Name: Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Lernen Sie die intratracheale LPS-Instillation zur Induktion akuter Lungenschädigung bei Mäusen. Diese minimal-invasive Methode ermöglicht FACS-Analysen von Blut, BAL-Flüssigkeit und Lungengewebe für immunologische Forschung.

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Die Autoren danken Jan Kleiner und Susanne Schulz für die technische Unterstützung. Die Autoren würdigen die hervorragende Unterstützung der Durchfluss-Zytometrie-Kernanlage an der medizinischen Fakultät der Universität Bonn. Die Autoren erhielten keine Finanzielle von einer externen Organisation.  Ein Teil der im Ergebnisabschnitt angegebenen und in Abbildung 3 dargestellten Daten wurde bereits in einer früheren Veröffentlichung8dargestellt.

Dieses Tierprotokoll wurde vom örtlichen Ausschuss für Tierpflege (LANUV, Recklinghausen, Deutschland; Protokoll Nr. 84-02.04.2015) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Nationalen Gesundheitsinstitute für die Verwendung lebender Tiere (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996).
1. ALI-Induktion
<ol><li>Verwenden Sie erwachsene C57BL/6 Mäuse im Alter von etwa 10-12 Wochen. Beherbergen Sie die Tiere in individuell belüfteten Käfigen mit freiem Zugang zu Wasser und Standard Nagetier Chow. Es ist jedoch möglich, diesen Ansatz bei jüngeren Tieren und mit anderen Mäusestämmen durchzuführen.</li>
	<li>LPS (Escherichia coli O111:B4) in Aliquots in Konzentrationen von 5 mg/ml bei -20 °C lagern. Bei intratrachealer Instillation LPS in steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) auf eine Endkonzentration von 2.000 g/ml verdünnen.</li>
	<li>Wiegen Sie die Maus. Injizieren Sie Ketamin [120 mg/kg Mauskörpergewicht (BW)] und Xylazin (16 mg/kg BW) intraperitoneal (unteres Drittel des Bauches, Paramedian), und warten Sie bis zum Beginn der Anästhesie.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie einen taktilen Stimulus induzieren. Bei unzureichender Anästhesie die Injektion mit Ketamin (30 mg/kg BW) und Xylazin (4 mg/kg BW) wiederholen.</li>
	<li>Stellen Sie die Maus in eine anfällige Position auf einen temperaturgeregelten Tisch, um eine Körpertemperatur von 37 °C zu halten.</li>
	<li>Tragen Sie steriles ophthalmologisches Schmiermittel auf, um die Austrocknung von Hornhäuten unter Anästhesie zu verhindern.</li>
	<li>Heben Sie den Kopf und Haken Schneidezähne auf einem horizontalen Balken etwa 5 cm über dem Tisch positioniert, während die Vorpaws in engem Kontakt mit dem Tisch bleiben. Super-Extend den Hals in einem 90° Winkel relativ zum Tisch (Abbildung 1). Halten Sie die Zunge mit Zange, um die Kehle für einfachere Intubationsbedingungen zu begradigen.</li>
	<li>Schneiden Sie einen Venenkatheter mit 22 Gauge (G) auf eine Länge von 20 mm. Legen Sie den Katheter vorsichtig in vertikaler Richtung entlang der Zungenwurzel ein. Legen Sie eine Kaltlichtquelle auf die Haut über dem Kehlkopf, um die Stimmbänder zu visualisieren und auf die Luftröhre zu zielen. Wenn Widerstand des Kehlkopfes auftritt, ziehen Sie den Katheter ein paar Millimeter zurück, bevor Sie wieder vorrücken.</li>
	<li>Stecken Sie den Katheter ca. 10 mm in die Luftröhre. Stellen Sie sicher, dass die Einfügung nicht zu tief ist, da dies zu einer einseitigen Instillation von Flüssigkeit in den rechten oder linken Hauptbronchus führt.</li>
	<li>Injektion lpS (5 g/g BW) in PBS mit einer Pipette verdünnt [injiziertes Volumen hängt vom Körpergewicht der Maus ab (z. B. 20 g Körpergewicht bei Verwendung von 50 l LPS-Lösung)]. HINWEIS: Die Maus reagiert in der Regel mit Husten oder Vergasen auf die richtige Instillation von Flüssigkeit in die Luftröhre.</li>
