Name: Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Erfahren Sie die mechanische Dissoziation zur schnellen Isolierung von Makrophagen aus Dorsalwurzelganglien von Mäusen. Diese enzymfreie Methode ermöglicht effiziente Phänotypisierung für neuroimmunologische Studien.

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Die Studie wurde unterstützt von: Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); die UCSF-Abteilung für Anästhesie und Perioperative Versorgung (XY); und 1R01NS100801-01(GZ). Diese Studie wurde teilweise von der HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility durch ein Stipendium des NIH (P30CA082103) unterstützt.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California San Francisco genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt.
1. Sammeln Lenden wirbeln DRG von experimentellen Mäusen
<ol><li>Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, bereiten Sie die Arbeitslösung des Dichtegradientenmediums (z.B. Percoll) vor, indem Sie 9 Volumen des Mediums mit 1 Volumen ca++/Mg++ -frei10x HBSS mischen. Halten Sie es auf Eis.</li>
	<li>Anästhesisieren Sie die Maus mit 2,5% Avertin. Bestätigen Sie, dass das Tier durch die fehlende Reaktion auf die Hinterpfoten-Pinch vollständig beästhetisiert ist. HINWEIS: Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet.</li>
	<li>Durchdringen Sie die Maus transkardiniert mit 10 ml vorgekühlten 1x PBS.<ol>
<li>Legen Sie die Maus in die Supine-Position mit vier Pfoten mit dem Band in einer chemischen Rauchhaube gesichert. Heben Sie die Haut unter dem Rippenkäfig durch die Zange, und machen Sie einen kleinen Schnitt mit chirurgischer Schere, um die Leber und Daschglas freizulegen.</li>
		<li>Verwenden Sie weiterhin eine Schere, um die Membran und den Rippenkäfig zu schneiden, öffnen Sie die Pleurahöhle, um das schlagende Herz freizulegen.</li>
		<li>Schneiden Sie schnell das rechte Vorhof-Anhängseln mit Irisschere. Sobald die Blutung festgestellt wurde, legen Sie eine 30 G Nadel in das hintere Ende der linken Herzkammer, und langsam injizieren 10 ml vorgekühlte 1x PBS, um das Tier zu durchdringen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie dorsale Laminektomie15 auf der Maus an der anfälligen Position platziert. HINWEIS: Wenn die Zellkultur geplant ist, sprühen Sie die Maus vor dem Einschnitt mit 70% Ethanol und verwenden Sie vorsterilisierte chirurgische Instrumente zur Zerlegung.<ol>
<li>Verwenden Sie ein Skalpell der Größe 11, um eine längsseitige tiefe Einschnitte von der Brustregion bis in die sakrale Region zu machen. Entfernen Sie die Haut durch die Schere, um die dorsale Muskelschicht freizulegen.</li>
		<li>Verwenden Sie Friedman-Pearson Rongeur, um das Bindegewebe und die Muskeln abzuschälen, bis die lumbosakralen Wirbelsäulenprozesse und bilateralen Querprozesse exponiert sind.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Noyes Spring Scissor, um die rückenförmige Wirbelsäule vorsichtig zu öffnen, und wechseln Sie dann zu einem Friedman-Pearson Rongeur, um die Wirbelknochen zu entfernen, um das Rückenmark mit intakten Rückenmarksnerven freizulegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sezieren Sie ipsilaterale und kontralaterale Lendendramen DRG (L4/L5 DRG in unserer Studie) sorgfältig und legen Sie sie in 1 ml eiskalteca.++/Mg++-frei 1x HBSS in einem Dounce Gewebe homogenisierer. Jetzt sind die Gewebe bereit für Schritt 2. HINWEIS: Trimmen Sie den Spinalnerv, der nach Möglichkeit an das DRG angeschlossen ist.</li>
</ol>2. Isolieren Sie einzelne Zellen aus Mauslenden drG
<ol><li>Homogenisieren Sie das DRG-Gewebe mit einem lockeren Stößel im Dounce Homogenisator 20-25 mal.</li>
	<li>Legen Sie ein steriles 70'm Nylon-Zellsieb in ein steriles 50 ml konisches Rohr. Befeuchten Sie das Zellsieb mit 800 l eiskaltem 1x HBSS, und der Durchfluss wird im konischen Rohr gesammelt.</li>
	<li>Sammeln Sie die homogenisierte Gewebesuspension mit einer Pipette aus dem Homogenisator und passieren Sie das nasse 70-m-Nylon-Zellsieb in das 50 ml konische Rohr.</li>
	<li>Spülen Sie den Homogenisator zweimal mit 800 l eiskaltem 1x HBSS und dekantieren Sie dann mit Zellsieb in das gleiche 50 ml konische Rohr, um die Ausbeute zu erhöhen.</li>
	<li>1,5 ml gleichgefragwürdiges equilibiertes eiskaltes isotonischer Dichtegradientenmedium (in Schritt 1.1) in ein steriles 5-ml-Polystyrol-FACS-Rohr geben.</li>
	<li>Übertragen Sie das Zellhomogenat aus dem 50 ml konischen Rohr (in Schritt 2.4) in das FACS-Rohr, mischen Sie gut mit dem Dichtegradientenmedium durch Pipettieren nach oben und unten. Fügen Sie eine zusätzliche 500 L von 1x HBSS hinzu, um die Oberseite zu versiegeln.</li>
