Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographischer Diagnostischer Test für ressourcenbegrenzte Einstellungen mit weiteren molekularen Anwendungen
June 29th, 2020
Wir präsentieren ein vollständiges Protokoll zur postmortalen Diagnose von Tiertollwut unter Feldbedingungen mit Hilfe eines schnellen immunchromatographischen diagnostischen Tests (RIDT), von der Probenahme der Hirnbiopsie bis zur endgültigen Interpretation. Wir beschreiben auch weitere Anwendungen mit dem Gerät für molekulare Analyse und virale Genotypisierung.
Dieses Protokoll kann für die postmortale Diagnose von Tierischen von der ersten Sicht der Diktion im Feld bis zur molekularen Konformation in einer zentralisierten Aktivitätsebene verwendet werden. Schnelle immunchromatographische Diagnosetests sind eine nützliche Alternative für ländliche und ländliche Merkmale in Afrika und Asien, in denen keine Referenzmaterialien für die Tollwutdiagnose verfügbar sind. Demonstriert wird das Verfahren von Simon Bonas, einem Techniker aus meinem Labor.
Demonstrieren den ersten Teil des Verfahrens wird Ibrahima Dicko, ein Techniker von der Laboratoire Central Veterinaire in Bamako, Mali. Um auf das Foramen magnum zuzugreifen, verwenden Sie ein Messer, um den Tierkopf vor den ersten Halswirbeln zu entfernen. Und verwenden Sie ein geeignetes Werkzeug, um eine Hirnstammprobe zu sammeln.
Wie z. B. eine Einwegpipette, Trinkhalm, Klemme oder Tropf, wie hier gezeigt. Der Hirnstamm ist dann deutlich sichtbar, wie hier mit der Spitze dieser Pipette gezeigt wird. Verwenden Sie ein geeignetes Werkzeug, um einen Teil dieses Hirnstamms wie einen Trinkhalm zu sammeln.
Legen Sie es vorsichtig und drehen Sie vorsichtig, um das Gehirngewebe zu sammeln. Vergessen Sie nicht, das Stroh mit dem Finger zu stecken, bevor Sie es entfernen, um die Biopsie zu sammeln. Der Einsatz einer Klemme ist ebenfalls möglich.
Um größere Stücke des Hirnstamms auf der Ebene des Foramen magnum zu sammeln. Alternativ ist es möglich, direkt den im Kit bereitgestellten Trabfall zu verwenden, um den Hirnstamm zu sammeln. Ähnlich wie beim Trinkhalm, legen Sie den Tracht vorsichtig beim Drücken und drehen Sie sanft, um das Gehirngewebe zu sammeln.
Dann das Hirngewebe ansaugen und in einen Behälter wie den Stopfen einer Röhre legen. Für eine genaue Diagnose ist es wichtig, den Hirnstamm, der die Medulla ablongata enthält, während der Probenentnahme zu sammeln. Das Hirnmaterial mit dem Tupfer oder Traber vorsichtig etwa 30 Sekunden lang direkt in der Röhre zerkleinern, bis eine homogene Suspension erhalten ist.
Mit dem Tredase vier Tropfen etwa 100 Mikroliter der Suspension im Probeneinlass auf dem Prüfgerät ablegen. Im Falle einer Verzögerung aufgrund einer hohen Viskositätsaufhängung oder um den Beginn der Migration zu beschleunigen, kratzen Sie vorsichtig den Boden der Ablagerungsstelle des Geräts mit dem Trsetzer. Warten Sie auf die vollständige Beispielmigration, ein bis fünf Minuten, bevor Sie das Testgerät lesen.
Eine Probe wird als positiv für Tollwut betrachtet, wenn zwei Linien sichtbar sind. Negativ, wenn nur die Steuerlinie vorhanden ist. Und ungültig, wenn nur die Testzeile oder keine Linien sichtbar sind.