	<li>Schließen Sie eine Spritze an und fügen Sie einen Bolus von 50 ml Luft hinzu, um sicherzustellen, dass das gesamte Flüssigkeitsvolumen in der Lunge verteilt ist. Entfernen Sie den Katheter langsam.</li>
	<li>Halten Sie den Oberkörper der Maus 30 s lang in aufrechter Position, um ein Auslaufen der Flüssigkeit aus der Luftröhre zu vermeiden.</li>
	<li>Bei scheinbetriebenen Tieren 50 l steriles PBS intratracheal anstelle von LPS injizieren.</li>
	<li>Buprenorphinhydrochlorid 0,08 mg/kg BW subkutan über den Hals unmittelbar nach DER ALI-Induktion und danach alle 12 h, während der ersten 48 h, in die lose Haut in jizieren.</li>
	<li>Halten Sie eine Körpertemperatur von 37 °C, bis das volle Bewusstsein wiedererlangt wird, indem Sie die Maus auf dem Wärmepad halten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Maus in einen individuell belüfteten Käfig mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Überwachen Sie die Maus regelmäßig. Abnehmende Körpertemperatur und Atemdepression deutet auf eine ordnungsgemäße Induktion von ALI hin.</li>
</ol>2. Blutentnahme, Bronchoalveolar-Lavage, Organentnahme
HINWEIS: Der Zeitpunkt der Einschläfernbildung hängt von der angesprochenen wissenschaftlichen Frage ab. Normalerweise wird es 12-72 h nach LPS-Instillation3,4,9,10durchgeführt. Schweregrad von ALI kann klinisch durch regelmäßige Beobachtung der Körpertemperatur und Atemnot Symptome bestimmt werden11.
<ol><li>Induzieren Sie anästhesie, indem Sie die Maus in eine mit Isofluran überflutete Kammer legen. Verwenden Sie 3 Vol% Isofluran mit einem Sauerstoffstrom von 1 l/min. Stellen Sie eine tiefe Narkose sicher, indem Sie einen taktilen Stimulus induzieren. Bei unzureichender Tiefe der Anästhesie, Erhöhung Isofluran bis zu 5 Vol%.</li>
	<li>Opfern Sie die Maus in tiefer Anästhesie durch atlanto-okzipitale Dislokation.</li>
	<li>Befestigen Sie die Maus mit Klebeband auf einem Operationstisch und desinfizieren Sie das Fell kurz mit 70% Ethanol über dem Bauch. Öffnen Sie die Bauchhöhle vorsichtig in der Medianlinie mit Schere und Pinzette. Entfernen Sie Teile des Darms, um Zugang zur Vena cava inferior (IVC) direkt zur Wirbelsäule und der Bauchaorta zu erhalten.</li>
	<li>Suchen Sie die Nierenvenen und legen Sie eine gebogene 23 G Kanüle, die mit einer 1 ml Spritze verbunden ist, in das IVC direkt unterhalb des Zusammenflusses der Venen ein. Aspirieren Sie 250 l Blut und übertragen Sie es in ein 1,5 ml-Rohr, das mit einer Lösung mit 20 °L 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gefüllt ist. Schütteln Sie sanft, um das EDTA-Mischen zu erleichtern und legen Sie die Röhre auf Eis.</li>
	<li>Für Bronchoalveolar-Lavage (BAL) drei 1 ml Spritzen mit jeweils 0,5 ml sterilem PBS und 0,1 ml Luft vorbereiten. Kurz das Fell des Halses mit 70% Ethanol desinfizieren und die Luftröhre vorsichtig mit Schere und Pinzette aussetzen. Mobilisieren Sie die Luftröhre und wickeln Sie um eine Naht.</li>
	<li>Führen Sie DIE Luftröhre durch: Punktieren Sie die Luftröhre mit einer Mikroschere und legen Sie einen 22 G Venenkatheter auf eine Länge von 20 mm ein. Befestigen Sie den Katheter mit der Naht und instillieren Sie 0,5 ml steriles PBS und 0,1 ml Luft. Die Flüssigkeit nach 60 s ansaugen. Wiederholen Sie den Vorgang mit den zusätzlichen zwei Spritzen und sammeln Sie das gesamte Aspirat in einem 15 ml Schlauch auf Eis.</li>
