Name: In Vivo Surface Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Erfahren Sie eine praktische Methode zur in vivo Elektrokardiographie bei erwachsenen Zebrafischen. Diese minimal-invasive Technik ermöglicht zuverlässiges kardiales Monitoring für Grundlagenforschung und Arzneimittelscreening.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R01 HL141452 bis TPN unterstützt. ADInstruments stellte freundlicherweise großzügige Mittel zur Verfügung, um die Kosten für open access Publishing zu tragen, spielte aber weder bei experimentellem Design, Datenerfassung, Datenanalyse dieser Studie noch bei dem Zugang zum Manuskript vor der Veröffentlichung eine Rolle.

Alle Experimente in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Alle Tierprotokolle in dieser Studie wurden vom UCLA Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung des Versuchsaufbaus
<ol><li>Halten Sie Zebrafische in Durchflussaquariensystemen auf einer 14 h hellen, 10 h dunklen Photoperiode bei 28 °C bei 0,5 °C. Füttern Sie täglich mit Flockenfutter und lebenden Solegarnelen (Artemia nauplii) zweimal täglich. Zebrafische in dieser Studie wurden vom UCLA Zebrafish Core gepflegt und gefüttert.</li>
	<li>Am Tag des Experiments transportieren Sie Zebrafische aus dem Aquarium ins Labor.</li>
	<li>Richten Sie das In-vivo-EKG-Aufzeichnungssystem ein, indem Sie die wesentlichen Geräte anschließen und die drei farbcodierten Edelstahlelektroden in die drei farblich abgestimmten Zugangsportale des Verstärkers einfügen (Abbildung 3). Starten Sie das System zu Beginn einer EKG-Aufzeichnungs- und/oder Analysesitzung.</li>
	<li>Besorgen Sie sich notwendige Werkzeuge, wie eine Timer/Stoppuhr, einen nassen Schwamm mit einem Schlitz, um die Fische zu halten, Zangen, Scheren, Pasteur Pipetten und Kulturgerichte (100 mm x 20 mm).</li>
</ol>2. Anästhesie-Induktion
<ol><li>Bereiten Sie die Tauchanästhesie zur Schmerzkontrolle und Zurmobilisierung von Fischen vor, um Bewegungsartefakte während der EKG-Datenerfassung zu vermeiden. Die meisten Laboratorien verwenden Tauchtriain (Ethyl 3-Aminobenzoat Methansulfonat, MS-222).<ol>
<li>Um die Tricain 0,4% Stofflösung zu machen, kombinieren Sie die folgenden Elemente in einer verschraubten dunklen Glasflasche: 400 mg Tricainpulver, 98 ml doppelt destilliertes Wasser und 2 ml 1 M Tris (pH 9). Stellen Sie sich mit 1 N NaOH oder 1 N HCl nach Bedarf8an pH 7.0 ein.</li>
		<li>Um die Tricain-End-Immersion-Lösung zu machen, bestimmen Siedie Minimale Konzentration, die für die Zebrafische Alter 9, Größe, Stoffwechselzustand, Stamm, Krankheitsmodell, wissenschaftliche Ziele und Verfahrensdauer geeignet ist.</li>
		<li>Führen Sie eine Tricain-Konzentrations-Reaktionsstudie durch, die von der empfohlenen Konzentration von 168 mg/L (oder 0,0168%)9 bei Bedarf nach oben oder unten titiert wird, um die Stufe 4 der Anästhesie innerhalb von 3 min mit den wenigsten kardioratorischen Toxizitäten zu erreichen. In dieser Studie wird beispielsweise das Eintauchen von Wild-AB-Zebrafischen im Alter von 12-18 Monaten in eine 0,02-0,04% Tricainlösung innerhalb von 3 min an Anästhesiestufe 4 induzieren. HINWEIS: Bei Anästhesiestufe 4 gehen Gleichgewicht und Muskeltonus vollständig verloren und die Bewegungsgeschwindigkeit wird reduziert8.</li>
		<li>Falls erforderlich, wenden Sie sich an den Tierarzt im Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC), um zusätzliche Hinweise zur Angemessenheit der Auswahl des/der Anästhetika und des Verabreichungswegs zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tauchen Sie einen erwachsenen Zebrafisch in eine Schüssel ein, die Tricainlösung der niedrigsten vorbestimmten und IACUC-zugelassenen Konzentration (z. B. 0,02-0,04 % in dieser Studie) enthält, um die Anästhesiestufe 4 innerhalb von 3 min zu induzieren (Abbildung2).<ol>
<li>Für das Überlebens-EKG-Protokoll, halten Sie die EKG-Aufnahmesitzung so kurz wie möglich (unter 10 min). Für kurze EKG-Aufnahmesitzungen von weniger als 15 min ist keine Anästhesiewartung erforderlich.</li>
		<li>Für lange EKG-Aufnahmesitzungen, die Stunden dauern, verwenden Sie einen lang wirkenden intramuskulären Paralytikum und ein orales Perfusionssystem, um ausreichend Feuchtigkeit und Sauerstoffzufuhr zu gewährleisten6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EKG-Leitungsplatzierung
<ol><li>Sobald der Zebrafisch die Stufe 4 der Anästhesie für 3 s aufrechterhält, verwenden Sie ein Paar stumpfe Zangen, um den Fisch sofort auf den feuchten Schwammschlitz mit seiner ventralen Oberfläche zu übertragen, der für die Platzierung von EKG-Bleielektroden an erster Stelle steht (Abbildung 4).</li>
	<li>Setzen Sie die drei EKG-Bleielektroden vorsichtig in die Fischmuskulatur bis etwa 1 mm Tiefe ein, um eine bipolare Leitung in der Frontalebene zu etablieren, die mit der linken kaudalen-rechten Schädelausrichtung der Herzhauptachse verläuft.</li>
	<li>Positionieren Sie die positive (rote) Elektrode in der ventralen Mittellinie auf der Ebene des bulbus arteriosus, d.h. bei 1-2 mm über einer imaginären Linie, die die beiden unteren Kanten der Operculums verbindet (Abbildung 4A).</li>
	<li>Positionieren Sie die negative (schwarze) Elektrode kauarisch und 0,5-1,0 mm seitlich links zur positiven Elektrode, in einem Abstand größer als die maximale apicobasale Länge des erwachsenen Zebrafischventrikels (Abbildung 4A).</li>
	<li>Positionieren Sie die Referenzelektrode caudally in der Nähe des Analbereichs. HINWEIS: Da die Herz-Hauptachse von Fisch zu Fisch etwas variiert, um die R- und T-Wellenamplituden zu maximieren, passen Sie die Bleipositionen an, indem Sie nur kleine, systematische Änderungen durch Versuch und Irrtum vornehmen. Ändern Sie z. B. eine Elektrode (positiv oder negativ) anstelle beider Elektroden gleichzeitig und nehmen Sie schrittweise Änderungen in einer bestimmten Richtung vor, bevor Sie in eine andere Richtung wechseln, anstatt unregelmäßige Änderungen in zufälligen Richtungen vorzunehmen.</li>
</ol>4. EKG-Aufzeichnung
<ol><li>Öffnen Sie das EKG-Datenerfassungsprogramm. Wählen Sie eine gewünschte Einstellung aus den Dropdown-Menüs für Reichweite, Tiefpass und Hochpass aus. Beispielsweise ergibt die folgende Einstellung im in vivo EKG-Aufzeichnungssystem, das in diesem Experiment verwendet wird, ein konsistentes, zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis für einen normalen erwachsenen Zebrafisch: Bereich "2 mV", Tiefpass "120 Hz" und Hochpass "0,03 s".</li>
	<li>Drücken Sie Start, um eine kontinuierliche lückenlose EKG-Aufnahme mit einer Abtastrate von 1 kHz zu starten.</li>
	<li>Um die Bleipositionierung für ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren, drücken Sie Stop, um die EKG-Aufnahme zu stoppen und die EKG-Spur kurz nach dem allerersten Aufnahmeversuch für jedes Herz zu überprüfen.  Um zu diagnostizieren, dass ein erwachsenes Zebrafisch-EKG normal ist, bestätigen Sie, dass alle folgenden vier Validierungskriterien erfüllt sind (Abbildung 1):<ol>
<li>Kriterium 1: Stellen Sie sicher, dass alle EKG-Wellenformen (P, QRS und T) unterschiedlich und gut sichtbar sind.</li>
		<li>Kriterium 2: Stellen Sie sicher, dass die P-Welle positiv ist.</li>
		<li>Kriterium 3: Stellen Sie sicher, dass der Netto-QRS-Komplex positiv ist (d. h. die R-Wellenamplitude ist größer als die Summe der Q- und S-Wellenamplituden).</li>
		<li>Kriterium 4: Stellen Sie sicher, dass die T-Welle positiv ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn ein normales EKG erwartet wird, positionieren Sie die Elektroden (versuchen Sie die negative Elektrode zuerst), bis alle vier Validierungskriterien erfüllt sind.</li>
	<li>Wenn eine normale T-Welle erwartet wird, aber die T-Welle zu klein ist, positionieren Sie die Elektroden neu, um die Amplitude der T-Welle zu maximieren.</li>
	<li>Fortsetzen der EKG-Aufnahme nach Deroptimierung der Lead-Positionierung. Speichern Sie die EKG-Sweeps für die nachfolgende Analyse.</li>
</ol>5. Erholung aus der Anästhesie
<ol><li>Entfernen Sie am Ende der EKG-Aufnahmesitzung die Elektroden vorsichtig, ohne den Fisch zu verletzen. Den Fisch in frisches, sauerstoffreiches Fischwasser frei von Tricain geben.</li>
	<li>Um die Erholung von der Anästhesie zu erleichtern, spritzen Sie wasser über die Kiemen kräftig mit einer Pasteur Pipette, bis der Fisch die regelmäßige Kiemenbewegung oder das Schwimmen wieder aufnimmt.</li>
