Isolierung von Makrophagen-Teilmengen und Stromalzellen von Menschlichen und Maus-Myokardproben
17. Dezember 2019
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um verschiedene Teilmengen von Makrophagen und anderen nicht-immunen Zellen aus menschlichem und Mausmyokard zu isolieren, indem eine einzelzellige Suspension durch enzymatische Verdauung vorbereitet wird. Gating-Schemata für die Strömungszytometrie basierende Identifizierung und Charakterisierung isolierter Makrophagen werden ebenfalls vorgestellt.
Das Herz enthält eine heterogene Population von Immunzellen, die eine entscheidende Rolle bei Herzentzündungen und Reparaturen spielen. Um die Heterogenität von Immunzellen zu verstehen und weitere Einblicke in ihre Funktion zu gewinnen, ist es wichtig, eine Methode zu haben, die die Rückgewinnung dieser Zellen aus dem Herzen ermöglicht. Diese Technik kann helfen, die Immun- und Nichtimmunzellvielfalt aufzudecken, die im gesunden oder kranken Herzen liegt.
Diese Technik hat drei Hauptvorteile. Erstens ist es ein einfacher einfacher einfacher Workflow, der innerhalb von drei Stunden zur Erzeugung einer Einzelzellsuspension verschiedener Zelltypen führt. Zweitens führt es zu einer hohen Wiederherstellung lebensfähiger Immun- und Nichtimmunzellenpopulationen.
Und drittens ist es eine sehr vielseitige Methode und kann auch auf Herzgewebe in anderen Arten angewendet werden. Es ist wichtig, auf die Menge an Gewebe zu achten, die für eine einzige Verdauungsreaktion verwendet wird. Verwenden Sie sterile Schere, sezieren Gewebe Probe von der apikalen oder seitlichen Wand der linken Herzkammer in kalter Saline oder HBSS.
Sezieren Sie sorgfältig Epikardialfett und Chordaetendineae aus der Probe. Mit Hilfe einer sterilen Klinge oder Schere, sezieren Sie die Gewebestücke in Stücke mit einem Gewicht von etwa 200 Milligramm. Nach dem Einschläfern der Maus, öffnen Sie die Brusthöhle mit Hilfe einer scharfen Schere.
Verwenden Sie stumpfe Hämostate, um das Herz nach oben zu heben. Durchnässen Sie das Herz mit kaltem PBS mit einer 25-Meter-Nadel, die an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist. Durchdringen, bis das Herz in Farbe blanchiert erscheint.
Entfernen Sie das Herz und legen Sie es in eine sterile Petrischale auf Eis. Legen Sie 200 Milligramm menschliche Herzgewebebrocken oder murines Herz in eine sterile Petrischale. Das Gewebe mit einer sterilen Klinge oder Schere fein zerkleinern.
Um Verdauungen einzurichten, in einem 15 Milliliter konischen Röhrchen, bereiten Sie ein endgültiges Verdauungsvolumen von drei Millilitern für jeden menschlichen Herzgewebebrocken oder ein murines Herz mit den Enzymen Kollagenase I, DNase I und Hyaluronidase in Konzentrationen von 450, 60 und 60 Einheiten pro Milliliter vor. Fügen Sie 2,5 Milliliter DMEM in die Röhre. Mit Hilfe sauberer Zangen das fein gehackte Gewebe in jedes Reaktionsrohr legen.
Durch sanftes Wirbeln gut mischen. Verdauen Sie für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einem schüttelarmen Inkubator auf eine niedrige bis mittlere Rührgeschwindigkeit eingestellt. Nach einer Stunde Verdauung die Schläuche aus dem Brutkasten nehmen und auf Eis legen.
Richten Sie 50 Milliliter konische Röhren mit einem 40 Mikron Zellsieb auf der Oberseite ein. Befeuchten Sie die Filter mit zwei Millilitern Enzymdeaktivierungspuffer. Als nächstes deaktivieren Sie die Verdauungsenzyme, indem Sie jedem Verdauungsröhrchen acht Milliliter Enzymdeaktivierungspuffer hinzufügen.
Dann gießen Sie die resultierenden 13 Milliliter Gesamtmischung durch das 40 Mikron Zellsieb in die 50 Milliliter konischen Röhren. Übertragen Sie die gefilterten Proben in frische 15 Milliliter Konusröhren. Drehen Sie die Proben bei 400 mal g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand und hinterlassen 0,5 Milliliter Medien. Setzen Sie das Zellpellet durch sanftes Pipettieren wieder auf und fügen Sie einen Milliliter ACK-Lysepuffer hinzu. Sanft wirbeln die Röhre und inkubieren bei Raumtemperatur für fünf Minuten, um rote Blutkörperchen Lyse durchzuführen.