Um die RNA aus einer Geräteprobe zu extrahieren, öffnen Sie das Gerät vorsichtig und entfernen Sie das Filterpapier. Sammeln Sie den Ablagerungsbereich der Probe und legen Sie die Probe in einen Milliliter Trireagenz LS. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur mit regelmäßiger sanfter manueller Agitation, extrahieren Sie die RNA aus den Röhren, die nach Standard-RNA-Extraktionsprotokollen überstand. Hinzufügen von zwei Mikroliter Glykogen, um die RNA-Ausfällung nach den Empfehlungen der Hersteller zu erleichtern.
Stellen Sie das Endvolumen der RNA-Resuspension auf 50 Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser ein. Und bereiten Sie die Master-Mix-Reaktionslösung für die drei verschiedenen Reverse-Transkriptase quantitativePCR-Assays nach der Tabelle. Verwenden der Primer und Sonden, wie in der Tabelle angegeben.
Bei fünf Mikrolitern der verdünnten RNA-Proben. Und 15 Mikroliter Master-Mix zu jedem der drei verschiedenen Assays in Duplikat in den entsprechenden 96 Well-Reaktionsplatten. Fügen Sie die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen für jeden Assay zu jeder Platte in doppelter Ausführung hinzu.
Führen Sie dann die verschiedenen Assays nach den thermischen Radfahrbedingungen aus, wie in der Tabelle angegeben. Die Ergebnisse können wie in der Tabelle beschrieben analysiert werden. Die Entnahme einer Hirnbiopsie ist so einfach wie möglich, um die Sammlung von hochwertigen Proben zu gewährleisten.
Im Vergleich zur Referenztechnik war die Empfindlichkeit und Spezifität des schnellen immunchromatographischen Diagnostischen Tests in allen Laboratorien, die diese Protokolle verwenden, hoch. Basierend auf der kumulativen Anzahl der getesteten Proben lag die Gesamtempfindlichkeit und Spezifität bei über 95%Der schnelle immunchromatographische diagnostische Test ist für den Nachweis von Lisavirus in Hirnbiopsien von infizierten Tieren geeignet. Da der Gehalt an Lisavirus-Antigenen für die Tollwut-Diagnose wichtig ist, bleibt die Nachweisgrenze jedoch hoch, wenn titrierte Virussuspensionen getestet werden.
In diesen repräsentativen Ergebnissen, die nach dem RNA-Nachweis durch duale kombinierte Panlisavirus-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR-Targeting der viralen Polymerase des Lisavirus erhalten wurden, wurde ein Panel von 51 positiven schnellen immunchromatographischen diagnostischen Tests durchgeführt. Darüber hinaus konnte für vierzehn Proben Genotypisierung mit der hemi-geschachtelten PCR-Targeting des partiellen Nukleoprotein-Gens durchgeführt werden. Diagnose und Extraktion für den Teststreifen für die Genotypisierung basierend auf nach RT PCR oder durch zusätzliche lange String-Analyse.
Der schnelle immunchromatographische Diagnosetest kann eine schnelle und genaue Tollwutdiagnose liefern. Was entscheidend für die Aufrechterhaltung der Wellenfunktion in kontinuierlichen wellenbasierten Überwachungs- und Steuerungssystemen ist. Und die Minimierung von Humannnes.
Überblick
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die postmortale Diagnose der Tollwut bei Tieren unter Verwendung eines schnellen immunchromatographischen Diagnostiktests (RIDT) vor. Das Verfahren umfasst die Entnahme von Gehirnbiopsien und deren Interpretation sowie zusätzliche Anwendungen für molekulare Analyse und virale Genotypisierung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Veterinärdiagnostik
- Virologie
- Molekulare Biologie
Hintergrund
- Tollwut ist eine kritische Zoonose, die Tiere und Menschen betrifft.
- Herkömmliche Diagnosemethoden können in ländlichen Gebieten begrenzt sein.
- Der RIDT bietet eine schnelle und effektive Alternative für die Tollwutdiagnose.
- Feldbedingungen haben oft keinen Zugang zu Referenzmaterialien für die Diagnose.
Zweck der Studie
- Ein zuverlässiges Protokoll für die Diagnose von Tollwut bei Tieren postmortal bereitzustellen.