	<li>Überwachen Sie die Fische auf vollständige Erholung von der Anästhesie (in der Regel 1-2 min), wie durch die Fähigkeit der Fische angezeigt, aufrecht für mindestens 5 s zu schwimmen.</li>
</ol>6. EKG-Interpretation
<ol><li>Definieren Sie die Analyseeinstellungen.<ol>
<li>Kennen Sie die Software-Schnittstelle (Tabelle der Materialien) durch Lesen der Bedienungsanleitung der EKG-Datenanalyse-Software. HINWEIS: Obwohl die folgenden Richtungen spezifisch für die kommerzielle Software sind, die in unserem Labor verwendet wird, sind die grundlegenden Aufgaben, die es zu erfüllen gilt, im Wesentlichen die gleichen in jedem Softwarepaket für die EKG-Analyse.</li>
		<li>Öffnen Sie das EKG-Datenanalyseprogramm. Wählen Sie im Menü Datei die Option Öffnen aus, um die interessierte EKG-Datei zu öffnen und die vollständige EKG-Ablaufverfolgung anzuzeigen. Verwenden Sie die Maus, um einen Abschnitt von Interesse in der EKG-Ablaufverfolgung zu analysieren.</li>
		<li>Wählen Sie im Menü EKG-Analyse EKG-Einstellungen aus, um ein Dialogfeld zu öffnen, um verschiedene Parametereinstellungen für die automatische Softwareanalyse vorzudefinieren (Abbildung 5A).</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie den Herzrhythmus und die Rate. HINWEIS: Die Herzfrequenz hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich Zebrafischalter und -stamm, Anästhesiemittel (z. B. Tricain, Isofluran usw.) und Konzentration, Anästhesiekonsum (Einzelmittel5,7 vs. kombinierte Wirkstoffe5) und Belichtungszeit5. In dieser Studie betrug beispielsweise die Herzfrequenz von 12-18 Monate alten Wild-AB-Zebrafischen nach 3-5 min Eintauchen in 0,02-0,04% Tricainlösung 116 x 17 Schläge pro Minute (n = 9), im Einklang mit Literaturberichten über die Herzfrequenz für diese Altersgruppe und Anästhetikum5,7.<ol>
<li>Bestimmen Sie, ob der Herzrhythmus Sinus ist oder nicht, regelmäßig oder unregelmäßig. ANMERKUNG: Das Vorhandensein (oder Fehlen) des Sinusrhythmus basiert auf dem Vorhandensein (oder Fehlen) einer aufrechten P-Welle vor jedem QRS durch ein normales PR-Intervall (z. B. 60-65 ms für Liu et al.s 10-12 Monate alte7 und 12-18 Monate alte Wild-Typ AB Zebrafische in dieser Studie). Die regelmäßigitätsmäßiger Vorhof- und Ventrikulärrhythmus (oder Unregelmäßigkeit) beruht auf der Regelmäßigkeit (oder Unregelmäßigkeit) aufeinander folgender PP- bzw. RR-Intervalle.</li>
		<li>Um die Herzfrequenz zu bestimmen, stellen Sie sicher, dass die Software alle P- und R-Wellen korrekt identifiziert. Basierend auf diesen automatischen Identifikationen (oder manuellen Korrekturen) der P- und R-Wellen misst die Software automatisch alle PP- und RR-Intervalle in der EKG-Auswahl, berechnet die Intervalldurchschnitte, um die Atrial- und Ventrikuläre Rate zu generieren. HINWEIS: Die Vorhofrate ist das durchschnittliche PP-Intervall, während die ventrikuläre Rate das durchschnittliche RR-Intervall ist. Um die Herzfrequenz zu bestimmen, ist die korrekte Identifizierung der P- und R-Wellen entscheidend.</li>
		<li>Korrigieren Sie fehlerbeglichene Fehler bei der automatischen Identifizierung, indem Sie die falsch platzierten Cursor auf die entsprechenden P- und R-Wellen bewegen (Abbildung 5B). HINWEIS: Wenn sich das Herz im Sinusrhythmus befindet, sind die Vorhofrate und die ventrikuläre Rate aufgrund der Eins-zu-Eins-Entsprechung zwischen den Sinus-P-Wellen und den QRS-Komplexen gleich. Bei der atrioventrikulären Dissoziation (z. B. bei ventrikulärer Tachykardie oder atrioventrikulärem Block dritten Grades) geht diese Eins-zu-eins-Entsprechung zwischen den P-Wellen und QRS-Komplexen jedoch verloren; Daher gibt es zwei Herzfrequenzen, weil die Vorhofrate von der ventrikulären Rate unterscheidet.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Herzfrequenz basierend auf mindestens fünf aufeinanderfolgenden vollständigen Herzzyklen, wenn der Herzrhythmus normal ist, oder einen Streifen von mindestens sechs Sekunden, wenn der Herzrhythmus unregelmäßig ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie Intervalle und Wellendauern.<ol>
<li>Gehen Sie zu EKG-Analyse > Mittelungsansicht, um n (z. B. 5) aufeinander folgende Herzzyklen zu einem einzigen durchschnittlichen Signal zu verketten (Abbildung 5C). HINWEIS: Wenn die EKG-Wellenformen eines einzelnen Herzzyklus erheblich vom durchschnittlichen Signal abweichen, untersuchen Sie diesen Herzzyklus separat ohne Verkettung.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Software den Anfang und das Ende der P-Welle, des QRS-Komplexes und der T-Welle, die im Fenster Mittelbildansicht angezeigt werden , korrekt identifiziert (Abbildung 5C). Basierend auf diesen automatischen Identifikationen (oder manuellen Korrekturen) dieser Wellen und Intervalle misst die Software automatisch die konventionell definierten Dauern. HINWEIS: Das PR-Intervall erstreckt sich vom Beginn der P-Welle bis zum Anfang des QRS-Komplexes (oder des RS-Komplexes, wenn die Q-Welle nicht sichtbar ist). Die QRS-Dauer erstreckt sich vom Beginn der Q-Welle (oder der R-Welle, wenn die Q-Welle nicht sichtbar ist) bis zum Ende der S-Welle (d. h. dem J-Punkt; Abbildung 1). Das QT-Intervall reicht vom Beginn der Q-Welle (oder der R-Welle, wenn die Q-Welle nicht sichtbar ist) bis zum Ende der T-Welle. Um Intervalle und Dauern zu berechnen, ist daher die korrekte Identifizierung von Start und Ende der P-Welle, des QRS-Komplexes und der R-Welle von entscheidender Bedeutung.</li>
		<li>Korrigieren Sie fehlerbeglichene Fehler bei der automatischen Identifizierung, indem Sie die falsch platzierten Cursor an die entsprechenden Positionen bewegen.</li>
		<li>Wählen Sie den negativen Peak der S-Welle als Ende des QRS-Komplexes7 aus, da der Zebrafisch J-Punkt, der das Ende der S-Welle signalisiert, besonders schwer genau zu identifizieren ist. Dies führt zu einer leichten Unterschätzung der wahren QRS-Dauer. HINWEIS: Die EKG-Analysesoftware korrigiert automatisch das QT-Intervall auf die ventrikuläre Rate (oder das RR-Intervall), um das korrigierte QT-Intervall QTc mit der vom Benutzer in Schritt 6.1.3 vorgewählten Methode zu generieren, z. B. Bazett (Abbildung 5A). Die Bazett-Formel (1920) QTc = QT / RR ist die beliebteste und die erste von mehreren Methoden vorgeschlagen, um das menschliche QT-Intervall für die Herzfrequenz zu korrigieren. Da die Genauigkeit der Bazett-Formel in Frage gestellt wurde, beziehen Sie sich auf andere Methoden, die für den Menschen vorgeschlagen werden10,11 und Zebrafisch6 (Abbildung 5D).</li>
	</ol></li>
	<li>Interpretieren von EKG-Anomalien durch Anerkennung von Ausnahmen für die vier Validierungskriterien in Schritt 4.3.<ol>
<li>Erkennen Sie Ausnahmen für Kriterium 1. In Ermangelung von P-Wellen (was auf das Fehlen von Sinusrhythmus hinweist), verlassen Sie sich auf die RR-Intervalle und QRS-Dauer, um den Herzrhythmus zu diagnostizieren. Wenn die RR-Intervalle unregelmäßig sind, diagnostizieren Sie beispielsweise Vorhofflimmern; Wenn die RR-Intervalle regelmäßig sind und der QRS normalerweise schmal ist, diagnostizieren Sie den Junctional Escape-Rhythmus; andererseits, wenn die RR-Intervalle regelmäßig sind und der QRS ungewöhnlich verlängert wird, diagnostizieren ventrikulärer Escape-Rhythmus.</li>
		<li>Erkennen Sie Ausnahmen für Kriterium 2. Wenn die P-Welle negativ (oder invertiert) ist, diagnostizieren Sie die retrograde Vorhofaktivierung von einem ektopischen Herzschrittmacher (z. B. einer Atrialstelle nach dem Sinusknoten, dem atrioventrikulären Knoten oder dem Ventrikel).</li>
		<li>Erkennen Sie Ausnahmen für Kriterium 3. Wenn hohe und schmale Q-Wellen mit negativen P- und negativen T-Wellen vorhanden sind, diagnostizieren Sie die Bleiumkehr aufgrund eines fehlerhaften Schalters der positiven und negativen Elektrodenpositionen, da diese hohen und schmalen Q-Wellen echte R-Wellen waren, die irrtümlich invertiert wurden (Abbildung 6D ). Im Gegensatz dazu diagnostizieren, wenn breite Q-Wellen mit positiven P-Wellen nach einer signifikanten Herzverletzung vorhanden sind, Myokardinfarkt, da diese breiten Q-Wellen wahre pathologische Q-Wellen sind.</li>
		<li>Erkennen Sie Ausnahmen für Kriterium 4. Wenn die T-Welle invertiert ist, überprüfen Sie die ventrikuläre Aktivierung, um festzustellen, ob die ventrikuläre Repolarisationsanomalie primär oder sekundär ist. Verlassen Sie sich auf das klinische Szenario, um die richtige Diagnose aus einer Differentialliste der primären ventrikulären RepolarisationAnomalie (von Arzneimittelwirkungen oder Myokardischämie; Abbildung 6C) im Vergleich zu sekundärer ventrikulärer Repolarisationsanomalie (aufgrund einer aberranten ventrikulären Aktivierung durch Vorerregung, ventrikuläre Ektologie oder ventrikuläres Tempo).</li>