	<li>Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 800 x g für 20 min bei 4 °C.</li>
	<li>Den Überstand, der Myelin im Medium enthält, vorsichtig ansaugen, ohne das Zellpellet am Boden des FACS-Rohrs zu stören.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in PBS- oder FACS-Puffer, die 5% Fetales Rinderserum (FBS) für die FACS-Analyse enthalten, wieder aus. HINWEIS: Mindestens 50.000 bis 100.000 Zellen werden von L4 /L5 DRG einer Maus erwartet.<ol>
<li>Setzen Sie die mechanisch isolierten DRG-Zellen (L4/L5) in 100 l PBS mit 5% Fetalem Rinderserum wieder auf und inkubieren Sie dann mit dem CX3CR1-APC-Antikörper (1:2.000) im Dunkeln bei 4 °C für 1 h.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS einmal; Zentrifuge die Zellen 360 x g für 8 min bei 4 °C.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie dann das Zellpellet in 300 l PBS für die FCAS-Analyse wieder aus. Wenn die Zellensortierung geplant ist, setzen Sie stattdessen die Zellen im FACS-Puffer wieder auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+regulation+by+non-neuronal+cells+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation.</a> Science. 354 (6312), 572-577 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+types+of+macrophage+in+dorsal+root+ganglia+and+spinal+nerves+proximal+to+sciatic+and+spinal+nerve+transections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat.</a> Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).</li>
<li>Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+cargo+including+microRNA+regulates+sensory+neuron+to+macrophage+communication+after+nerve+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma.</a> Nature Communication. 8 (1), 1778(2017).</li>
<li>Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+differences+in+neuropathic+pain+modalities+revealed+by+correlating+behavior+with+global+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling.</a> Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).</li>
<li>Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglion+Infiltration+by+Macrophages+Contributes+to+Paclitaxel+Chemotherapy-Induced+Peripheral+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy.</a> The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).</li>
<li>Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+macrophages+reduces+axonal+degeneration+and+hyperalgesia+following+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury.</a> Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).</li>
<li>Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocytes+synergistically+promote+the+transition+from+acute+to+chronic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury.</a> Nature Communication. 7, 12029(2016).</li>
<li>Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cysteine+protease+cathepsin+S+in+neuropathic+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia.</a> Pain. 130 (3), 225-234 (2007).</li>
<li>Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK%2FNF-kappaB-dependent+satellite+glia+activation+induces+spinal+cord+microglia+activation+and+neuropathic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury.</a> Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).</li>
<li>Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+macrophages+in+generation+of+nerve+injury-induced+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia.</a> Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).</li>
<li>Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+the+peripheral+nervous+system+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury.</a> Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).</li>
<li>Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy6G-+myeloid+cells+mediate+mechanical+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Isolation+and+Primary+Culture+to+Study+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release.</a> Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).</li>
<li>Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+macrophage+ablation+in+transgenic+mice+expressing+a+Fas-based+suicide+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).</li>
<li>Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+peripheral+not+central+immune+responses+to+pain-inducing+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury.</a> Science Reports. 7 (1), 16460(2017).</li>
<li>Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine+protease+inhibitor+SerpinA3N+attenuates+neuropathic+pain+by+inhibiting+T+cell-derived+leukocyte+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase.</a> Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen im Zusammenhang mit diesem Manuskript.

