Name: Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Erfahren Sie optisches Clearing und 3D-Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe mit Ethylzimtat und konfokaler Mikroskopie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Visualisierung großer Strukturen in transparenten Organen.

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T. S. wird durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG (332853055), der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) und der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen (RWTH Returner Program) unterstützt. Unterstützt wird V. G. P. durch Forschungsstipendien der Deutschen Gesellschaft fur Nephrologie, der Alexander von Humboldt-Stiftung und des National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E wird von der Fondation LeDucq unterstützt. Gefördert wird R. K. durch Stipendien der DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), des Landes Nordrhein-Westfalen (MIWF-NRW) und des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung der RWTH Aachen (O3-11).

HINWEIS: Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, USA, und den zuständigen lokalen Behörden in Aachen, Deutschland, genehmigt.
1. Retrograde Abdominalaortische Perfusion und Fixierung von Mausnieren
<ol><li>Bereiten Sie Lösungen am selben Tag oder Abend vor und lagern Sie in einem Kühlschrank über Nacht. Warme Lösungen auf Raumtemperatur (RT) vor der Verwendung.</li>
	<li>
Machen Sie eine frische Charge von 3% Paraformaldehyd (PFA) in 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Pro Maus werden ca. 50-100 ml PFA benötigt.
	<ol>
<li>Um 1 L von 3% PFA zu machen: Wiegen Sie 30 g PFA und fügen Sie 800 ml destilliertes Wasser in die Dunstabzugshaube. Auf 50-60 °C umrühren und erhitzen. Nicht über 70 °C erhitzen. VORSICHT: PFA ist giftig. Bereiten Sie PFA in der Dunstabzugshaube vor.</li>
		<li>Fügen Sie langsam mehrere Tropfen 2N NaOH hinzu. Warten Sie ein paar Minuten, bis PFA in die Lösung geht, oder fügen Sie ein paar tropfenweitere hinzu. Einige kleine Brocken lösen sich nicht auf.</li>
		<li>Entfernen Sie die Lösung von der Hitze. Fügen Sie 50 ml von 20x PBS hinzu. Chill auf Eis zu RT.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7.3-7.4 mit HCl ein. Destilliertes Wasser auf 1 L hinzufügen.</li>
		<li>Entfernen Sie alle ungelösten Partikel, indem Sie 1x PBS und 3% PFA mit 0,22 m Filter filtern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 1.000 Einheiten Heparin zu 1 L von 1x PBS hinzu. 1x PBS mit Heparin und 3% PFA in 1x PBS in separate 50 ml Kunststoffspritzen geben. HINWEIS: Falls vorhanden, können druckgesteuerte Pumpen mit 80-100 mmHg oder hydrostatischem Druck (Tropfmethode, die Höhe der Perfusionslösungen: 160-200 cm über dem Tier) zur Nierenperfusion verwendet werden.</li>
	<li>Schließen Sie die PBS, PFA und eine abgestumpfte 21 G Schmetterlingsnadel an einen Drei-Wege-Hahn an. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im gesamten System befinden.</li>
	<li>Beschriften Sie ein 15 ml kegelförmiges Rohr und geben Sie 10 ml PFA hinein.</li>
	<li>Tief anästhesieren eine männliche oder weibliche C57BL/6 Maus 12-24 Wochen alt mit 120 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 16 mg/kg Körpergewicht Xylazin. Das Tier muss vor der Operation auf völlige Reaktionsfähigkeit überprüft werden, indem die Reflexe eingeklemmt werden (z. B. Zehen-Pinch-Reflex).</li>
	<li>Sobald das Tier eine chirurgische Anästhesieebene erreicht hat, legen Sie es auf den Rücken unter das Sezieren des Mikroskops. Öffnen Sie den Bauch mit einem Mittellinien-Bauchschnitt mit einer Operationsschere und belichten Sie die Bauchaorta.</li>