	<li>Öffnen Sie den Thorax vorsichtig mit Schere und Pinzette, um die Lunge zu ernten. Schneiden Sie die Membran entlang der Kostenrand und schneiden Sie durch die Rippen mit zwei seitlichen Schnitten. Vermeiden Sie vorsichtig, die Lunge zu punktieren. Heben Sie das Brustbein kranich an und fixieren oder entfernen Sie es.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei 10 ml Spritzen mit 37 °C warmem PBS (ohne Kalzium und Magnesium) vor. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den linken Ventrikel. Punktieren Sie den rechten Ventrikel mit einer 26 G Kanüle und spülen Sie die Lungenzirkulation mit dem vorgewärmten PBS. Beachten Sie, dass die Lunge während des Eingriffs blass wird.</li>
	<li>Entfernen Sie den rechten Lappen der Lunge und schneiden Sie ihn in zwei Hälften. Snap-Freeze sie in flüssigem Stickstoff, gefolgt von Langzeitlagerung bei -80 °C für weitere Genexpression und Proteinanalyse.</li>
	<li>Entfernen Sie die gesamte linke Lunge und homogenisieren Sie sie in einer 48-Well-Platte, indem Sie das Gewebe mit Schere und Pinzette zerlegen. Inkubieren Sie das Gewebe in 2 ml Verdauungspuffer [RPMI 1640 mit 10% fetalem Kalbsserum (FCS) und 0,1% NaN3, Kollagenase I (1 mg/ml) und DNase II (7 mg/ml)] bei 37 °C für 60 min. Führen Sie eine weitere Homogenisierung durch sorgfältige Pipettierung der Lungengewebestücke bis und daunen.</li>
</ol>3. Gewebevorbereitung für die FACS-Analyse
<ol><li>Vorbereiten Sie frischen FACS-Puffer (Tabelle 1): verwenden Sie immer kalzium- und magnesiumfreie PBS, um kationabhängige Zell-zu-Zell-Haftung zu reduzieren und Verklumpen zu verhindern. Ergänzung mit FCS (1%) um Zellen vor Apoptose zu schützen, unspezifische Färbungen zu verhindern und zu verhindern, dass Zellen an den FACS-Röhren kleben. Schließen Sie EDTA (0,5 mM) ein, um kationbasierte Zell-zu-Zell-Adhäsion bei der Arbeit mit klebrigen und anhaftenden Zellen wie Makrophagen zu verhindern. Fügen Sie Natriumazid (0,1 %) hinzu, da es bakterielle Kontamination und Photobleichung von Fluorchromen verhindert und Antikörperabwurf blockiert.</li>
	<li>Übertragen Sie die Blutproben (Schritt 2.4) in 5 ml FACS-Röhrchen und mischen Sie das Blut vorsichtig mit 2 ml roter Blutzelllysepuffer. Legen Sie die Rohre auf Eis und beenden Sie die Reaktion nach 2 min durch Zugabe von 2 ml eiskaltem PBS. Zentrifugieren Sie die Proben für 5 min bei 400 x g und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet mit 60 L FACS-Puffer und Prozess für nachfolgende FACS-Färbung gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen12wieder aus. HINWEIS: Timing der Euthanaverisierung der Maus beeinflusst Leukozytenzahl als Teil der systemischen Entzündung. Daher wird empfohlen, die Zellzahl in diesem Schritt auf 1 x 106 Zellen/60 l einzustellen, um die besten Färbeergebnisse für die Durchflusszytometrieanalyse zu erzielen.</li>
	<li>Zentrifuge BAL-Flüssigkeit (Schritt 2.6) für 5 min bei 400 x g. Den Überstand ansaugen und in flüssigem Stickstoff einfrieren, gefolgt von einer Langzeitlagerung bei -80 °C für weitere Proteinanalysen. Bal-Zellpellet mit 2 ml kaltem FACS-Puffer resuspendieren und die Suspension dann mit einem 100-m-Netzfilter in ein 5 ml FACS-Rohr übertragen, um die Haare zurückzuhalten.</li>
	<li>Wiederum zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 400 x g. Setzen Sie das Pellet mit 60 L FACS-Puffer und Prozess für nachfolgende FACS-Färbung nach zuvor beschriebenen Protokollen12aus. HINWEIS: Timing der Euthanaverisierung der Maus beeinflusst Leukozytenzahl in BAL als Teil der Entzündung. Daher wird empfohlen, die Zellzahl in diesem Schritt auf 1 x 106 Zellen/60 l einzustellen, um die besten Färbeergebnisse für die Durchflusszytometrieanalyse zu erzielen.</li>