Hier stellen wir eine neue Methode vor, um isolierte Makrophagen aus Maus-DRG effektiv anzureichern. Der konventionelle Ansatz, DRG-Immunzellen zu isolieren, erfordert eine enzymatische Verdauung15,18, die nun durch mechanische Homogenisierung in unserem Protokoll ersetzt wird, um unerwünschte Zellschäden zu begrenzen und die Ausbeute zu erhöhen. Daher ist das neue Protokoll weit weniger zeitaufwändig. Noch wichtiger ist, dass die Enzymverdauung die Makrophagen s...

Es gibt inzwischen erhebliche Hinweise darauf, dass Immunzellen zu den neuropathischen Schmerzen nach der peripheren Nervenverletzung1,2beitragen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich reifer Makrophagen, sind dafür bekannt, auf Gewebeverletzungen und systemische Infektionen durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Parallel zur nervenverletzungsinduzierten Mikroglia-Aktivierung im Spinaldorsalhorn dehnen sich Makrophagen in den Dorsalwurzelganglien (DRG) auch nach einer Nervenverletzung deutlich aus3,4. Insbesondere gibt es wachsendes Interesse zu bestimmen, ob Makrophagen zur neuropathisigen Schmerzentwicklung nach peripheren Nervenverletzungen beitragen, indem sie mit sensorischen Neuronen in der DRG5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11. Darüber hinaus implizieren neuere Studien auch den Beitrag von DRG-Makrophagen bei der axonalen Reparatur nach Nervenverletzungen12,13. Eine weitere Studie legt ferner nahe, dass Makrophagensubpopulationen (d. h. CD11b+Ly6Chi und CD11b+Ly6CLow/- Zellen) eine andere Rolle bei der mechanischen Überempfindlichkeit14spielen können. Daher kann eine schnelle Phänotypisierung der Reaktion von DRG-Makrophagen im Zusammenhang mit Einer Nervenschädigung uns helfen, Neuroimmunfaktoren zu identifizieren, die zu neuropathische Schmerzen beitragen.
Üblicherweise umfasst das Protokoll zur Isolierung von Makrophagen in der DRG mehrere Schritte, einschließlich der enzymatischen Verdauung15,16. Die Technik ist oft zeitaufwändig und kann für groß angelegte Experimente teuer werden. Obwohl eine milde Verdauung mit Kollagenase Typ II (4 mg/ml) und Dispase Typ II (4,7 mg/ml) für 20 min zuvor15empfohlen wurde, ist es denkbar, dass Zellen nach der Exposition gegenüber diesem Enzym anfällig für Zellschäden oder Zelltod sind, was zu aufgeben. Darüber hinaus kann der Unterschied in der Qualität der Enzyme von Charge zu Charge die Effizienz dieses Prozesses weiter beeinflussen. Noch wichtiger ist, dass Makrophagen, die der Enzymverdauung ausgesetzt sind, unerwünscht stimuliert werden und sich somit sehr vom In-vivo-Status unterscheiden können. Die Änderungen können das Ergebnis der funktionellen Studie möglicherweise erschweren.
Hier beschreiben wir ein enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung von DRG-Makrophagen bei 4 °C mittels mechanischer Dissoziation. Die Proben werden auf Eis gehalten, um zellulären Stress zu begrenzen. Infolgedessen bietet unser Ansatz einen Vorteil, um die Konsistenz der Isolierung aufrechtzuerhalten, und die isolierten Zellen sind vermutlich gesünder und weniger stimuliert. Wir stellen außerdem den Nachweis vor, die Qualität der isolierten Zellen mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zu validieren.