Fügen Sie nach fünf Minuten im ACK-Puffer der Probe neun Milliliter DMEM hinzu. Legen Sie den Deckel wieder auf die Rohre und kehren Sie die Rohre vorsichtig um, um sie zu mischen. Filtern Sie durch ein 40 Mikron Zellsieb und sammeln Sie das Filtrat in 15 Milliliter konischen Röhren.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 mal g für sechs Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie einen Milliliter FACS-Puffer hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf. Dann in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen.
Zentrifugieren Sie wieder bei 400 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf. Eine Einzelzellsuspension ist nun bereit für die Antikörperfärbung.
Fügen Sie den Herzproben ein typisches menschliches Antikörperpanel bei einer bis 50 Verdünnung hinzu. Verwenden Sie verschiedene Antikörper für Stromalzellen und murine Herzmakrophagen. 30 bis 40 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.
Fügen Sie einen Milliliter FACS-Puffer, sanft Wirbel und Zentrifuge bei 400 mal g für fünf Minuten. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein zweites Mal. Setzen Sie dann die Probe in 350 Mikroliter FACS-Puffer wieder aus und fügen Sie DAPI hinzu, um eine endgültige Konzentration von einem Mikromolaren zu erreichen.
Die Proben sind nun für die FACS-Analyse bereit. In diesem Protokoll wurde die Isolierung von Makrophagen von Maus und menschlichem Myokard erreicht. Diese Abbildung zeigt unverarbeiteten und verarbeiteten menschlichen LVAD-Kern.
Das Gatingschema für die Strömungssortierung von CCR2-negativen und CCR2-positiven menschlichen Makrophagen aus humanem Myokard sowie für CD45-negative Stromalzellen aus humaner ischämischer Kardiomyopathie wurde vorgestellt. Die Bilder von Wright gefärbt FACS sortiert CD45 positive und CD45 negative Zellen zeigen intakte Zellmembran, die Lebensfähigkeit. Das Gating-Schema zum Sortieren von Makrophagen aus einem Mausherz war ebenfalls erfolgreich.
Das Gewicht des Gewebes, das für die enzymatische Reaktion verwendet wird, ist entscheidend für eine effiziente Verdauung. Verwenden Sie nicht mehr als 200 Milligramm Gewebe für die im Protokoll angegebenen Enzymkonzentrationen. Nach dieser Methode können Zellen für In-vitro-Stimulationstests kultiviert werden.
Zellen können für die Massen-RNA-Sequenzierung oder die Einzelzellsequenzierung sortiert werden. Diese Methode diente als unschätzbare Technik bei der Entdeckung der bisher unbekannten Makrophagenheterogenität, die im gesunden oder kranken menschlichen Herzen vorhanden ist. Mit dieser Methode gefolgt von Einzelzell-Sequenzierung, Studien sind im Gange, um aufzudecken, wie verschiedene Immun- und Nichtimmunzellen von krankem Herzen im Vergleich zum gesunden Herzen variieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung verschiedener Teilpopulationen von Makrophagen und nicht-immunen Zellen aus dem Myokard von Mensch und Maus. Durch die Herstellung einer Einzelzell-Suspension mittels enzymatischer Verdauung können Forscher die Heterogenität der Immunzellen bei kardialer Entzündung und Reparatur besser verstehen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Kardiovaskuläre Biologie
- Immunologie
Hintergrund
- Das Herz enthält eine vielfältige Population von Immunzellen.
- Diese Zellen spielen entscheidende Rollen bei der Herzentzündung und -reparatur.
- Das Verständnis ihrer Heterogenität ist entscheidend, um die Herzgesundheit zu untersuchen.
- Diese Technik unterstützt die Gewinnung sowohl von Immun- als auch Nicht-Immunzellen aus dem Herzen.
Zweck der Studie
- Isolierung und Charakterisierung von Makrophagen und anderen Zelltypen aus dem Myokard.
- Aufklärung der Diversität immuner und nicht-immuner Zellen in gesunden und erkrankten Herzen.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung kardialer Immunantworten.
Verwendete Methoden
- Enzymatische Verdauung zur Herstellung von Einzelzell-Suspensionen.
- Durchflusszytometrie zur Identifizierung und Charakterisierung von Zellen.