	</ol></li>
	<li>Exportieren von EKG-Ergebnissen.<ol>
<li>Wählen Sie Tabellenansicht aus, um alle EKG-Messungen zu überprüfen. Wählen Sie die gewünschten Maße aus, um es zu kopieren und in das gewünschte Dokument einzufügen (z. B. Excel-Tabelle).</li>
		<li>Um eine EKG-Ablaufverfolgung zu exportieren, markieren Sie einen Abschnitt, der mit dem Lupensymbol am EKG-Sweep interessiert ist. Kopieren und einfügen Sie in das gewünschte Dokument (z. B. Word oder PowerPoint).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Bei der Erfassung von in vivo EKG für erwachsene Zebrafische mit einem einzigen Blei, wie wir in dieser Studie gezeigt haben, gibt es eine Reihe von Vorbehalten hinsichtlich der Qualität und Gültigkeit der EKG-Aufzeichnungsergebnisse. Erstens, bei der Auswahl der geeigneten Anästhetika und die Bestimmung der minimal benötigten Anästhesie Konzentration, Tiefe, und Dauer, balancieren die Anästhesie Kardiotoxikitäten gegen die kritische Notwendigkeit, Bewegungsartefakte zu unterdrücken und die a priori Bestimmung für ein Überleben vs. terminales experimentelles Design. Nutzung der synergistischen Potenz einer Kombination von Multiplen Anästhetikaaus verschiedenen Wirkstoffklassen 5,14 und Paralytika1,6 zur Senkung der Dosis einzelner Wirkstoffe5 oder eine niedrige Erhaltungsdosis nach einer höheren Induktionsdosis sind typische Strategien. Trotz seiner bekannten potentiellen kardiorespiratorischen Toxizitäten, einschließlich Tod8,ist Tricain immer noch das am weitesten verbreitete, das beste verfügbare und das einzige Anästhetikum, das von der US Food and Drug Administration (FDA) für Zebrafische zugelassen wurde. Anästhesie. Tricain wurde im Volksmund in der EKG-Aufnahme von erwachsenen Zebrafischen entweder als Einzelmittel oder in Kombination mit anderen Anästhetika oder Paralytika verwendet.
Zweitens kann die Bleiplatzierungsgenauigkeit zumindest für gesunde normale Zebrafische mit unseren vier Validierungskriterien für ein normales erwachsenes Zebrafisch-EKG gewährleistet werden. Von den vier Validierungskriterien, die wir hier vorschlagen, bestätigen die letzten beiden Kriterien zusammen die grundlegende Übereinstimmung zwischen der Polarität der R-Welle und der Der T-Welle in einem normalen EKG5,7,15. Diese R- und T-Wellenkonkordanz ist eine zufällige, aber kritische Ähnlichkeit zwischen Zebrafisch und menschlichem16,17 normalem EKG, die zur klinischen Relevanz des Zebrafischherzmodells als Ersatz für menschliches Herz beiträgt. Elektrophysiologie. Mehrere gutartige oder bösartige Bedingungen können jedoch eines der vier Validierungskriterien ungültig machen. Zum Beispiel geht die R- und T-Wellenkonkordanz in myokardialer Ischämie7,15verloren. Dieser Verlust der R- und T-Wellenkonkordanz in der Myokard-Ischämie ist eine weitere frappierende Ähnlichkeit zwischen Zebrafisch und menschlichem EKG, die zur klinischen Relevanz des Myokardinfarktmodells des Zebrafischs beiträgt.
Schließlich empfehlen wir eine Standardpraxis in der EKG-Analyse. Mit dem Aufkommen der Technologie kann die EKG-Analysesoftware eine automatische EKG-Interpretation generieren. Wir empfehlen jedoch dringend, dass geschulte Menschen immer alle EKGs auf der Grundlage des jeweiligen klinischen Szenarios, das zur EKG-Aufzeichnung führt, neu interpretieren und überprüfen sollten. Eine routinemäßige übermäßige Abhängigkeit ausschließlich auf die automatische Interpretation durch eine EKG-Analysesoftware ist nicht ratsam, insbesondere in Gegenwart gängiger normaler EKG-Varianten, Herzpathologien oder suboptimaler Bleiplatzierung.
Diese Studie konzentriert sich auf die minimalinvasive Methode für kurze EKG-Aufnahmesitzungen. Sollte jedoch eine stundenlange, verlängerte EKG-Aufnahmesitzung erforderlich sein, sind Änderungen erforderlich, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung, Hydratation und Anästhesie durch kontinuierliche Durchblutung zu gewährleisten6.
Erhöhen Sie außerdem das Signal-Rausch-Verhältnis um mindestens drei Möglichkeiten. Die Wahl eines leistungsstärkeren Verstärkers ist oft eine kostspielige, wenn nicht gar unpraktische Option. Das Öffnen des Perikardsacks zur Reduzierung des Volumenleiters ist ein vernünftiger, wenn auch invasiver Ansatz, der angenommen wurde7. Strategische Bleiplatzierung, um die Bleiachse in einer Richtung parallel zur Hauptherzachse auszurichten (Abbildung 4B) wird die EKG-Spannungssignale maximieren, kann aber Versuch und Fehler erfordern, insbesondere in Abwesenheit einer Perikardiotomie.
Die hier vorgestellte In-vivo-EKG-Abfragemethode für erwachsene Zebrafische bietet vier Hauptvorteile. Erstens erfordert unser minimalinvasiver Ansatz nur elektrodeneinschubs, aber keine Entfernung von Fischen oder Thorakotomie-Perikardiotomie. Daher ermöglicht unser Ansatz durch die Minimierung der Schmerzen für die Fische wiederholte EKG-Verhöre in Längs-Überlebensstudien. Zweitens: Wenn Anästhetika die Fischbewegung angemessen unterdrücken, ergibt das in vivo EKG-Aufzeichnungssystem in unserer Studie konsequent ein zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis mit geräuschfreien Rohsignalen. Drittens stellt die hier vorgeschlagene Qualitätsvalidierung mit vier Kriterien datengenauigkeit und Robustheit zu einem frühen Zeitpunkt der EKG-Datenerfassung sicher und minimiert bedienerabhängige Schwankungen. Schließlich kapselt insbesondere unser letztes Validierungskriterium (die normale T-Welle ist aufrecht) die Übereinstimmung der R-Welle und der T-Welle, ein wichtiges menschenähnliches Merkmal des Zebrafisch-Normal-EKG (Abbildung 1).
Es gibt jedoch noch vier wesentliche Einschränkungen der aktuellen In-vivo-EKG-Methodik für erwachsene Zebrafische durch unsere Gruppe und andere.
Erstens erfordert die mangelnde zusammenarbeit der Themen die Notwendigkeit einer Anästhesie mit ihren begrenzten Folgen für die kardiorespiratorische Toxizität. Für in vivo EKG-Verhör, während menschliche Patienten nie Sedierung benötigen, Zebrafische immer Anästhetika oder Paralytika benötigen, die alle variable kardiorespiratorische Toxizitäten verursachen.
Zweitens erhöht die Notwendigkeit, das angeschlossene EKG zu sichern, die Invasivität eines ansonsten nicht-invasiven Verfahrens leicht. Während die Bleiplatzierung in der Körper-Oberflächen-EKG-Aufzeichnung von Menschen völlig nicht-invasiv ist, da Elektroden an der menschlichen Epidermis haften, ist die Bleiplatzierung für die In-vivo-EKG-Aufzeichnung von Zebrafischen invasiver, da Stahlelektroden zumindest Stahlelektroden die Fischhaut für ein sicheres Einführen in die Fischmuskulatur punktieren.
Die letzten beiden Einschränkungen ergeben sich aus den anatomischen Zwängen der Zebrafischbrust und des Herzens. Drittens erfordert die winzige Größe des erwachsenen Zebrafischherzens eine drastische Verringerung der Anzahl der EKG-Leitungen. Während Menschen in einer Standard-EKG-Aufnahme problemlos zwölf Leads aufnehmen, können erwachsene Zebrafische in der Regel nur ein einziges unipolares oder bipolares Blei aufnehmen. Die Verzweigung eines einzelnen EKG-Leads ist die Herausforderung, gleichzeitig die Amplituden aller drei P-, R- und T-Wellen zu optimieren. Daher kann die Bedeutung einer optimalen und genauen Bleiplatzierung in Zebrafisch-EKG-Verhören nicht überbewertet werden. Bei Zebrafischen stellt die T-Welle eine einzigartige Entdeckungsherausforderung dar, da sie oft die kleinste dieser drei Wellen ist. Daher sollte die Zebrafisch-T-Wellenamplitude Optimierungspriorität gegenüber den typischerweise größeren P- und R-Wellen erhalten.
Viertens kann die Bestimmung der Hauptherzachse des Zebrafisches zur Maximierung der R-Wellenamplitude eine Herausforderung sein. Der Grund dafür ist, dass das Zebrafischherz in seinem lockeren Perikardsack mehr Bewegungsfreiheit hat als das menschliche Herz in seinem formschlüssigen Handschuh-ähnlichen Perikard.
Insgesamt werden diese Beschränkungen die zukünftige Methodinnovation fördern. Mit dem Aufkommen des 3D-Drucks und der verformbaren Elektronik18besteht die Hoffnung auf eine direkte Bleiimplantation eines Tages in wach, wachsam, schwimmenden Zebrafischen mit einer "Herzsocke" von drahtlosen Elektrodensensoren.

