um technische Fehler zu minimieren.
- Ein richtiger Zeitpunkt und eine sorgfältige Wasserübertragung sind entscheidend für die Genauigkeit.
- Die Methode wurde von einem kürzlich promovierten Doktoranden demonstriert und ist ohne besondere Fachkenntnisse durchführbar.
- Die Sammlung der Embryonen erfordert spezifische Bedingungen für optimale Ergebnisse.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Drosophila-Vitalität in verschiedenen Entwicklungsstadien.
- Vergleich der Auswirkungen unterschiedlicher Genotypen auf die Vitalität.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode für zukünftige genetische Studien.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Trauben-Agar-Platten zur Sammlung von Embryonen.
- Verwendung eines Minikäfigs für eine kontrollierte Eiablage.
- Überwachung der Larven- und Erwachsenenentwicklung in Nährstoffgefäßen.
- Statistische Analyse mithilfe des Chi-Quadrat-Tests zur Beurteilung der Lebensfähigkeit.
Hauptergebnisse
- Etwa 91 % der mutierten Nachkommen und 94 % der wildtypischen Nachkommen erreichten das Erwachsenenstadium.
- Eine korrekte Platzierung des Agars reduziert den Verlust an Nachkommen erheblich.
- Der Zeitpunkt des Agar-Transfers ist entscheidend, um eine Austrocknung zu verhindern.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Drosophila-Vitalität.
- Die Ergebnisse deuten auf einen geringen Verlust an Nachkommen hin, wenn das Agar korrekt platziert wird.
- Diese Methode kann weitere genetische und entwicklungsgenetische Studien erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Die quantitative Beurteilung der Lebensfähigkeit über die Entwicklungsstadien von Drosophila hinweg ermöglicht eine robuste Evaluierung des genetischen Hintergrunds und eine frühzeitige biologische Risikominderung. Dieser direkte Assay vom Embryo bis zum adulten Organismus unterstützt eine vorhersagbare Einschätzung der Integrität des Modellsystems und liefert Hinweise für die Zielvalidierung und die Priorisierung von Projektportfolios. Regelmäßige Überwachung der Lebensfähigkeit verringert das Risiko, dass sekundäre Mutationen nachgeschaltete phänotypische Analysen beeinträchtigen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine präzise Untersuchung der genetischen Fitness und des allelischen Einflusses auf die Organismusviabilität.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Quantifizierung von Entwicklungsverlustpunkten.
- Erleichtert die biologische Risikominderung bei der Aufzucht von Mutanten- und Wildtyp-Stämmen.
- Steigert die Vorhersagesicherheit hinsichtlich der Zuverlässigkeit des Modellsystems für nachgeschaltete Studien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet einen standardisierten, reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Quantifizierung der Vitalität über verschiedene Genotypen hinweg.
- Erzeugt quantitative Ausgaben für jeden Entwicklungsstadium zur vergleichenden Analyse.
- Verringert technische Fehler, indem das Spülen von Embryonen entfällt, und erhöht so die Zuverlässigkeit des Assays.
- Ermöglicht die skalierbare Bewertung mehrerer genetischer Hintergründe parallel.
Translationale und präklinische Forschung
- Unterstützt die Validierung krankheitsrelevanter Modellsysteme durch Sicherstellung der genetischen Reinheit der Stämme.
- Ermöglicht Kontinuität von der frühen Entdeckung bis hin zur Auswahl präklinischer Modelle.
- Leitet risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch Identifizierung von Engpässen in der Lebensfähigkeit.
- Bietet mechanistische Einblicke in die entwicklungsspezifische Letalität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Vitalitätsassay verbindet die frühe Entdeckung, die Zielvalidierung und die Qualifizierung präklinischer Modelle und schafft eine Grundlage für zuverlässige genetische Studien und phänotypische Screening-Verfahren.
- Entdeckungsbiologie: Quantifiziert die Entwicklungsfähigkeit, um die Effekte genetischer Signalwege zu klären und biologische Hypothesen hinsichtlich Risiken abzusichern.
- Screening: Erzeugt reproduzierbare, stadienspezifische Daten zur Lebensfähigkeit, um die Eignung von Assays und die Bewertung von Wirkstoffen zu unterstützen.
- Analytik: Wendet die Chi-Quadrat-Statistikanalyse an, um die beobachtete Überlebensrate mit der erwarteten Überlebensrate über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Stellt die Zuverlässigkeit des Modellsystems für translationsorientierte Studien durch routinemäßige Bestandsbewertung sicher.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren, einfach gehaltenen Protokollansatz für die fortlaufende genetische und phänotypische Forschung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten in genetischen Modellsystemen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Beurteilung der Lebensfähigkeit und minimiert technische Variabilität sowie Schulungsaufwand.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch und reduziert biologische Risiken in späteren Phasen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung genetischer Modelle und Zielstrukturen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende Laborfertigkeiten und sorgfältiges Zeitmanagement für genaue Ergebnisse.
- Benötigt eine Standardmikroskopie- und einfache Agar-/Nahrungspräparationsinfrastruktur.
- Setzt eine einheitliche Einhaltung der Übertragungs- und Zählprotokolle über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg zur Reproduzierbarkeit voraus.
- Kann mit geringfügigen Protokollanpassungen auf zusätzliche Entwicklungsstadien übertragen werden.
- Die Genauigkeit hängt von rechtzeitiger Übertragung und Feuchtigkeitskontrolle ab, wie durch die Quelldaten belegt wird.