	<li>Übertragen Sie das verdaute linke Lungengewebe (Schritt 2.10) in ein 5 ml FACS-Rohr mit einem 100-L-Netzfilter, um Klumpen zu extrahieren und den Verdauungsprozess zu beenden, indem 2 ml eiskalter FACS-Puffer hinzugefügt werden. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 400 x g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 60 L FACS-Puffer und Prozess für nachfolgende FACS-Färbung gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen12wieder ab. HINWEIS: Timing der Euthanaverisierung der Maus beeinflusst Die Leukozytenzahl im Lungengewebe als Teil der Entzündung. Daher wird empfohlen, die Zellzahl auf 1 x 106 Zellen/60 -L anzupassen, um die besten Färbeergebnisse für die Durchflusszytometrieanalyse zu erzielen.</li>
	<li>Für die FACS-Analyse inkubieren Zellen mit CD16/CD32-Antikörper bei 4 °C für 15 min, um die unspezifische Bindung von Immunglobulin an die Fc-Rezeptoren zu blockieren. Fügen Sie 1 x 10 6 Zellen in 60 l in einem 5 ml-Rohr zu 1x 106 Zellen hinzu.</li>
	<li>Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen Master-Mix mit FACS-Puffer und Antikörpern vor, wie in Tabelle 2beschrieben.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen nach dem Blockieren nicht. Fügen Sie 20 l Antikörper-Master-Mix pro Probe hinzu, um ein Endvolumen von 100 l zu erhalten. Inkubieren Sie die Proben für 20 min im Dunkeln bei 4 °C.</li>
	<li>Waschen Sie jede Probe mit 1 ml FACS Puffer und Zentrifuge für 5 min bei 400 x g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit FACS-Puffer auf die entsprechende Zellkonzentration für FACS-Messungen aus. HINWEIS: Es wird eine Zellzahl von 1 x 106 Zellen/500 l vorgeschlagen, um die besten Immun-Phänotypisierungsergebnisse in der FACS-Analyse mit diesem Protokoll zu erzielen. Es wird jedoch empfohlen, Antikörper einzeln zu titrieren.</li>
	<li>Falls erforderlich, fügen Sie Live/Dead Färbung vor der Oberflächenfärbung mit spezifischen handelsüblichen Kits8hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie schließlich feste Anzahl von kommerziell erhältlichen fluorchromgekoppelten Kalibrierperlen (3 x 105 Perlen in 20 L FACS-Puffer) zu jeder Probe hinzu, um absolute Zellzahlen12zu bestimmen. Die Gating-Strategie für Blut-, BAL- und Gewebezellen ist in Abbildung 2dargestellt.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Minimale Invasivität, einfache Handhabung und gute Reproduzierbarkeit sind die Hauptmerkmale des vorgestellten Ansatzes, ALI in einem kleinen Nagetiermodell zu induzieren. Die Verwendung von LPS anstelle ganzer Bakterien in Tiermodellen hat Vorteile. Es ist eine stabile und reine Verbindung und kann in lyophilisierter Form bis zur Verwendung gespeichert werden. Es ist ein starkes Stimulans für angeborene Immunantworten über den TLR4-Signalweg, und seine biologische Aktivität kann leicht quantifiziert werden, was die Titr...

Experimentelle Tiermodelle sind in der Grundlegenden Immunforschung unverzichtbar. Die Verabreichung ganzer Bakterien oder mikrobieller Komponenten wurde häufig in Kleintiermodellen verwendet, um lokale oder systemische Entzündungen auszulösen1. Lipopolysaccharid (LPS, oder bakterielles Endotoxin) ist eine Zellwandkomponente und Oberflächenantigen von gramnegativen Bakterien (z. B. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., oder Legionella spp.). Das thermostabile und große Molekül (Molekulargewicht 1-4 x 106 kDa) besteht aus einem Lipidanteil (Lipid A), einem Kernbereich (Oligosaccharid) und einem O-Polysaccharid (oder O-Antigen). Lipid A mit seinen hydrophoben Fettsäureketten verankert das Molekül in einer bakteriellen Membran und vermittelt (nach Abbau von Bakterien) die immunologische Aktivität und Toxizität von LPS. Nach Bindung an das LPS-Bindungsprotein (LBP) ligaieren LPS:LBP-Komplexe den CD14/TLR4/MD2-Rezeptorkomplex, der sich auf der Oberfläche vieler Zelltypen befindet, was eine starke proinflammatorische Reaktion bei NF-B-Kerntranslokation und anschließender Upregulation zytokinexpression2.