Das Zebrafisch (Danio rerio) Herz befindet sich anteroventral an der Brusthöhle zwischen dem Operculum und den Brustgürteln. Das Herz ist ziemlich locker in einem silberfarbenen Perikardsack eingeschlossen. Anatomisch unterscheidet sich das Zebrafischherz von den vierkammerigen menschlichen und anderen Säugetierherzen aufgrund seiner geringen Skala (100-fach kleiner als das menschliche Herz) und seiner zweikammerigen Struktur, die nur aus einem Atrium und einem Ventrikel besteht. Nichtsdestotrotz sind die Elektrokardiogramm-Wellenformen (EKG) und die Dauer des QT-Intervalls beider Arten bemerkenswert ähnlich (Abbildung 1). Dementsprechend hat sich Zebrafisch als ein beliebtes Modell für die Untersuchung von menschlichen vererbten Arrhythmien1,2,3 und für High-Throughput-Medikamente Screening von potenziellen menschlichen Kardiotoxikitäten4,5 , wie z. B. QT-Verlängerung.
Bei der routinemäßigen Beurteilung menschlicher Herzerkrankungen ist das Körper-Oberflächen-EKG seit seiner Erfindung durch Einthoven 1903 das am weitesten verbreitete nichtinvasive Diagnoseinstrument der ersten Linie geworden. Im Gegensatz dazu ist diese Technik seit der ersten Anpassung der Körper-Oberflächen-EKG-Aufzeichnungsmethode für erwachsene Zebrafische im Jahr 20066 und mehreren Modifikationen danach7für viele Forscher auf diesem Gebiet weitgehend unzugänglich geblieben. die Popularität dieses Tiermodells. Bei anderen Forschern, die In-vivo-EKG-Verhöre für erwachsene Zebrafische durchführten, führten große Unterschiede zwischen den Bedienern zu Inkonsistenzen in EKG-Befunden aus verschiedenen Studien. Häufige Gründe sind umständliche und teure spezialspezifische Geräte und Software, ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und Verwirrung in Bezug auf die Platzierung der Elektroden, die alle durch ein unvollständiges Verständnis der eKG-Funktionen für erwachsene Zebrafische und zugrunde liegenden Gewebemechanismen. Da in vivo EKG das einzige diagnostische Werkzeug für lebende Zebrafische ist, besteht ein klarer Bedarf an einer standardisierten Methode zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Spezifität, Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit.
Hier stellen wir einen praktischen, zuverlässigen und validierten Ansatz zur Aufzeichnung und Interpretation von Zebrafischen in vivo Elektrokardiogrammen vor (Abbildung 2). Mit einem einzigen bipolaren Blei in der Frontalebene untersuchten wir die Veränderungen der EKG-Wellenformen und Intervalldauern von lebenden anästhesisierten gesunden Wildtyp AB erwachsenen Zebrafischen.