	<li>Klemmen Sie die Bauchaorta direkt über der Verzweigung zur Iliasarterie mit einem gekrümmten Hämostat. Dann klemmen Sie die Bauchaorta direkt unter den Nierenarterien mit einem Mikroserrefin. Machen Sie einen kleinen Schnitt (1 mm) auf der Bauchaorta zwischen den beiden Klemmen mit Vannas Schere. Setzen Sie die Schmetterlingsnadel langsam in den Einschnitt ein und achten Sie darauf, die Bauchaorta nicht zu reißen.</li>
	<li>Ligate die rechte Nierenarterie mit einer 5-0 Seidennaht und entfernen Sie die rechte Niere für andere Analysen, wenn nur eine Niere für Perfusion und Fixierung benötigt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie die Mikroserrefin, transsektieren Sie die Portalvene mit der Vannasschere und durchdringen Sie sofort mit 50 ml PBS, die Heparin enthalten, und wechseln Sie sie dann mit 50 ml 3% PFA. HINWEIS: Hoher Perfusionsdruck durch Abdominalaorta ist erforderlich, um Renaltubuli für eine bessere Antikörperdiffusion durch Gewebe zu öffnen. Perfusion durch Herz kann nicht Nierentubuli öffnen.</li>
	<li>Sammeln Sie die durchnässte Niere sorgfältig und vermeiden Sie das Durchkreuzen oder Drücken des Gewebes.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kapsel und schneiden Sie die Niere in 1 mm dicke koronale Scheiben. Verwenden Sie eine Slicermatrix (Materialtabelle), um die Schnittdicke zu standardisieren. HINWEIS: Alternativ sollten Sie ein Vibratome verwenden.</li>
	<li>Die Nierenscheiben mit dem vorbereiteten PFA in das beschriftete 15 ml konische Rohr eintauchen.</li>
	<li>10 ml PFA in ein anderes beschriftetes 15 ml konisches Rohr geben. Spülen Sie den Drei-Wege-Hahn und die Schmetterlingsnadel mit PBS, bevor Sie zur nächsten Maus wechseln.</li>
	<li>Führen Sie die Post-Fixierung über Nacht bei RT vor Licht geschützt durch.</li>
</ol>2. Gewebevorbereitung und Immunostainierung
<ol><li>Nach der Nachfixierung die Nierenscheibe zweimal mit 1x Waschpuffer(Materialtabelle) für 1 h auf einer horizontalen Wippe bei RT waschen.</li>
	<li>Führen Sie Antigen-Retrieval durch. 300 ml 1x Antigen-Entlarmungslösung(T-materialfähig) in einem 500 ml Becher auf 92-98 °C erhitzen. Die Scheibe in einbettbarer Einbettkassette unter Rühren für 1 h bei 92-98 °C einschließen. Entfernen Sie das Becherglas von der Hitze und lassen Sie es zu RT abkühlen. HINWEIS: Einige Anbieter testen ihre Antikörper für die Anwendung der Immunhistochemie und werden eine vorgeschlagene Antigen-Abrufmethode in das Datenblatt aufnehmen. Daher können einige Epitope einen grundlegenderen Puffer erfordern (z. B. pH 9).</li>
	<li>Die Scheibe in 10 ml 1x Waschpuffer mit 0,1% Triton X-100 geben und über Nacht bei RT schaukeln. 2x mit 10 ml frischem 1x Waschpuffer für 1 h am nächsten Tag waschen.</li>
	<li>Verdünnen Sie den primären Antikörper in 500 l normales Antikörperverdünnungsmittel (Materialtabelle). Beginnen Sie mit einer Konzentration von 1:50-1:100. Die Nierenscheibe in verdünntem Primärantikörper für 4 d bei 37 °C vorsichtig schaukeln. HINWEIS: Da jeder Antikörper einzigartige Eigenschaften hat, müssen die Temperatur während der Antikörperinkubation und Verdünnungen von Antikörpern für einzelne Sonden optimiert werden. Für sekundäre Antikörper-only-Kontrollen, inkubieren Nierengewebe in Verdünnerohne ohne primären Antikörper. Anstelle von kommerziellem Antikörperverdünnungsmittel können 1x PBS mit 0,1% Triton X-100 und 0,01% Natriumazid verwendet werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Nierenscheibe in 10 ml 1x Waschpuffer über Nacht bei RT mit einem Wechsel des Waschpuffers nach 8 h.</li>