Akute Lungenverletzung (ALI) ist definiert als akute hypoxemische Ateminsuffizienz mit bilateralem Lungenödem ohne Herzinsuffizienz3. Atemwegsverwaltung von LPS ist ein üblicher Weg, um Lungenentzündung und ALI4,5,6,7zu induzieren. Obwohl die sterile Substanz nicht geeignet ist, pharmakologische Interventionen bei Infektionskrankheiten zu untersuchen, können mechanistische immunologische Fragen mit ausreichender Genauigkeit beantwortet werden. Die Instillation von LPS in die Luftröhre induziert eine robuste Entzündungsreaktion mit Leukozyten-Invasion, Upregulation von proinflammatorischen Zytokinen und Störung der Alveolo-Kapillarbarriere innerhalb von Stunden bis Tagen, abhängig von der LPS-Dosierung3, 6,7.
Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ALI bei Mäusen durch intratracheale LPS-Instillation zu induzieren. Das Modell wurde durch die Bewertung der Zytokinexpression, der neutrophilen Granulozyteninvasion und der intraalveolaren Albumin-Leckage wie zuvor beschrieben8validiert.

<table><tbody><tr><td>1 ml Spritzen</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Spritzen</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115 (c-fms) APC</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>17-1152-80</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>11-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>48-0451-82</td> Anti-F4/80 <td></td></tr><tr><td>(BM-8) - PE Cy7</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>25-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>552093</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>45-5932-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td><td>Bio Legend, San Diego, CA</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin hydrochloride</td><td>Indivior UK Limited, Berkshire, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse, weiblich, 10 - 12 Wochen alt</td><td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaliBRITE APC-Kügelchen (6&micro; m)</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>340487</td><td></td></tr><tr><td>Canula 23 Gauge 1''BD</td><td>, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Canula 26 Gauge 1/2''</td> <td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 70 & Mikro; m</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ I</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>1148089</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease II</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D8764&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), steril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, steril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>FACS Röhrchen, 5 ml</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland</td><td>551579</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter, Unterschlei&szlig; heim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid</td><td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS) aus Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>L23101</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block&Handel;), Klon 2.4G2</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640, mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>Schläuche</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>Venenkatheter, 22 Gauge</td><td>B.Braun, Melsungen, Deutschland</td><td>4268091B</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin Hydrochlorid</td><td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induzieren akute lungenschädigung bei mäusen durch direkte intratracheale lipopolysaccharid-instillation

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Die Atemwegsverabreichung von Lipopolysaccharid (LPS) ist eine häufige Möglichkeit, Lungenentzündungen und akute Lungenverletzungen (ALI) in Kleintiermodellen zu untersuchen. Es wurden verschiedene Ansätze beschrieben, wie das Einatmen von aerosolisiertem LPS sowie die nasale oder intratracheale Instillation. Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ALI bei Mäusen durch direkte intratracheale LPS-Instillation zu induzieren und FACS-Analysen von Blutproben, Bronchoalveolader-Flüssigkeit (BAL) und Lungengewebe durchzuführen. Nach intraperitonealer Sedierung wird die Luftröhre exponiert und LPS wird über einen 22 G Venenkatheter verabreicht. Eine robuste und reproduzierbare Entzündungsreaktion mit Leukozyten-Invasion, Upregulation von proinflammatorischen Zytokinen und Störung der Alveolo-Kapillarbarriere wird innerhalb von Stunden bis Tagen induziert, abhängig von der verwendeten LPS-Dosierung. Die Entnahme von Blutproben, BAL-Flüssigkeit und Lungenernte sowie die Verarbeitung für die FACS-Analyse werden im Protokoll ausführlich beschrieben. Obwohl die Verwendung des sterilen LPS nicht geeignet ist, pharmakologische Interventionen bei Infektionskrankheiten zu untersuchen, bietet der beschriebene Ansatz minimale Invasivität, einfache Handhabung und gute Reproduzierbarkeit, um mechanistische immunologische Fragen zu beantworten. Darüber hinaus ermöglichen die Dosistitration sowie die Verwendung alternativer LPS-Präparate oder Mausstämme die Modulation der klinischen Wirkungen, die unterschiedliche Ali-Schweregrade oder einen frühen vs. späten Beginn von Krankheitssymptomen aufweisen können.