<table><tbody><tr><td>Kulturschalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087571</td><td>100 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette</td><td>Feinwerkzeuge</td><td>11253-20</td><td>0,1 x 0,06 mm</td></tr><tr><td>FE136 Tierische Biozange</td><td>AD Instruments</td><td>FE231</td><td></td></tr><tr><td>Iris Pinzette</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11064-07</td><td>0,6 x 0,5 mm</td></tr><tr><td>LabChart 8 Pro</td><td>AD Instruments</td><td></td><td>Software mit EKG-Modul</td></tr><tr><td>Nadelelektroden für die Tierbiologie</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1213</td><td>29 Gauge</td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipetten aus Kunststoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-669-12</td><td>6 Zoll, 1,2 mL</td></tr><tr><td>PowerLab 4/35</td><td>AD Instruments</td><td>4//35</td><td></td></tr><tr><td>Scheren</td><td>Feinwerkzeuge</td><td>15000-08</td><td>2,5 mm, 0,075 mm</td></tr><tr><td>Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat)</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>MS-222</td></tr></tbody></table>

in vivo surface elektrokardiographie für erwachsene zebrafische

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

Die Elektrokardiogramm-Wellenformen von erwachsenen Zebrafischen und denen des Menschen sind bemerkenswert ähnlich. Diese Elektrokardiogrammähnlichkeiten erhöhen den Wert von Zebrafischen nicht nur als Forschungsmodell für die menschliche Herzelektrophysiologie und Myopathien, sondern auch als Ersatzmodell im Arzneimittel-Screening mit hohem Durchsatz für potenzielle Kardiotoxizitäten Menschen, wie z. B. QT-Verlängerung. Daher ist die In-vivo-Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische ein elektrisches Phänotypisierungswerkzeug, das für querschnitts- oder Längs-in-vivo-Elektrophysiologische Charakterisierungen notwendig, wenn nicht gar unverzichtbar ist. Zu oft stellt jedoch das Fehlen einer zuverlässigen, praktischen und kostengünstigen Aufzeichnungsmethode nach wie vor eine große Herausforderung dar, die verhindert, dass dieses In-vivo-Diagnoseinstrument leichter zugänglich wird. Hier beschreiben wir einen praktischen, unkomplizierten Ansatz zur In-vivo-Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische mit einem wartungsarmen, kostengünstigen und umfassenden System, das konsistente, zuverlässige Aufnahmen liefert. Wir veranschaulichen unser Protokoll mit gesunden erwachsenen männlichen Zebrafischen im Alter von 12-18 Monaten. Wir führen auch eine schnelle Echtzeit-Interpretationsstrategie für die Qualitätsvalidierung ein, um Datengenauigkeit und Robustheit früh im Prozess der Elektrokardiogrammaufzeichnung sicherzustellen.