- Isolierung verschiedener Zelltypen aus humanem und murinem Myokard.
- Einfacher Workflow, der innerhalb von drei Stunden abgeschlossen ist.
Hauptergebnisse
- Hohe Ausbeute an vitalen Immun- und Nicht-Immunzellpopulationen.
- Effektive Isolierung von Makrophag-Subpopulationen.
- Nachgewiesene Heterogenität von Immunzellen im Herzgewebe.
- Erleichterung weiterer Forschung zu Entzündungsprozessen und Reparaturmechanismen im Herzen.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik stellt ein wertvolles Werkzeug für die kardiologische Forschung dar.
- Sie vertieft das Verständnis der Rolle von Immunzellen bei der Herzgesundheit.
- Zukünftige Studien können diese Methode nutzen, um Herzerkrankungen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der Heterogenität von Makrophagen im Herzgewebe ist entscheidend, um Zielstrukturen in der kardiovaskulären Arzneimittelentwicklung mit geringerem Risiko zu validieren. Dieses Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Isolierung von Immun- und Stromazellen-Subpopulationen aus menschlichem und murinem Myokard und unterstützt damit mechanistische Untersuchungen, die zur Zielvertrauensbildung und Portfolio-Priorisierung beitragen. Die Einfachheit und die Anwendbarkeit über Arten hinweg verbessern die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Funktionen von Makrophagen-Teilpopulationen in den Wegen der Herzentzündung und -reparatur.
- Operativer Wert: Bietet einen standardisierten Arbeitsablauf zur Isolierung lebensfähiger Immun- und Nicht-Immunzellen mit minimalen täglichen Schwankungen.
- Strategischer Wert: Unterstützt die hypothesengetriebene Validierung von Zielstrukturen, indem die zellulären Beiträge zu Krankheitsphänotypen geklärt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt gereinigte Zellpopulationen, die für funktionelle Assays und nachgeschaltete Omics-Anwendungen geeignet sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine hohe Ausbeute an vitalen Zellen innerhalb eines dreistündigen Arbeitsablaufs und damit die Standardisierung von Assays.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die skalierbare Herstellung von krankheitsrelevanten Systemen für die Wirkstoffscreening- und Target-Engagement-Studien.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht den direkten Vergleich von Immun- und Stromazellprofilen zwischen gesunden und erkrankten menschlichen Herzen.
- Operationaler Wert: Kompatibel mit Bulk- und Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur Biomarker-Entdeckung und mechanistischen Risikominimierung.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem zelluläre Phänotypen mit Krankheitszuständen über Arten hinweg verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Forschung ein und ermöglicht die Isolierung mechanistisch relevanter Zelltypen für funktionelle und genomische Analysen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Isolierung definierter Makrophagen- und Stromazell-Subpopulationen.
- Screening: Erzeugt standardisierte, lebensfähige Zellsuspensionen, die für die Assay-Entwicklung und Wirkstoff-Screenings geeignet sind.
- Analytik: Liefert quantitative Eingabedaten für Durchflusszytometrie, Sequenzierung und funktionelle Endpunkte, die vergleichende Analysen unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung mit der präklinischen Kontinuität durch die Anwendbarkeit über Arten hinweg und die Nutzung krankheitsrelevanter Proben.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Immunprofillierung in Modellen kardiovaskulärer Erkrankungen und weiteren therapeutischen Anwendungsbereichen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unschärfen bei immunvermittelten Herzerkrankungen reduziert werden.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch einen einfachen, zeiteffizienten Arbeitsablauf sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem frühzeitige biologische Entschärfung kardiovaskulärer Zielstrukturen ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf validierten zellulären Mechanismen in humanen und murinen Krankheitsmodellen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der enzymatischen Gewebe-Dissociation, der Durchflusszytometrie und im sterilen Zellhandling.
- Setzt den Zugang zu Kollagenase I, DNase I, Hyaluronidase, ACK-Lysepuffer und FACS-kompatibler Instrumentierung voraus.
- Erfordert standardisierte Protokolle zur Gewebe-Dissektion (z. B. 200 mg schwanzspitzen- bzw. seitliche linke Ventrikelstücke), um die Verdauungseffizienz sicherzustellen.
- Erfordert die Anpassung von Antikörpansets an artenspezifische Makrophagen- und Stromazellmarker (z. B. CCR2 für Menschen, CD45 für Mäuse).
- Eingeschränkt durch Qualität und Menge des Ausgangsgewebes; bei fibrotischen oder verkalkten Proben können suboptimale Ausbeuten auftreten.