	<li>Verdünnen Sie die sekundären Antikörper (z. B. 1:100 für Alexa Fluorkonjugierte Sekundärantikörper) in 500 l normaler Antikörperverdünnung. Die Nierenscheiben in verdünnten Sekundärantikörpern 4 Tage lang bei 37 °C inkubieren. Von diesem Schritt an, schützen Sie die Nierenscheiben vor Licht.</li>
	<li>Waschen Sie die Nierenscheiben in 10 ml 1x Waschpuffer über Nacht bei RT mit einem Wechsel des Waschpuffers nach 8 h.</li>
</ol>3. Gewebe-Clearing
<ol><li>Nierenscheibe auf 5 ml hochwertiges 100% Ethanol (Materialtabelle) für 2 h bei RT mit sanftem Schaukeln (mit einer Änderung auf frisches Ethanol nach 1 h) übertragen. Dieser Schritt ist für Gewebedehydrierung. HINWEIS: Hochgradig Ethanol ist erforderlich, um im nächsten Schritt eine hohe Gewebetransluzenz zu erreichen. Methanol oder Tetrahydrofuran sind alternative Dehydrierungsreagenzien mit hohem Delipidationspotenzial.</li>
	<li>Nierenscheibe in 2 ml ECi (Materialtabelle) mit sanftem Schaukeln bei RT (mit einer Änderung auf frischen ECi nach 2 h) über Nacht eintauchen. HINWEIS: Der Gefrier-/Schmelzpunkt von ECi beträgt 6-8 °C. Bewahren Sie daher Proben nicht im Kühlschrank auf. Führen Sie das Eintauchen in eine richtig belüftete Dunstabzugshaube und vermeiden Sie direkten Kontakt mit Kleidung und Haut (ECi ist eine ungiftige, von der Food and Drug Administration zugelassene Verbindung, hat aber einen starken Geruch). Verwenden Sie normale Eppendorf-Rohre oder Glasgefäße (keine Polystyrolgefäße).</li>
	<li>Die Gewebetransluzenz kann nach dem ECi-Eintauchen und wenn die Nierenscheiben für die Bildgebung bereit sind, erreicht werden.</li>
</ol>4. KonfokaleImaging- und Bildanalyse
HINWEIS: Für die Bildgebung können andere Mikroskopietechniken eingesetzt werden, solange die Refractive Index Matching-Lösung mit der Objektivlinse kompatibel ist. Dieses Protokoll verwendet ein invertiertes konfokales Mikroskop.
<ol><li>Fügen Sie 600-1.000 l ECi in die Glasbodenschale(Materialtabelle ). HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von regulären Zellkultur-Gerichte, weil ECi ist ein organisches Lösungsmittel, das die Kunststoff-Gerichte auflösen wird. Ebenso kann ECi Kunststoffteile/Isolierringe auf Objektive angreifen. Eine Übersicht über kompatible Bildgebungsgeschirre30 und selbstgefertigte 3D-Druckkammern finden Sie in den entsprechenden Berichten28.</li>
	<li>Die transluzente Nierenscheibe in die Schale geben. Legen Sie einen runden Deckelaufstrich auf die Nierenscheibe, um leichten Druck auf den Glasboden auszuüben. Versiegeln Sie die Schale mit Paraffinfolie (Tabelleder Materialien), um Leckagen von ECi zu vermeiden. HINWEIS: Ganze Organe oder mehrere Millimeter dicke Gewebescheiben können einen Rand (Dentalzement oder Silikonelastomer; siehe Tabelle derMaterialien) um das Gewebe erfordern, um einen ECi-Pool für die Probe zu bilden.</li>
	<li>Legen Sie die Schale auf die Mikroskop-Bildplattform.</li>
	<li>Nehmen Sie mehrere Z-Stacks und führen Sie Nähte durch. Beginnen Sie mit einer Z-Schritt-Größe von 5 m. HINWEIS: Erwägen Sie die Verwendung von Zielen mit langer Arbeitsdistanz (>5 mm) und hoher numerischer Blende (>0,9) für die Abbildung sehr dicker Gewebescheiben oder Organe. Nach der Bildgebung das Gewebe wieder in Ethanol übertragen und im Waschpuffer oder PBS mit 0,02% Natriumazid lagern.</li>
	<li>Analysieren Sie das Bild mit 3D-Rendering mit Software (Tabelle der Materialien).</li>
</ol>