Der beschriebene Ansatz zur Induzieren von ALI bei Mäusen wurde durch die Beurteilung der Zytokinexpression, der Neutrophilen Granulozyteninfiltration und der Alveolo-Kapillarbarrierestörung 24 h und 72 h nach LPS-Instillation validiert. PBS-injizierte Tiere dienten als Kontrolle. Die intratracheale LPS-Verabreichung induzierte eine robuste pulmonale proinflammatorische Reaktion. Die Expression von TNF-A im Lungengewebe wurde signifikant hochreguliert und erreichte eine nachhaltige und mehr als 50-fache Zunahme im Vergle...

Hier wird ein Schrittweiseverfahren vorgestellt, um akute Lungenverletzungen bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation zu induzieren und FACS-Analysen von Blutproben, Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit und Lungengewebe durchzuführen. Minimale Invasivität, einfache Handhabung, gute Reproduzierbarkeit und Titration der Schwere der Erkrankung sind Vorteile dieses Ansatzes.

Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Zuverlässige Tiermodelle sind entscheidende Bestandteile der Grundlagenforschung. Unser muriner Ansatz ermöglicht die Beantwortung immunologischer Fragen zur Mechanistik und Kinetik der entwicklung akuter Lungenverletzungen bei Säugetieren. Minimale Invasivität, einfache Handhabung sowie gute Reproduzierbarkeit sind die Hauptvorteile dieser Technik.Darüber hinaus können wir mit Dosistitration die klinische Wirkung modulieren. Diese Technik spiegelt die klinische Situation von Patienten mit schweren Lungenverletzungen wider und ermöglicht es, die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Lipolpolysaccharid oder LPS in Aliquots bei einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter bei minus 20 Grad Celsius lagern.Zur intratrachealen Instillation das aufgetaute LPS in steriler Phosphat-gepufferter Saline auf eine Endkonzentration von 2.000 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Schneiden Sie einen 22-Spur-Venenkatheter auf eine Länge von 20 Millimetern. Platzieren Sie die Maus in der anfälligen Position auf einem temperaturgeregelten Tisch, um eine Körpertemperatur von 37 Grad Celsius zu halten.Nach der Anästhesie, wie im Textprotokoll beschrieben, verwenden Sie steriles ophthalmologisches Schmiermittel, um das Austrocknung sikulierender Hornhäuten unter Anästhesie zu verhindern. Heben Sie den Kopf und Haken Schneidezähne auf einem horizontalen Balken etwa fünf Zentimeter über dem Tisch positioniert, während die Vorpaws in engem Kontakt mit dem Tisch bleiben. Super-Extend den Hals in einem 90-Grad-Winkel relativ zum Tisch.Legen Sie eine kalte Lichtquelle auf die Haut über dem Kehlkopf, um die Stimmbänder zu visualisieren und auf die Luftröhre zu zielen. Halten Sie die Zunge mit Zange, um die Kehle für einfachere Intubationsbedingungen zu begradigen. Die richtige Visualisierung und Identifizierung des Kehlkopfes ist entscheidend, um eine korrekte intratracheale Platzierung des Katheters zu gewährleisten.Eine externe Kaltlichtquelle hilft dabei. Setzen Sie den Katheter ca. 10 Millimeter in die Luftröhre ein. Stellen Sie sicher, dass die Einfügung nicht zu tief ist, da dies zu einer einseitigen Instillation von Flüssigkeit in den rechten oder linken Hauptbronchus führt.Wenn Widerstand des Kehlkopfes auftritt, ziehen Sie den Katheter ein paar Millimeter zurück, bevor Sie wieder vorrücken. Injizieren Sie nun das LPS-verdünnte MPBS mit einer Pipette. Das injizierte Volumen hängt vom Körpergewicht der Maus ab.Schließen Sie eine Spritze an und fügen Sie einen Bolus von 50 Mikroliter Luft hinzu, um sicherzustellen, dass das gesamte Flüssigkeitsvolumen in der Lunge verteilt ist. Entfernen Sie den Katheter langsam. Halten Sie den Oberkörper der Maus 30 Sekunden lang in aufrechter Position, um ein Auslaufen der Flüssigkeit aus der Luftröhre zu vermeiden.Befestigen Sie die eingeschläferte Maus mit Klebeband