Abbildung 1 zeigt die klinische Relevanz der hier vorgestellten Methode. Die In-vivo-Oberflächenelektrokardiographie für erwachsene Zebrafische ist aufgrund der bemerkenswerten Ähnlichkeiten zwischen Zebrafisch und menschlichem EKG trotz ihrer enormen anatomischen Unterschiede ein wesentliches elektrisches Phänotypisierungswerkzeug. Das Zebrafischherz hat nur ein Atrium und eine Herzkammer im Gegensatz zum menschlichen Herz mit zwei Vorhöfen und zwei Ventrikeln (obere Reihe; rechts bzw. links). Trotz seiner scheinbaren anatomischen Einfachheit teilt das Zebrafischherz jedoch mehrere EKG-Funktionen mit dem menschlichen Herzen (untere Reihe; rechts bzw. links). Elektrophysiologie5,12,13. Abbildung 1 zeigt eine kleine, aber deutliche Q-Welle eines lebenden, gesunden 14 Monate alten Zebrafisches. Im Zebrafisch-EKG ist die Bleipositionierung jedoch nicht allgemein optimiert, um die Q-Welle zu demonstrieren. Daher ist die Q-Welle häufig unsichtbar, und ein RS-Komplex wird häufiger gesehen als der vollständige QRS-Komplex im Zebrafisch-EKG.
Abbildung 2 fasst die vier wesentlichen Aktionsschritte zur minimalinvasiven In-vivo-Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische zusammen. Nach Anästhesieinduktion (Schritt 1) und Elektrodenplatzierung (Schritt 2) zeichneten wir Basis-EKG-Signale (Schritt 3) von gesunden Wild-AB-Zebrafischen im Alter von 12 bis 18 Monaten auf (n = 9). Unsere Elektrodeneinstecktechnik war nur minimal invasiv, da wir keine Fischschuppen schälen oder Perikardiotomie durchführen mussten. Nach der Datenerfassung haben wir jede EKG-Aufzeichnung (Schritt 4) manuell überprüft und überprüft, um mögliche Fehlinterpretationen durch automatische Softwareanalyse zu vermeiden.
Abbildung 3 zeigt die drei unverzichtbaren Komponenten eines typischen EKG-Datenerfassungs- und -verarbeitungssystems: eine leistungsstarke Datenerfassungshardware, einen Hochverstärkungsdifferenzverstärker und einen mit Software für EKG-Daten hochgeladenen Computer. Akquisition und Analyse. In unserem Labor haben wir ein bestehendes kommerzielles In-vivo-EKG-Aufzeichnungssystem angepasst, das ursprünglich für kleine Säugetiermodelle (wie Mäuse, Ratten und Kaninchen) entwickelt wurde, um das Modell der erwachsenen Zebrafische aufzunehmen.
Abbildung 4 zeigt, dass die richtige Bleiplatzierung eine Ausrichtung des Leads an der vermuteten Herzhauptachse erfordert. Bei Zebrafischen in vivo EKG-Aufnahmen, da nur ein einziges Blei verwendet wird, ist eine korrekte Bleipositionierung zur gleichzeitigen Maximierung von R- und T-Wellenamplituden von entscheidender Bedeutung. Um Die R- und T-Wellenamplituden zu maximieren, richteten wir die positiven und negativen Bleielektroden an der Herzhauptachse aus, vermutlich in der linken kaudalen bis rechten Schädelausrichtung. Nach Thorakotomie und Perikardiotomie, um den Perikardsack zu öffnen und das Herz freizulegen, wird die Herz-Hauptachse sichtbar (Abbildung4B weiße gestrichelte Linie). Tatsächlich ist die Perikardiotomie zur Belichtung des Herzens eine häufig verwendete Strategie zur Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses7 auf Kosten der Umwandlung der EKG-Aufzeichnung von einem minimalinvasiven in ein hochinvasives Verfahren.
Abbildung 5 zeigt kritische Schritte in der EKG-Analyse. Zunächst haben wir die verschiedenen Parametereinstellungen für die automatische Softwareanalyse mit dem Dialogfeld EKG-Einstellungen (Abbildung5A)vordefiniert. Da wir ein bestehendes EKG-Aufzeichnungsgerät für Säugetiermodelle für erwachsene Zebrafische umfunktionieren, ist die Einstellung "Erkennung und Analyse" für Zebrafische nicht verfügbar. Wir wählten stattdessen die Human Preset, angesichts der bemerkenswerten Ähnlichkeit von Zebrafisch EKG mit menschlichen EKG (Abbildung 5A). Zweitens haben wir die automatische EKG-Identifikation der R-Wellenspitzen manuell überprüft (in schwarz) und (in rot) alle Fehler der R-Welle zur automatischen Identifizierung korrigiert, bevor wir der Software befehlen, die durchschnittliche ventrikuläre Rate neu zu berechnen. In Abbildung 5Bz. B. täuschte eine große P-Welle in Bezug auf die R-Welle die Software dazu, die R-Wellen falsch zu identifizieren, was zu einer anschließenden automatischen Fehlberechnung des RR-Intervalls oder der ventrikulären Rate führte. Daher sind menschliche Verifizierung und geeignete Korrekturen bei Bedarf bei der EKG-Analyse von entscheidender Bedeutung. Drittens haben wir die Regelmäßigkeit des Rhythmus schnell bewertet und die durchschnittliche Dauer von Wellen und Intervallen mithilfe der Mittelungsansicht (Abbildung 5C) berechnet, um mehrere aufeinander folgende Herzzyklen (grün) in einem einzigen durchschnittlichen Signal (schwarz) zu verketten. Hier in Abbildung 5Cspricht die vernachlässigbare Abweichung zwischen jedem der neun Herzzyklen und dem durchschnittlichen Signal für die ausgezeichnete Rhythmusregularität dieses Zebrafischherzens. Schließlich haben wir der Software ermöglicht, das QT-Intervall für die Herzfrequenz mit Bazett, einer der sieben verfügbaren Methoden, automatisch zu korrigieren (Abbildung5D).
Abbildung 6A -C zeigt, wie sich die Tiefe der Elektrodenplatzierung auf die Amplituden der EKG-Signale auswirkt. Wenn wir die Elektroden fälschlicherweise zu oberflächlich in die Dermis eingefügt haben (Abbildung 6A), war das Blei "indirekt" (mehr als zwei Herzdurchmesser aus dem Herzen, ähnlich wie die indirekten standardmenschlichen EKG-Gliederleitungen I, II und III) und die Spannung Signale waren klein. Wenn wir die Elektroden 1 mm tiefer in die Pectoralis-Muskulatur (Abbildung6B)eingesetzt haben, wurde die Leitung "halbdirekt" (in unmittelbarer Nähe, aber nicht in direktem Kontakt mit dem Herzen) und die Spannungssignale erhöhten sich. Die EKG-Wellenformen wurden gut sichtbar. Wenn wir die Elektroden jedoch noch tiefer in den Ventrikel eingesteckt haben (Abbildung6C), wurde die Leitung "direkt" (in direktem Kontakt mit dem Herzen) und die Spannungssignale nahmen weiter zu. Die R-Wellenamplitude in Abbildung 6C hat sich im Vergleich zu Abbildung 6A um das Achtfache und im Vergleich zu Abbildung 6Bum das Vierfache erhöht. Die EKG-Spur in Abbildung 6C zeigte jedoch neue Anzeichen einer Verletzung des ventrikulären Myokards, wie neue ST-Depression und neue T-Welleninversion.
Abbildung 6D zeigt, wie die ungewöhnlichen Inversionen aller EKG-Wellenformen (P, Q, R, S und T) einen Bleiumkehrfehler signalisieren sollten, bei dem die positiven und negativen Elektroden an ortgestellt sind. Beachten Sie, dass Q und S per Definition immer negativ sind, während R immer positiv ist.
Abbildung 6E -F zeigt, wie unangemessene Anästhesietiefe die Qualität der In-vivo-EKG-Aufnahme beeinträchtigen kann. In Abbildung 6Eführte eine unzureichende Anästhesie (0,017% Tricain) dazu, dass der Zebrafisch nicht vollständig immobilisiert wurde. Die resultierenden Bewegungsartefakte senkten das Signal-Rausch-Verhältnis, indem sie sowohl das Signal (Sternchen) kontaminierten als auch das Rauschen (Pfeile) erhöhten. Im Gegensatz dazu induzierte in Abbildung 6Füberdosierte Anästhesie (0,08% Tricain) eine schwere Sinusbradyarrhythmie sowie Veränderungen des ST-Segments und der T-Welle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig1.jpg"> Abbildung 1: Kontrastanatomie und EKG von Menschen- und Zebrafischherzen. Im Gegensatz zum menschlichen Herzen mit zwei Vorhöfen und zwei Ventrikeln hat das Zebrafischherz nur ein Atrium und einen Ventrikel (obere Reihe). Abkürzungen: RA, rechtes Atrium; LA, linkes Atrium; RV, rechter Ventrikel; LV: linker Ventrikel. Das Zebrafischherz teilt mehrere gemeinsame EKG-Funktionen mit dem menschlichen Herzen (untere Reihe). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig2.jpg"> Abbildung 2: Minimalinvasives In-vivo-EKG-Aufzeichnungsprotokoll. Ein schematisches Flussdiagramm veranschaulicht vier kritische Aktionsschritte bei der Durchführung einer In-vivo-EKG-Abfrage: Anästhesie induzieren, EKG-Bleielektroden platzieren, EKG aufzeichnen und die EKG-Aufnahmen analysieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig3.jpg"> Abbildung 3: EKG-Datenerfassungs- und -verarbeitungssystem. Zu den drei Hauptkomponenten eines integrierten In-vivo-EKG-Aufzeichnungssystems gehören eine Hardware zur Datenerfassung, ein Verstärker und Eine Computersoftware für die Datenerfassung und -analyse. Der Verstärker wird mit drei gebrauchsfertigen 29-Spur-Edelstahl-Mikroelektroden aus Edelstahl verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig4.jpg"> Abbildung 4: EKG-Leitungsplatzierung. Drei farbcodierte Edelstahlelektroden mit 29 Spurweiten werden bis ca. 1 mm tief sicher in die Fischmuskulatur eingesetzt. Die Platzierung der negativen (schwarzen) Elektrode und der positiven (roten) Elektrode stellt eine bipolare Führungslinie in der Frontalebene entlang einer linken kaudalen nach rechten Schädelausrichtung her. Abkürzung: ref, referenz elektrode <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig5.jpg"> Abbildung 5: C ritäre Schritte in der EKG-Analyse. (A) Vordefinieren Sie die verschiedenen Parametereinstellungen für die automatische Softwareanalyse. (B) Manuell korrigieren (rot) zwei automatische Fehlidentifikationen durch die Software (schwarz) der P- und R-Wellen, um softwarefehle Berechnungen der Atrial- und Ventrikulatärrate zu korrigieren. (C) Verketten Sie neun aufeinander folgende Herzzyklen (grün) in ein einziges durchschnittliches Signal (schwarz), um Rhythmusregelmäßigkeiten/Unregelmäßigkeiten schnell zu bewerten und die durchschnittliche Dauer von Wellen und Intervallen zu berechnen. (D) Korrigieren Sie das QT-Intervall für die Herzfrequenz mit einer der verschiedenen Methoden, wie Z. B. Bazett. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig6.jpg"> Abbildung 6: Auswirkungen der Bleiplatzierung und der Anästhesietiefe auf EKG-Signale. Zwei kritischste Schritte, die den Erfolg der in vivo EKG-Aufnahme bestimmen, sind Bleiplatzierung (A-D) und Anästhesietiefe (E-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier präsentieren wir eine zuverlässige, minimalinvasive und kostengünstige Methode zur Aufzeichnung und Interpretation von Elektrokardiogrammen in lebenden anästhesisierten erwachsenen Zebrafischen.