<ol><li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li>
<li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li>
<li>Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+podocyte+depletion%3A+theoretical+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations.</a> Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).</li>
<li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+can+see+clearly+now%3A+optical+clearing+and+kidney+morphometrics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C2%27-thiodiethanol%3A+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li>
<li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).</li>
<li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li>
<li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+%28in+press%29%22%5BJournal%5D)">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li>
<li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li>
<li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).</li>
<li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li>
<li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li>
<li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Optische Clearing-Techniken haben große Aufmerksamkeit für die 3-D-Visualisierung und Quantifizierung der Mikroanatomie in verschiedenen Organen erhalten. Hier wurde die lösungsmittelbasierte Clearing-Methode (ECi) mit der Immunolabelierung zur 3-D-Bildgebung ganzer Tubuli in Nierenscheiben kombiniert. Diese Methode ist einfach, kostengünstig und schnell. Andere Forschungsfragen können jedoch am besten mit anderen Clearingprotokollen beantwortet werden5. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass lösun...

Das wachsende Interesse an der Untersuchung ganzer Organe oder großer mehrzelliger Strukturen hat zur Entwicklung optischer Clearingmethoden geführt, die die Abbildung von transparentem Gewebe in drei Dimensionen beinhalten. Bis vor kurzem waren die besten Methoden zur Schätzung der Zellzahl, -länge oder des Volumens ganzer Strukturen die Stereologie oder die erschöpfende serielle Schnitte, die auf der systemischen Probenahme von Gewebe für die nachfolgende Analyse in zwei Dimensionen basiert1, 2 , 3. Diese Methoden sind jedoch zeitaufwändig und benötigen ein hohes Maß an Ausbildung und Fachwissen4. Optische Clearing-Methoden überwinden diese Probleme, indem sie den Brechungsindex in einer Probe ausdematrieren, um Gewebe transluzent für die 3D-Bildgebung5,6,7zu machen.
Es wurden mehrere optische Clearing-Methoden entwickelt, die in zwei Hauptkategorien unterteilt sind: lösemittelbasierte und wässrige Methoden. Wässrige Methoden können weiter unterteilt werden in einfaches Eintauchen8,9, Hyperhydration10,11und Hydrogel einbetten12,13. Lösemittelbasierte Methoden dehydrieren das Gewebe, entfernen Lipide und normalisieren den Brechungsindex auf einen Wert um 1,55. Einschränkungen der meisten lösungsmittelbasierten Methoden sind das Abschrecken der endogenen Fluoreszenz von häufig verwendeten Reporterproteinen wie GFP, Lösungsmitteltoxizität, die Fähigkeit, Klebstoffe aufzulösen, die in einigen Bildkammern oder Objektivlinsen verwendet werden, und die Schrumpfung von Gewebe während der Austrocknung14,15,16,17,18,19,20,21. Lösemittelbasierte Methoden sind jedoch einfach, zeitsparend und können in einer Reihe von verschiedenen Gewebetypen funktionieren.
Wässrige Methoden basieren auf dem Eintauchen des Gewebes in wässrige Lösungen, die Brechungsindizes im Bereich von 1,38-1,528,11,12,22,23,24 haben . Diese Methoden wurden entwickelt, um die emission von endogenen fluoreszierenden Reportern zu erhalten und dehydrationsinduzierte Schrumpfung zu verhindern, aber die Einschränkungen der meisten wässrigen Clearingmethoden umfassen eine längere Dauer des Protokolls, Gewebeausdehnung und Proteinmodifikation (d.h. partielle Denaturierung von Proteinen durch Harnstoff in hyperhydrierenden Protokollen wie ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS adressierte Gewebeexpansion durch die Kombination von Harnstoff mit Sorbitol, das durch Dehydrierung die Harnstoff-induzierte Gewebeexpansion ausbalanciert und die Gewebe-Ultrastruktur, wie durch Elektronenmikroskopie ausgewertet10. Die Schrumpfung oder Ausdehnung von Gewebe wirkt sich auf die absoluten Größen von Strukturen, Abstände zwischen Objekten oder die Zelldichte pro Volumen aus. So kann die Messung von Größenänderungen bei der Reinigung des Gewebes helfen, die erhaltenen Ergebnisse7,26zu interpretieren.