auf einem Operationstisch und desinfizieren Sie das Fell kurz mit 70% Ethanol über dem Bauch. Öffnen Sie die Bauchhöhle vorsichtig in der Medianlinie mit Schere und Pinzette. Entfernen Sie Teile des Darms, um Zugang zur Vena cava minderwertiges Recht auf die Wirbelsäule in der Bauchaorta zu erhalten.Suchen Sie die Nierenvenen und legen Sie eine gebogene Kanüle mit 23 Messgeräten, die mit einer Ein-Milliliter-Spritze verbunden ist, in die Vena cava inferior, direkt unterhalb des Zusammenflusses der Venen, ein. 250 Mikroliter Blut ansaugen und in ein 1,5-Milliliter-Rohr mit 20 Mikrolitern 0,5-Mol-EDTA-Lösung übertragen. Schütteln Sie sanft, um das EDTA-Mischen zu erleichtern und legen Sie die Röhre auf Eis.Für bronchoalveolare Spülung drei Ein-Milliliter-Spritzen mit jeweils 0,5 Millilitern sterilem PBS und 0,1 Milliliter Luft vorbereiten. Das Fell des Halses mit 70% Ethanol desinfizieren und die Luftröhre vorsichtig mit Schere und Pinzette aussetzen. Mobilisieren Sie die Luftröhre und wickeln Sie eine Naht um sie.Punktieren Sie die Luftröhre mit mikroscheren und legen Sie einen 22-Spur Venenkatheter, geschnitten auf eine Länge von 20 Millimetern. Fixieren Sie den Katheter mit einer Naht und instillieren Sie 0,5 Milliliter steriles PBS und 0,1 Milliliter Luft. Die Flüssigkeit nach 60 Sekunden ansaugen.Wiederholen Sie den Vorgang mit den zusätzlichen zwei Spritzen und sammeln Sie das gesamte Aspirat in einem 15 Milliliter Rohr auf Eis. Öffnen Sie den Thorax vorsichtig mit Schere und Pinzette, um die Lunge zu ernten. Schneiden Sie die Membran entlang der Kostenrand und schneiden Sie durch die Rippen mit zwei seitlichen Schnitten.Vermeiden Sie vorsichtig, die Lunge zu punktieren. Heben Sie das Brustbein kranich an und fixieren oder entfernen Sie es. Bereiten Sie zwei 10 Milliliter Spritzen mit warmen, 37 Grad Celsius PBS vor.Machen Sie einen kleinen Schnitt in den linken Ventrikel. Punktieren Sie den rechten Ventrikel mit einer 26-Spur-Kanüle. Dann spülen Sie die Lungenzirkulation mit einem vorgewärmten PBS.Beachten Sie, dass die Lunge während des Eingriffs blass wird. Entfernen Sie den rechten Lappen der Lunge und schneiden Sie ihn in Die Hälften. Snap frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein, gefolgt von einer Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius für weitere Genexpression und Proteinanalyse.Entfernen Sie die gesamte linke Lunge und homogenisieren Sie sie in einer 48-Well-Platte, indem Sie das Gewebe mit Schere und Pinzette zerlegen. Inkubieren Sie das Gewebe in zwei Milliliter Verdauungspuffer bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Führen Sie eine weitere Homogenisierung durch sorgfältiges Pipettieren der Lungengewebestücke nach oben und unten durch.Übertragen Sie die Blutproben in fünf Milliliter FACS-Röhrchen und mischen Sie das Blut vorsichtig mit zwei Millilitern roter Blutzelllysepuffer. Legen Sie die Rohre auf Eis und beenden Sie die Reaktion nach zwei Minuten, indem Sie zwei Milliliter eiskalte PBS hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Probe für fünf Minuten bei 400 mal g und entsorgen Sie den Überstand.Setzen Sie das Zellpellet mit 60 Mikroliter FACS Puffer und Prozess für die nachfolgende FACS Färbung nach zuvor beschriebenen Protokollen aus. Zentrifuge BAL-Flüssigkeit für fünf Minuten bei 400-fachem g. Den Überstand ansaugen und in flüssigem Stickstoff einfrieren, gefolgt von einer Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius für weitere Proteinanalysen.Nach dem Wiederaufsetzen des BAL-Zellpellets mit zwei Milliliterkaltem FACS-Puffer, übertragen Sie die Suspension in ein fünf Milliliter FACS-Rohr mit einem 100-Mikron-Netzfilter, um Haare zurückzuhalten. Nach der erneuten Zentrifugierung der Probe das Pellet mit 60 MikroliterFACS-Puffer wieder aufsetzen und für die nachfolgende FACS-Färbung nach zuvor beschriebenen