In Vivo Surface Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

Die in vivo elektrische Kardiographie ist das einzige diagnostische Werkzeug für die elektrische Phänotypisierung bei lebenden Zebrafischen in Querschnitts- und Längsstudien. Unser Ansatz ist praktisch, minimal invasiv und kostengünstig, da wir ein Datenerfassungssystem für Säugetiere umfunktionieren. Wir legen Wert auf die Strategie der Echtzeit-EKG-Interpretation zur frühzeitigen Validierung der Datenqualität.Da die EKGs von Mensch und Zebrafisch ähnlich sind, erleichtert die In-vivo-Elektrokardiographie die Verwendung von Zebrafischen bei der Modellierung der menschlichen Herzphysiologie sowie das Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz auf Kardiotoxizitäten wie QT-Verlängerung. Eine korrekte Lead-Positionierung ist der Schlüssel zum Erfolg. Da die normale Zebrafisch-T-Welle die kleinste ist, priorisieren Sie die Optimierung ihrer Amplitude gegenüber der größeren P- und R-Welle.Studieren Sie normale und pathologische EKG-Muster, um Ihre EKG-Ergebnisse selbst zu interpretieren. Verlassen Sie sich nicht nur auf die automatische Interpretation der EKG-Analysesoftware. Transportieren Sie am Tag des Experiments den Zebrafisch aus dem Aquarium ins Labor.Um das In-vivo-EKG-Aufzeichnungssystem einzurichten, verbinden Sie die wesentlichen Geräte und legen Sie die drei farbcodierten Edelstahlelektroden des EKG-Leads in die drei farblich abgestimmten Zugangsportale des Verstärkers ein. Zur Induktion der Anästhesie stufe 4 einen erwachsenen Zebrafisch in eine Schale eintauchen, die eine Lösung von Anästhetika in den niedrigsten vorbestimmten Konzentrationen enthält, die vom institutionellen Tierpflege- und Gebrauchsausschuss genehmigt wurden. Sobald der Zebrafisch die Anästhesie der Stufe 4 für drei Sekunden aufrechterhalten hat, verwenden Sie ein Paar stumpfe Zangen, um den Fisch sofort auf einen feuchten Schwamm mit einem Schlitz, einer ventralen Oberfläche nach oben, für die Platzierung der drei EKG-Elektroden zu übertragen.Setzen Sie die positive Elektrode vorsichtig in die ventrale Mittellinie auf Höhe des Bulbus arteriosus ein bis zwei Millimeter über einer imaginären Linie ein, die die beiden unteren Ränder der Operculums verbindet. Positionieren Sie die negative Elektrode kauarisch und 0,5 bis einen Millimeter seitlich links zur positiven Elektrode in einem Abstand größer als die maximale apicobasale Länge des erwachsenen Zebrafischventrikels, und positionieren Sie dann die Referenzelektrode kauarisch in der Nähe des Analbereichs. Starten Sie das System für die EKG-Aufzeichnung und öffnen Sie das EKG-Datenerfassungsprogramm.Wählen Sie eine gewünschte Einstellung aus den Dropdown-Menüs für Reichweite, Tiefpass und Hochpass aus. Drücken Sie Start, um eine kontinuierliche lückenlose EKG-Aufnahme mit einer Abtastrate von einem Kilohertz zu initiieren. Um die Lead-Positionierung für ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren, drücken Sie Stop, um die Aufnahme zu stoppen und die Spur kurz nach dem allerersten Aufnahmeversuch für jedes Herz zu überprüfen.Wenn erwartet wird, dass das EKG normal ist, bestätigen Sie, dass alle EKG-Wellenformen unterschiedlich und gut sichtbar sind und dass die P-Welle, der Netto-QRS-Komplex und die T-Welle alle positiv sind. Der wichtigste Schritt ist die Lead-Positionierung, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Wenden Sie unsere vier Validierungskriterien nach dem allerersten EKG-Aufnahmeversuch für jeden Fisch an, um korrekturkorrektes Feedback zu erhalten.Wenn ein normales EKG erwartet wird, positionieren Sie die Elektroden nach Bedarf neu, bis alle diese vier Validierungskriterien erfüllt sind. Wenn eine normale T-Welle erwartet wird, aber die T-Welle zu klein ist, positionieren Sie die Elektroden neu, um die Amplitude der T-Welle zu maximieren. Setzen Sie die EKG-Aufnahme nach der Optimierung der Bleipositionierung fort und speichern Sie die EKG-Sweeps für die nachfolgende Analyse.Entfernen Sie am Ende der EKG-Aufnahmesitzung die Elektroden vorsichtig, ohne den Fisch zu verletzen. In Überlebensstudien übertragen Sie die Fische in frisches, sauerstoffreiches Fischwasser ohne Tricain. Bitte beachten Sie, dass in diesem Video die Lese- und Gehaltsversorgung der Fische aus der Anästhesie eingestellt wird, um den Lesern die Rückgewinnung von der Anästhesie zu erleichtern.Um die Erholung von der Anästhesie in Überlebensstudien zu erleichtern, verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um kräftig Wasser über die Kiemen zu spritzen, bis die Fische wieder regelmäßige Kiemenbewegung oder Schwimmen wieder aufnehmen, dann überwachen Sie die Fische für die vollständige Erholung von der Anästhesie, bevor Sie die Fische indas Aquarium zurück. Der Fisch gilt als vollständig aus der Anästhesie genesen, wenn er mindestens fünf Sekunden aufrecht schwimmen kann. Um die Analyseeinstellungen zu definieren, öffnen Sie das EKG-Datenanalyseprogramm und öffnen Sie die interessierte EKG-Datei, um die vollständige EKG-Ablaufverfolgung anzuzeigen.Verwenden Sie die Maus, um einen Abschnitt von Interesse in der EKG-Ablaufverfolgung zu analysieren. Wählen Sie im Menü EKG-Analyse EKG-Einstellungen aus, um ein Dialogfeld zu öffnen, um verschiedene Parametereinstellungen für die automatische Softwareanalyse vorzudefinieren. Analysieren Sie den Herzrhythmus und die Rate und bestimmen Sie, ob der Herzrhythmus Sinus ist oder nicht, regelmäßig oder unregelmäßig.Um die Herzfrequenz zu bestimmen, stellen Sie sicher, dass die Software alle P- und R-Wellen korrekt identifiziert, da die Atrial- und Ventrikulenrate auf dem PP- bzw. RR-Intervall basiert. Korrigieren Sie alle Fehler bei der automatischen Identifizierung, indem Sie die falsch platzierten Cursor auf die entsprechenden P- und R-Wellen bewegen. Um Intervalle und Wellendauern zu berechnen, öffnen Sie die EKG-Analyse und die Mittelungsansicht, um mehrere aufeinander folgende Herzzyklen zu einem einzigen durchschnittlichen Signal zu verketten.Stellen Sie sicher, dass die Software den Anfang und das Ende der P-Welle, den QRS-Komplex und die T-Welle korrekt identifiziert, und bewegen Sie dann die falsch platzierten Cursor an die entsprechenden Positionen, um Fehler bei der automatischen Identifizierung zu korrigieren. Um die EKG-Messungen zu exportieren, wählen Sie Tabellenansicht aus, um alle EKG-Messungen zu überprüfen und die von Interesse interessierten Messungen für die nachfolgende Analyse in eine Kalkulationstabelle zu kopieren und einzufügen. Um eine EKG-Spur zu exportieren, verwenden Sie die Lupe, um einen Abschnitt hervorzuheben, der für den EKG-Sweep von Interesse ist, und kopieren Und fügen Sie den Sweep in das gewünschte Dokument ein.Im Zusammenspiel mit dem menschlichen Herz, das zwei Vorhöfe und zwei Ventrikel hat, hat das Zebrafischherz nur ein Atrium und einen Ventrikel. Trotz seiner scheinbaren anatomischen Einfachheit teilt das Zebrafischherz mehrere EKG-Funktionen mit dem menschlichen Herzen. Die richtige Bleiplatzierung erfordert die Ausrichtung des Leads an der vermuteten Herzhauptachse.Wenn die Elektroden zu oberflächlich in die Dermis eingesetzt werden, gilt die Leitung als indirekt und die Spannungssignale sind klein. Wenn die Elektroden in die entsprechende Ein-Millimeter-Tiefe in die Pectoralis-Muskulatur eingesetzt werden, wird die Leitung halbdirekt und die Spannungssignale erhöhen sich. Werden die Elektroden jedoch tiefer als einen Millimeter in den Ventrikel eingesetzt, wird die Leitung direkt und die Spannungssignale steigen noch weiter an, wobei sich die R-Wellenamplitude im Vergleich zu dem Zeitpunkt, zu dem die Elektroden in der entsprechenden Tiefe eingesetzt werden, um das Vierfache erhöht.Die EKG-Spur von zu tief eingelegten Elektroden zeigt auch neue Anzeichen einer Verletzung des ventrikulären Myokards, wie eine neue ST-Depression und eine neue T-Welleninversion. Wenn die positiven und negativen Elektroden in ihrer Platzierung geschaltet werden, werden ungewöhnliche Inversionen aller EKG-Wellenformen beobachtet. Eine unangemessene Sedationstiefe kann auch die Qualität der In-vivo-EKG-Aufnahme beeinträchtigen.Denken Sie daran, tief genug zu beästhetieren, um die Fische zu immobilisieren, ohne sie zu töten. Positionieren Sie die Elektroden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren und eine übermäßige Abhängigkeit von der automatischen Softwareanalyse zu vermeiden. Nach diesem minimalinvasiven Überlebensverfahren ist es möglich, andere Verfahren wie partielle Ablation, Resektion des Herzens oder serielle EKG-Untersuchungen in Arzneimittelreaktionen oder Längsschnittstudien durchzuführen.Systemische Toxizitäten sind mögliche Komplikationen eines Anästhetikums, einschließlich Tricain. Diese Toxizitäten können reduziert werden, indem die Synergie mehrerer Anästhetika in Diem ausgegnet wird, um die Dosis einzelner Wirkstoffe zu senken.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt, wie man Elektrokardiographie-Messungen (EKG oder EKG) an einem Zebrafisch durchführt, einen Test, der die elektrische Aktivität des Herzens misst.