Im Allgemeinen besteht ein Protokoll für optisches Clearing aus mehreren Schritten, einschließlich Vorbehandlung, Permeabilisierung, Immunkennzeichnung (falls erforderlich), Brechungsindex-Matching und Bildgebung mit fortgeschrittener Lichtmikroskopie (z. B. Zweiphotonen, konfokale oder Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie). Die meisten Clearing-Ansätze wurden entwickelt, um neuronales Gewebe zu visualisieren, und neue Studien haben ihre Anwendung in anderen Organen validiert5. Dieses umfassende Tool wurde zuvor gezeigt, um eine zuverlässige und effiziente Analyse von Nierenstrukturen zu ermöglichen, einschließlich Glomeruli27,28, Immuninfiltrate28, Vaskulatur28und Tubule Segmente 29, und es ist ein idealer Ansatz, um das Verständnis der glomerulären Funktion und Tubule Umbau in Gesundheit und Krankheit zu verbessern.
Zusammengefasst ist hier eine lösungsmittelbasierte Methode, die Immunfärbung von Nierentubuli kombiniert; optische Clearing mit billigen, ungiftigen und gebrauchsfertigen chemischen Ethyl-Cinnamate (ECi); und konfokale Mikroskopie-Bildgebung, die eine vollständige Tubule-Visualisierung und Quantifizierung ermöglicht. Diese Methode ist einfach, kombiniert Antigen-Retrieval von Nierenscheiben mit Färbung von kommerziellen Antikörpern, und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die es für die meisten Laboratorien zugänglich macht.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-112</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>21 G Schmetterlingsnadel</td><td>Braun</td><td>Venofix</td><td></td></tr><tr><td>3-Wege Absperrhahn</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>3D-Analysesoftware</td><td>Bitplane AG</td><td>IMARIS</td><td></td></tr><tr><td>3D-Analysesoftware</td><td>Cellprofiler</td><td></td><td>kostenlose Open-Source-Software</td></tr><tr><td>5-0 Seidennaht</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Kunststoffspritzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-57</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-BrdU-Antikörper</td><td>Roche</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>Antikörperverdünnungsmittel</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>CD31-647</td><td>BioLegend</td><td>102516</td><td></td></tr><tr><td>Citrat-basierte Antigen-Retrieval-Lösung</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Gebogener Hämostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Dako Wash Buffer</td><td>Agilent</td><td>S3006</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Motic</td><td>DSK-500</td><td></td></tr><tr><td>Einbettungskassetten</td><td>Carl Roth</td><td>E478.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td></td><td></td>100983</tr><tr><td>Ethylzimt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>Flexible Film/Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Ziege anti-AQP2</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-9882</td><td></td></tr><tr><td>Meerschweinchen anti-NKCC2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth</td><td>P074.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>401-02</td><td></td></tr><tr><td>Hämostat</td><td>Agnthos</td><td>312-471-140</td><td></td></tr><tr><td>Horizontale Wippe</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungsschale</td><td>Ibidi</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>MWI Animal Health</td><td>501090</td><td></td></tr><tr><td>Micro serrefine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Operationsschere</td><td>Merit</td><td>97-272</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-PhoshoThr53-NCC</td><td>PhosphoSolutions</td><td>p1311-53</td><td></td></tr><tr><td>Silikonelastomer</td><td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Schneidemaschine</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSRA001-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>AC215682500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Lancer</td><td>Series 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>MWI Animal Health</td><td>AnaSed Inj SA (Xylazin)</td><td></td></tr></tbody></table>