<table><tbody><tr><td>AP20187</td><td>Clontech</td><td>635058</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-Maus CX3CR1-APC Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>149007</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb (70 mm Nylon)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Gewebehomogenisator</td><td>Wheaton</td><td>357538 ( 1ml)</td><td></td></tr><tr><td>FACS Röhrchen (5ml)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x, Ca++/Mg++-frei)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Federschere</td><td>FST</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma</td><td>Nr. 4864-10ml</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle isolierung von dorsalwurzel ganglion makrophagen

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Es gibt wachsendes Interesse, die molekularen und zellulären Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und sensorischen Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien nach peripheren Nervenverletzungen zu untersuchen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich Makrophagen, sind dafür bekannt, auf eine Gewebeverletzung durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Neue Beweise haben den Beitrag von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen zur neuropathische Schmerzentwicklung und axonale Reparatur im Zusammenhang mit Nervenverletzungen impliziert. Schnell phänotypisieren (oder "schnelle Isolierung von") die Reaktion von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen im Zusammenhang mit Nervenverletzungen ist gewünscht, um die unbekannten Neuroimmunfaktoren zu identifizieren. Hier zeigen wir, wie unser Labor Makrophagen aus den dorsalen Wurzelganglien mithilfe eines enzymfreien mechanischen Dissoziationsprotokolls schnell und effektiv isoliert. Die Proben werden durchweg auf Eis gehalten, um den zellulären Stress zu begrenzen. Dieses Protokoll ist im Vergleich zum standardenzymatischen Protokoll weit weniger zeitaufwändig und wurde routinemäßig für unsere fluorescence-aktivierte Zellsortierungsanalyse verwendet.

Um die isolierten Zellen zu validieren, wählten wir zuerst die Macrophage Fas-Induced Apoptosis (MAFIA) transgene Mäuse17. Diese Linie drückt ein medikamentös induzierbares FK506-bindendes Protein (FKBP)-Fas Selbstmordfusionsgen und grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) unter der Kontrolle des Promotors des CSF1-Rezeptors (CSF1R) aus, der sich sowohl in Makrophagen als auch in Mikroglia spezifisch äußert. Die systemische Injektion des FK-bindenden Proteindimeris, AP20187 (AP), induziert die Apopt...

Hier stellen wir ein mechanisches Dissoziationsprotokoll vor, um Makrophagen aus dem dorsalen Wurzelganglien für Phänotypisierung und funktionelle Analyse schnell zu isolieren.

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Neue Erkenntnisse haben den Beitrag von dorsalen Wurzelganglienmakrophagen zur neuropathische Schmerzentwicklung und axonalen Reparatur im Zusammenhang mit Nervenverletzungen involviert. Schnell phänotypisieren die Reaktion von dorsalen Wurzel Ganglion Makrophagen ist gewünscht, um die unbekannten Neuroimmunfaktoren zu identifizieren. Hier zeigen wir, wie unser Labor Makrophagen aus den dorsalen Wurzelganglien mithilfe eines enzymfreien mechanischen Dissoziationsprotokolls schnell und effektiv isoliert.Dieses Protokoll ist im Vergleich zu standardenzymatischen Protokollen weit weniger zeitaufwändig und hat es routinemäßig für unsere fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse verwendet. Vor Beginn des Experiments bereiten Sie die Arbeitslösung des Dichtegradientenmediums vor, indem Sie neun Volumen des Mediums mit einem Volumen calcium- und magnesiumfreier 10X HBSS mischen und auf Eis halten. Bestätigen Sie, dass die Maus vollständig durch die fehlende Reaktion auf die Hinterpfoten-Pinch besäugnett wird.Beginnen Sie, indem Sie eine anästhesierte Maus in eine chemische Dunstabzugshaube in der Rückenposition mit vier Pfoten mit Klebeband gesichert. Verwenden Sie Zangen, um die Haut

rapid-isolation-of-dorsal-root-ganglion-macrophages

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video demonstriert ein enzymfreies Protokoll zur Isolierung von Makrophagen aus dem Spinalganglion (DRG) der Maus unter Verwendung einer mechanischen Dissoziationstechnik. Nach der Homogenisierung des frisch entnommenen DRG-Gewebes werden Antikörper gegen die Zelloberflächenrezeptoren auf den Makrophagen verwendet, um die Zellen fluoreszierend zu markieren, gefolgt von einer Durchflusszytometrie, um das Vorhandensein von Makrophagen in der Probe zu bestätigen.