Zebrafisch-Elektrokardiographie (EKG): ein minimalinvasiver Assay zur Beurteilung der Herzfunktion

Das Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung der Elektrophysiologie bei erwachsenen Zebrafischen. Diese Methode kann zur Messung der neuronalen Aktivität in vivo verwendet werden.

Elektrophysiologie adulter Zebrafische: Eine Methode zur Messung der extrazellulären elektrischen Aktivität von Neuronen in vivo

Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, um Aufnahmen und Manipulation der neuronalen Aktivität in einem intakten Tier zu ermöglichen.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Die Verwendung von Zebrafischen für die Herz-Kreislauf-Forschung weitet sich auf die Forschung an erwachsenen Herzen aus. Für diese Anwendungen ist die schnelle und einfache Isolierung von Herzgewebe von entscheidender Bedeutung, um postmortale Veränderungen zu vermeiden und eine ausreichende Anzahl von Proben zu erhalten. Hier beschreiben wir eine schnelle und reproduzierbare Methode zum Präparieren von adulten Zebrafischherzen.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Wir beschreiben ein Protokoll zur Beurteilung der Herzmorphologie und -funktion bei erwachsenen Zebrafischen mittels hochfrequenter Echokardiographie. Die Methode ermöglicht die Visualisierung des Herzens und die anschließende Quantifizierung von funktionellen Parametern wie Herzfrequenz (HR), Herzleistung (CO), Bruchflächenänderung (FAC), Auswurffraktion (EF) sowie Blutzufluss- und Abflussgeschwindigkeiten.

Hochfrequenz-Ultraschall-Echokardiographie zur Beurteilung der Herzfunktion von Zebrafischen

Wir beschreiben optimierte Werkzeuge zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Insbesondere schlagen wir helle kardiale transgene Linien vor und präsentieren neue sanfte Einbettungs- und Immobilisierungstechniken, die Entwicklungs- und Herzfehler vermeiden. Eine mögliche Datenerfassungs- und Analysepipeline, die an die kardiale Bildgebung angepasst ist, ist ebenfalls vorhanden.

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die akute Isolierung lebensfähiger kardialer und vaskulärer glatter Muskelzellen aus adulten, juvenilen, larven und embryonalen Zebrafischen (Danio rerio), die für elektrophysiologische Untersuchungen geeignet sind.

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Dieses Protokoll verwendet Lichtblatt-Bildgebung, um die kontraktile Funktion des Herzens in Zebrafischlarven zu untersuchen und Einblicke in die Herzmechanik durch Zellverfolgung und interaktive Analyse zu gewinnen.

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Die Studie stellt Zebra II vor, ein fortschrittliches System zur verlängerten EKG-Erfassung und -Analyse bei Zebrafischen. Dieses System verfügt über ein unabhängiges Perfusionssystem und Mehrpunktelektroden für den Umgang mit mehreren Fischen in kontrollierten Umgebungen. Akute Wirkungen von Amiodaron wurden mit Wildtyp-Zebrafischen bewertet und analysiert.

Zebra II als neuartiges System zur Aufzeichnung elektrophysiologischer Signale im Zebrafisch

Ziel der Studie ist es, eine Technologie für anästhesiefreie Herzschlagmessungen in bewegten Zebrafischen zu entwickeln. Unser Ansatz kombiniert Kurzwellen-Infrarot-Bildgebung und auf maschinellem Lernen basierende Verfolgung des Herzens. Es handelt sich um eine nicht-invasive, markierungsfreie und benutzerfreundliche Technik, die sich für eine Vielzahl von Studien am Zebrafischmodell eignet.

Anästhesiefreie Herzschlagmessungen bei frei beweglichen Zebrafischen

Erfahren Sie eine praktische Methode zur in vivo Elektrokardiographie bei erwachsenen Zebrafischen. Diese minimal-invasive Technik ermöglicht zuverlässiges kardiales Monitoring für Grundlagenforschung und Arzneimittelscreening.

In Vivo Surface Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische

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