Protokollen verarbeiten. Übertragen Sie nun das verdaute linke Lungengewebe in ein FACS-Rohr mit fünf Millilitern, indem Sie einen 100-Mikron-Netzfilter verwenden, um Klumpen zu extrahieren.Beenden Sie den Verdauungsprozess, indem Sie zwei Milliliter eiskalten FACS-Puffer hinzufügen, bevor Sie die Probe fünf Minuten lang bei 400 mal g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 60 MikroliterFACS-Puffer und Prozess für nachfolgende FACS-Färbung nach zuvor beschriebenen Protokollen wieder aus. Für eine FACS-Analyse fügen Sie 20 Mikroliter CD16/CD32-Antikörperblockierungslösung zu 60 Mikroliter Zellen in einer Fünf-Milliliter-Röhre hinzu.Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um die unspezifische Bindung von Immunglobulin an die Fc-Rezeptoren zu blockieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen Master-Mix mit FACS-Puffer und Antikörpern vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie die Zellen nach dem Blockieren nicht.Fügen Sie 20 Mikroliter Antikörper-Master-Mix pro Probe hinzu, um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern zu erhalten. Inkubieren Sie die Proben für 20 Minuten, im Dunkeln, bei vier Grad Celsius. Waschen Sie jede Probe wie bisher mit einem Milliliter FACS-Puffer und Zentrifuge.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit FACS-Puffer auf die entsprechende Zellkonzentration für FACS-Messungen aus. Fügen Sie schließlich jede Probe feste Anzahl kommerziell erhältlicher fluorchromgekoppelter Kalibrierperlen hinzu, um absolute Zellzahlen zu bestimmen. Führen Sie die Durchflusszytometrie mithilfe der im Textprotokoll für Blut-, BAL- und Gewebezellen gezeigten Gating-Strategie durch.24 sowie 72 Stunden nach intratrachealer Instillation wurde die Expression von TNF-alpha im Lungengewebe signifikant hochreguliert und erreichte einen anhaltenden und mehr als 50-fachen Anstieg im Vergleich zu den Kontrolltieren. Leukozyten-Invasion in Gewebe und Alveolarraum ist ein Kennzeichen und charakteristisch für die Entwicklung von akuten Lungenverletzungen. Die FACS-Analyse ergab eine signifikante Infiltration von neutrophilen Granulozyten in das Lungeninterstitium, wobei sich die absolute Zellzahl im Vergleich zu den Kontrollen nach 24 Stunden fast verneunfacht hat.Die absolute neutrophile Granulozytenzahl ging nach 72 Stunden leicht zurück, der Faktoranstieg im Vergleich zu den Kontrollen blieb jedoch bestehen. In Übereinstimmung mit der interstitiellen neutrophilen Granulozyteninfiltration wurde die MMP-9-Expression im gesamten Lungengewebe ebenfalls über den gesamten Beobachtungszeitraum signifikant erhöht. Neutrophile Granulozyten wurden nicht nur im Lungengewebe, sondern auch in der BAL-Flüssigkeit erhöht.Der Faltenzuwachs im Vergleich zu Kontrolltieren war ausgeprägter als im Lungengewebe. Lungenödeme aufgrund einer schweren Beeinträchtigung der Alveolokapillarbarriere ist pathognomononisch für die Entwicklung einer akuten Lungenverletzung. Die Analyse des Albumengehalts in BAL-Flüssigkeit durch ELISA ergab einen signifikanten Verlust der Barrierefunktion nach 24 Stunden und 72 Stunden nach der LPS-Instillation.Die richtige Katheterplatzierung ist für die bilaterale Instillation von LPS von entscheidender Bedeutung. Oft deuten Veränderungen der Atemwege, wie Husten oder Vergasen, auf eine korrekte intratracheale Instillation der Flüssigkeit hin. Nach der Induktion einer akuten Lungenverletzung können eine Reihe von Folgeschritten durchgeführt werden, wie z.B. FACS-Analyse, PCR, ein Proteinnachweis, um die jeweiligen Forschungsfragen zu beantworten.

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Forschung

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Medizin

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Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

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