Isolierung von Makrophagen aus dem Spinalganglion der Maus mittels mechanischer Dissoziation

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Entnahme von Neuronen aus den dorsalen Wurzelganglien (DRG). DRG aus der Wirbelsäule einer Ratte wird isoliert, mit Enzymen behandelt und dann mechanisch dissoziiert, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Die Neuronen werden mittels Dichtegradientenzentrifugation von Gliazellen getrennt und in einem Wachstumsmedium kultiviert.

Eine Technik zur Gewinnung und Dissoziation von Spinalganglien für neuronale Kulturen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Anreicherung von neuronalen Kulturen aus Spinalganglien durch Immunpanning, wodurch ihre Reinheit und ihr Nutzen für die neurologische Forschung verbessert werden.

Neuronale Anreicherung der Spinalganglien durch Immunpanning

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von Zellen der dorsalen Wurzelganglien (DRG) aus der Wirbelsäule der Ratte. DRGs, die aus der Wirbelsäule herausgeschnitten werden, werden mit Enzymen behandelt und mechanisch dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellen werden in einem Medium kultiviert, das Inhibitoren und Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation von Gliazellen begrenzen bzw. das neuronale Wachstum fördern.

Etablierung einer primären Zellkultur der Spinalganglien der Dorsalwurzel aus einer Wirbelsäule der Ratte

Spinalganglien (DRG) sind Strukturen, die die sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems. Wenn distanziert, sie co-kultiviert mit SC-wie Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) sein kann, eine wertvolle Modell zur in-vitro-Nervenregeneration und Myelinisierung zu untersuchen, imitiert die in vivo-Umgebung an der Verletzungsstelle.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die hydraulische Extrusion des Rückenmarks sowie die Identifizierung und Isolierung spezifischer Spinsalwurzelganglien (DRGs) im selben Nagetier. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Isolierung des Rückenmarks ist diese Methode deutlich schneller und reduziert das Risiko von Gewebeschäden.

Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere

Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Dorsal Root Ganglien (DRG) Primärkulturen werden häufig verwendet, um physiologische Funktionen oder Pathologie-Veranstaltungen in sensorischen Neuronen zu studieren. Hier zeigen wir den Einsatz von lumbalen DRG-Kulturen, die Freisetzung von Neurotransmittern zu erkennen, nachdem Neuropeptid FF-Rezeptor Typ 2 Stimulation mit ein selektiver Agonist.

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Mikroglia gelten als einige der vielseitigsten Zellen des Körpers, die zur morphologischen und funktionellen Anpassung fähig sind. Ihre Heterogenität und Multifunktionalität ermöglicht die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und ist gleichzeitig mit verschiedenen neurologischen Pathologien verbunden. Hier wird eine Technik zur Reinigung von Rückenmarksmikroglia beschrieben.

Schnelle und effiziente Anreicherung von Mikroglia des Rückenmarks der Maus

Dorsale Wurzelganglien (DRG) enthalten primäre sensorische Neuronenzellen und leiten periphere sensorische Signale an das Rückenmark weiter. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur DRG-Dissektion der Maus, die eine standardisierte Isolierung strukturell intakter Ganglien, anatomische segmentale Identifikation, intuitive Anleitung für Anfänger und reduzierte prozedurale Gewebeschäden unterstützt.

Dissektion und Isolierung der Maus-Dorsalwurzelganglien

Erfahren Sie die mechanische Dissoziation zur schnellen Isolierung von Makrophagen aus Dorsalwurzelganglien von Mäusen. Diese enzymfreie Methode ermöglicht effiziente Phänotypisierung für neuroimmunologische Studien.

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

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