optische seimierung und bildgebung von immunomarkiertem nierengewebe

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optische Clearing-Techniken machen Gewebe transparent, indem der Brechungsindex in einer Probe für die nachfolgende dreidimensionale (3-D) Bildgebung ausgeglichen wird. Sie haben in allen Forschungsbereichen große Aufmerksamkeit auf das Potenzial zur Analyse mikroskopischer mehrzelliger Strukturen erhalten, die sich über makroskopische Entfernungen erstrecken. Angesichts der Tatsache, dass sich Nierentubuli, Vaskulatur, Nerven und Glomeruli in viele Richtungen ausdehnen, die bisher nur teilweise durch traditionelle zweidimensionale Techniken erfasst wurden, eröffnete die Geweberäumung auch viele neue Bereiche der Nierenforschung. Die Liste der optischen Clearing-Methoden wächst schnell, aber es bleibt schwierig für Anfänger in diesem Bereich, die beste Methode für eine bestimmte Forschungsfrage zu wählen. Hier ist eine einfache Methode, die Antikörper-Etikettierung von dicken Maus Nierenscheiben kombiniert; optische Clearing mit billigem, ungiftigem und gebrauchsfertigem chemischen Ethyl-Cinnamat; und konfokale Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Nieren durchsetzt und einen Antigen-Retrieval-Schritt verwendet, um die Antikörperbindung zu erhöhen, ohne spezielle Geräte zu benötigen. Seine Anwendung wird in der Bildgebung verschiedener multizellulärer Strukturen innerhalb der Niere vorgestellt, und wie man schlechte Antikörper-Penetration in Gewebe zu beheben wird behandelt. Wir diskutieren auch die potenziellen Schwierigkeiten der Bildgebung endogene Fluorophore und den Erwerb sehr großer Proben und wie sie überwunden werden können. Dieses einfache Protokoll bietet ein einfach einzurichtendes und umfassendes Werkzeug, um Gewebe in drei Dimensionen zu untersuchen.

Nieren sind komplexe Organe, die aus 43 verschiedenen Zelltypen31bestehen. Die meisten dieser Zellen bilden große mehrzellige Strukturen wie Glomeruli und Tubuli, und ihre Funktion ist in hohem Maße von Wechselwirkungen miteinander abhängig. Klassische 2-D-Histologische Techniken erfassen diese großen Strukturen teilweise und können fokale Veränderungen innerhalb intakter Strukturen vermissen31. So hilft die 3-D-Analyse mit optischen Clearing-Techniken zu verstehen, wie sie...

Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Das wachsende Interesse am Studium großer, multizellulärer Strukturen führte zur Entwicklung dieser optischen Clearing-Technik, die eine dreidimensionale Visualisierung und Quantifizierung großer Strukturen innerhalb transparenter Organe ermöglicht. Dieses Protokoll bietet ein einfaches, kostengünstiges, einfach einzurichtendes und umfassendes Werkzeug zur Untersuchung von Gewebe in drei Dimensionen. Die vielschichtige Natur einer Krankheit kann nicht immer mit traditionellen zweidimensionalen Techniken simuliert werden.Die dreidimensionale Analyse von Gewebe kann helfen, Krankheiten besser zu diagnostizieren und zu überwachen. Diese Methode ist nicht auf Nierengewebe beschränkt und kann auf jedes normale und kranke Gewebe angewendet werden. Dieses einfache Protokoll ist für jeden Wissenschaftler mit etwas Erfahrung im Umgang mit Tieren einfach zu befolgen.Es ist wichtig, verschiedene Antikörper bei schlechter Antikörperkennzeichnung zu testen und nur sekundäre Antikörperkontrollen durchzuführen. Beginnen Sie mit der Zubereitung von Heparin mit PBS und 3,0% Paraformaldehyd in 1X PBS gemäß den Manuskriptrichtungen und übertragen Sie die Lösungen in separate 50 ml Kunststoffspritzen. Paraformaldehyd ist giftig und sollte in der Dunstabzugshaube hergestellt werden.Sammeln und überziehen Sie die Niere nach den Manuskriptanweisungen. Dann entfernen Sie die Kapsel und schneiden Sie die Niere in ein mm dicke koronale Scheiben. Die Nierenscheiben mit der vorbereiteten Paraformaldehydlösung in ein 15 ml konisches Rohr eintauchen.Nach der Fixierung die Nierenscheibe zweimal mit 1X Waschpuffer für eine Stunde auf einer horizontalen Wippe waschen und dann mit Antigen-Retrieval fortfahren. Erhitzen Sie 300 ml 1X Antigen-Entlarmungslösung in einem 500 ml Becher. Dann eine Nierenscheibe in eine einbettbare Einbettkassette einschließen, die in den erhitzten Puffer durchlässig ist, und eine Stunde bei 92 bis 98 Grad Celsius umrühren.Es ist wichtig, die Temperatur zwischen 92 und 98 Grad Celsius für diesen Antigen-Retrieval-Schritt stabil zu halten. Dann die Scheibe in 10 ml 1X Waschpuffer mit 0.1%Triton X-100 übertragen und über Nacht schaukeln. Am nächsten Tag die Scheibe zweimal mit 10 ml frischem 1X Waschpuffer für eine Stunde waschen.Verdünnen Sie den primären Antikörper in 500 Mikroliter normales Antikörperverdünnungsmittel. Die Nierenscheibe in verdünntem Primärantikörper vier Tage lang bei 37 Grad Celsius sanft schaukeln. Nach der Inkubation die Nierenscheibe in 10 ml 1X Waschpuffer über Nacht bei Raumtemperatur waschen und den Puffer einmal nach acht Stunden wechseln.Die sekundären Antikörper in 500 Mikroliter normaler Antikörperverdünnung verdünnen und vier Tage lang bei 37 Grad Celsius mit der Nierenscheibe bebrüten. Bitte beachten Sie, dass die Nierenscheibe von diesem Schritt an vor Licht geschützt werden sollte. Nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern die Nierenscheibe in 10 ml 1X Waschpuffer über Nacht bei Raumtemperatur waschen.Um die Nierenscheibe zu dehydrieren, übertragen Sie sie auf fünf ml hochwertiges 100%Ethanol und schaukeln Sie es für zwei Stunden bei Raumtemperatur, erfrischen Sie das Ethanol nach einer Stunde. Die Nierenscheibe in zwei ml Ethyl-Cinnamat eintauchen und über Nacht sanft schaukeln. Wenn Sie bereit sind, das Gewebe abzubilden, fügen Sie 600 bis 1000 Mikroliter Ethyl-Cinnamate in eine Glasbodenschale ein und geben Sie die Nierenscheibe in die Schale.Legen Sie einen runden Deckelschlupf auf die Nierenscheibe und versiegeln Sie die Schale mit Paraffinfolie. Legen Sie die Schale auf die Mikroskop-Bildplattform und stellen Sie das Gewebe entsprechend den Manuskriptanweisungen ab. Dieses Protokoll wurde verwendet, um erfolgreich 3D-Analysen auf Nierengewebe durchzuführen und Zellfunktionen und Wechselwirkungen auszuwerten.Die Methode kann fluoreszierende Reporter abschrecken verursachen, aber andere starke fluoreszierende Proteine können Signalabschreckung widerstehen. Abdominale Aortenfülle kann die Antikörperdiffusion verbessern. In einigen Fällen führt eine schlechte Antikörperdurchdringung zu einem oberflächlichen Signal.Dies kann mit höheren Konzentrationen oder nachauffüllung von Antikörpern korrigiert werden. Die intravaskuläre Abgabe sollte in Betracht gezogen werden, wenn das Antigen von Interesse in der Nierenvaskulatur ausgedrückt wird. Antikörper, die auf Proteine in der apikalen Membran von Tubuleepithelzellen abzielen, überschreiten jedoch nicht die glomeruläre Filtrationsbarriere und verursachen unspezifische Signale.Das Gewebe kann mit den Antikörpern beschriftet werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu erkennen oder ganze Tubulesegmente zu visualisieren. Darüber hinaus kann die Kolokalisierung von Proteinen in 3D durch die Kombination mehrerer Antikörper erreicht werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Antikörperkennzeichnung mit guter Nierenfülle, der Verwendung von Antigen-Retrieval-Schritt und einer hohen Antikörperkonzentration verbessert werden kann.Einige starke Reporterproteine können dem Abschrecken von Fluoreszenzsignalen nach diesem Protokoll widerstehen. Um dies zu testen, überspringen Sie die Antigen-Retrieval- und Antikörper-Etikettierungsschritte. Diese Technik respektiert die dreidimensionale Natur von Strukturen und eröffnet viele neue Forschungsbereiche.Es eliminiert die erforderlichen Annahmen und Interferenzen, die mit der traditionellen zweidimensionalen Analyse verbunden sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Behera, R. K. et al. Eine fluoreszenzbasierte Methode zur Untersuchung der bakteriellen Genregulation in infizierten Geweben. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert eine Methode zur Herstellung infizierter Mausnieren, zur DNA-Färbung und zur Erkennung bakterieller Genexpression mittels dualer fluoreszierender Reporter. Rot markiert alle Bakterien, und Grün hebt infektionsempfindliche Zellen hervor.