- Die Wirksamkeit des RIDT in verschiedenen Umgebungen zu demonstrieren.
- Zusätzliche Anwendungen wie virale Genotypisierung zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Entnahme von Hirnstammproben von Tieren.
- Verwendung des RIDT für eine schnelle Diagnose.
- RNA-Extraktion und Reverse Transkriptase quantitative PCR-Assays.
- Genotypisierung von Tollwutvirus-Proben.
Hauptergebnisse
- Der RIDT zeigte eine hohe Sensitivität und Spezifität von über 95%.
- Die erfolgreiche Entnahme von Gehirnbiopsien wurde mit einfachen Werkzeugen erreicht.
- Die Genotypisierung wurde an einer Teilmenge von Proben durchgeführt.
- Das Protokoll ist für den Einsatz im Feld in ressourcenbeschränkten Umgebungen geeignet.
Schlussfolgerungen
- Der RIDT bietet eine schnelle und genaue Methode für die Tollwutdiagnose.
- Dieses Protokoll kann die Tollwutüberwachung und -kontrollbemühungen verbessern.
- Es ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der öffentlichen Gesundheit und Sicherheit.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Rapid immunochromatographic diagnostic tests (RIDTs) enable decentralized rabies surveillance in resource-limited settings, addressing critical gaps in zoonotic disease monitoring. By combining point-of-care antigen detection with downstream molecular genotyping from inactivated test strips, the protocol supports both immediate outbreak response and longitudinal viral tracking. This dual-capability approach enhances predictive confidence in early-stage target validation for antiviral interventions while reducing reliance on centralized laboratory infrastructure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of lyshostatic mechanisms through rapid confirmation of rabies antigen presence in neural tissue.
- Operational Value: Facilitates high-throughput sampling in field conditions to de-risk target engagement hypotheses in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, qualitative antigen detection with visual readout for assay normalization across diverse sample types.
- Operational Value: Generates inactivated test strips suitable for safe transport and molecular analysis, enabling workflow continuity from screening to genotyping.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports viral genotyping via RNA extraction from test strips, linking phenotypic diagnosis to strain-specific molecular characterization.
- Operational Value: Creates a bridge between field surveillance and centralized lab analysis, improving translational continuity in zoonotic pathogen studies.
Pipeline & Workflow Integration
The RIDT protocol integrates into discovery workflows by enabling initial hypothesis testing in endemic regions, with outputs feeding into lead identification through viral strain tracking.
- Discovery Biology: Supports target validation by confirming rabies antigen expression in brain biopsies, clarifying pathophysiological relevance of neural invasion mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, instrument-free antigen detection with defined positivity criteria (two visible lines) for scalable sample triage.
- Analytics: Enables quantitative downstream analysis via RNA extraction and RT-qPCR, providing measurable outputs for viral load and genotyping correlations.
- Translational Research: Connects field-based diagnosis to preclinical modeling through genotyping data that informs strain selection for vaccine or therapeutic evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a portable diagnostic module adaptable to other lyssaviruses, maximizing platform utility across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in zoonotic pathogenesis by enabling rapid confirmation of viral presence in target tissues.
- Operational Value: Eliminates need for cold chain or specialized equipment, standardizing sample processing across geographically dispersed sites.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in antiviral programs by providing early, reliable evidence of target modulation in vivo.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization through accessible surveillance data that informs geographic and strain-specific investment strategies.
Implementation Considerations
- Requires training in proper brainstem sampling technique to ensure medulla oblongata collection for diagnostic accuracy.
- Depends on access to basic sample preparation tools (pipettes, tubes, buffer) and lateral flow readers for consistent results.
- Necessitates standardization of RNA extraction protocols from test strips to maintain genotyping reliability across laboratories.
- Involves adaptation considerations for non-rabies lyssaviruses due to potential variations in antigen concentration and test line visibility.
- Limited by the visual detection threshold of the assay, which may require confirmatory testing in low-antigen samples despite high analytical sensitivity post-extraction.