Fluoreszenzbildgebung der bakteriellen Besiedlung im Nierengewebe der Maus

Dieses Video zeigt einen Assay für die Whole-Mount-Färbung von Mausnieren unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode namens CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis) und Immunfluoreszenzfärbung. Die Niere wird einer Gewebereinigung unterzogen, bei der die Niere entfettet, entfärbt und mit einer Brechungsindex-Anpassungslösung behandelt wird, um das Gewebe für eine optimale dreidimensionale Bildgebung transparent zu machen. Das Gewebe wird mit...

Eine Ganzbett-Organfärbetechnik für die dreidimensionale Bildgebung der Niere

ACT-PRESTO (aktiv Klarheit Technik druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in Organe) ermöglicht eine schnelle, effiziente, aber kostengünstige Gewebe Clearing- und schnelle Antikörper das Eindringen in Gewebe gelöscht durch passive Diffusion oder druckunterstützten Lieferung. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Vielzahl von Geweben durch multiple Antikörper gelöscht, immunmarkiert werden und volumen abgebildet.

ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.

Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe

Ziel dieses Protokolls ist es, intakte Herzschrittmacherregionen des Nierenbeckens der Maus mittels Vibratomschnitt zu isolieren. Diese Abschnitte können dann für die in situ Ca2+ Bildgebung verwendet werden, um Ca2+ transiente Eigenschaften von Herzschrittmacherzellen und anderen interstitiellen Zellen in Vibratomscheiben aufzuklären.

Isolierung und Bildgebung von live, intakten Herzschrittmacherregionen des Nierenbeckens der Maus durch Vibratom-Schnitte

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anpassung der CLARITY-Methode des Hirngewebes für ganzklächige Netzhäute vor, um die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und hochauflösenden Bildgebung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen zu verbessern.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

Die Identifizierung des Zelltyps, der für die Sekretion von Zytokinen verantwortlich ist, ist notwendig, um die Pathobiologie der Nierenerkrankung zu verstehen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur quantitativen Färbung von Nierengewebe auf Zytokine, die von Nierenepithelzellen oder interstitiellen Zellen produziert werden, unter Verwendung von Brefeldin A, einem Sekretionshemmer, und zelltypspezifischen Markern.

Identifizierung der Quelle von sezernierten Proteinen in der Niere durch Brefeldin A-Injektion

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Fromter Ratten mit Oberflächenglomeruli, um die Auswirkungen einer verlängerten Harnleiterobstruktion auf die glomeruläre Dynamik und Funktion zu quantifizieren.

Mit der 2-Photonen-Mikroskopie die Auswirkungen einer chronischen einseitigen Harnleiterobstruktion auf glomeruläre Prozesse quantifizieren

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Gewebereinigungsmethode und eine Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung für die dreidimensionale (3D) Nierenbildgebung. Diese Technik kann makroskopische Perspektiven in der Nierenpathologie bieten, was zu neuen biologischen Entdeckungen führt.

Ganznieren-dreidimensionale Färbung mit CUBIC

Diese Studie stellt eine einfach anzuwendende, vollständige und einfache Reihe von Methoden zur Markierung und Analyse von Glomeruli aus CUBIC-geräumten Mäusenieren vor. Daten wie Glomeruluszahl und -volumen können einfach und zuverlässig mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran, Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) oder gängiger konfokaler Mikroskopie und Software wie Imaris gewonnen werden.

Eine effiziente und schnelle Methode zur Markierung und Analyse von Mausglomeruli

Erfahren Sie optisches Clearing und 3D-Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe mit Ethylzimtat und konfokaler Mikroskopie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Visualisierung großer Strukturen in transparenten Organen.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

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