Name: Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Connexin 43 in Endothelzellen mechanisch disruptieren und Zugkräfte sowie interzelluläre Spannungen messen. Diese Methode ermöglicht biomechanische Analysen für Wundheilung und Krebsmetastasen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von den Start-up-Fonds der University of Central Florida und dem National Heart, Lung, And Blood Institute des National Institute of Health unter der Auszeichnung K25HL132098 unterstützt.

1. Herstellung von Polyacrylamid (PA) Gelen
<ol><li>
Zubereitung der Petrischale
	<ol>
<li>Bereiten Sie die Silanlösung bereit, indem Sie 200 ml Reinstwasser mit 80 l Essigsäure und 50 l 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat mischen. Bind Silan ist eine Lösung zur Funktionalisierung der Glasboden Petrischale Oberfläche für Hydrogel-Befestigung.</li>
		<li>Die Bindesilanlösung mindestens 1 h auf einer Rührplatte rühren.</li>
		<li>Behandeln Sie die Mitte gut der Petrischale mit Bindung Silanlösung für 45 min.</li>
		<li>Entfernen Sie die Silanlösung binden und spülen Sie die Petrischale mit ultrareinem Wasser 2x-3x ab.</li>
		<li>Trocknen Sie die Petrischale Oberfläche und lagern Sie bei Raumtemperatur für die zukünftige Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aufbereitung einer Hydrogellösung
	<ol>
<li>Mischen Sie ultrareines Wasser, 40% Acrylamid und 2% Bisacrylamid in einem 15 ml Zentrifugenrohr gemäß Tabelle 1.</li>
		<li>Fügen Sie der Hydrogellösung 80 L fluoreszierende Perlen hinzu.</li>
		<li>Schütteln Sie das Rohr vorsichtig, um Perlen mit der Gellösung zu mischen.</li>
		<li>Ziehen Sie die Rohrkappe am Zentrifugenrohr leicht fest und legen Sie sie in eine Vakuumkammer.</li>
		<li>Entgasen Sie die Gellösung für mindestens 45 min in der Vakuumkammer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hydrogelpolymerisation
	<ol>
<li>Zuerst 75 l 10% Ammoniumpersulfat (in reinem Reinstwasser gelöst) und dann 8 l TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethan-1,2-diamine) in die Hydrogellösung geben.</li>
		<li>Platzieren Sie 24 L Hydrogellösung in der Mitte der Petrischale (siehe Tabelle 2).</li>
		<li>Verwenden Sie einen 18 mm Deckelschlupf, um das Hydrogel abzuflachen. Dadurch wird eine Höhe von 100 m erreicht.</li>
		<li>Warten Sie mindestens 30-40 min auf die Gelpolymerisation.</li>
		<li>Tauchen Sie das polymerisierte Hydrogel in reines Reinstwasser ein, um eine Gelaustrocknung zu verhindern.</li>
		<li>Bedecken Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie, um das Photobleichen von fluoreszierenden Perlen zu verhindern und bei 4 °C aufzubewahren. HINWEIS: Hydrogele können einen Zeitraum von bis zu 3 Monaten gelagert werden, aber es wird vorgeschlagen, dass diese Gele nicht länger als 1 Woche nach der Herstellung verwendet werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Zellkultur
<ol><li>Kultur menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) im Zellkulturmedium 200 (siehe Materialtabelle) ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin auf 0,1% gelatinebeschichteten Kolben bei 37 °C und 5%CO2.</li>
</ol>3. Mikromuster Schablonenvorbereitung
<ol><li>Eine dünne Schicht Aus polydimethylsiloxan (PDMS) in einer 100 mm Petrischale aushärten, indem sie die Silikonbasis mit dem Silikonhärtungsmittel im Verhältnis 20:1 (Basis: Härtungsmittel) mischen. HINWEIS: Es ist möglich, andere Basis-zu-Härtungsmittel-Verhältnisse zu verwenden (z. B. 10:1 oder 30:1). Ein niedrigeres Verhältnis zwischen Basis zu Härtungsmittel ergibt jedoch ein steiferes Muster, während ein höheres Verhältnis zwischen Basis- und Härtungsmittel zu einem weicheren Muster führt.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 20:1 (Base:curing Agent) PDMS-Lösung vor und mischen Sie sie sorgfältig in einem 50 ml Zentrifugenrohr. Invertieren Sie das Rohr auf den Kopf und schütteln Sie kräftig mehrmals, um eine ordnungsgemäße Durchmischung der PDMS-Lösung zu gewährleisten, da eine ungleichmäßige Vermischung zu einer unvollständigen Polymerisation führt.</li>
	<li>Entfernen Sie Blasen, die aus dem obigen Schritt durch Zentrifugieren der PDMS-Lösung für 1 min bei 190 x geingeführt wurden.</li>
	<li>5-6 ml PDMS-Lösung in die Mitte einer 100 mm Petrischale gießen und die Schale aufregen, bis die PDMS-Lösung die gesamte Petrischalenoberfläche abdeckt.</li>
	<li>Härten Sie die PDMS-Lösung über Nacht bei 50-60 °C. PDMS kann auch bei Raumtemperatur ausgehärtet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie eine kreisförmige PDMS-Schablone mit 16 mm Durchmesser mit einem Lochstanzer.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Biopsiespunsch, um kleine Löcher in der PDMS-Schablone zu erstellen. Dieses Protokoll verwendet einen Biopsie-Punch mit einem Durchmesser von 1,25 mm.</li>
	<li>Sterilisieren Sie PDMS-Schablonen, indem Sie sie zunächst in 70% Ethanol für 2-3 min tauchen, überschüssiges Ethanol absanieren und dann 5 min unter UV-Licht stellen.</li>
</ol>4. Kollagen-I Hydrogelbeschichtung
<ol><li>Entfernen Sie den Deckelrutsch vom Hydrogel und saugen Sie überschüssige Flüssigkeit an.</li>
	<li>Legen Sie die PDMS-Schablone auf die Hydrogeloberfläche. HINWEIS: Pinzette kann verwendet werden, um leichten Druck auf PDMS Schablone anzuwenden, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen der PDMS-Schablone und der Hydrogeloberfläche zu gewährleisten. Unsere PDMS-Schablonen sind wasserdicht und verhindern so den Wasserzugang zwischen der Gel-Oberfläche und der PDMS-Schablonenbodenoberfläche. Auch die Hydrogelsteifigkeit muss in Bezug auf die PDMS-Steifigkeit nicht angepasst werden.</li>
	<li>Die Hydrogeloberfläche mit Sulfosuccinimidyl-6-(4-Azido-2-nitrophenylamino)-Hexanoat (Sulfo-SANPAH) in einer 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinesulfonsäure) gelösten Pufferlösung in einer Konzentration von 1 : 1000 Lampe (Leistung 36 W) für 8 min.</li>
	<li>Die überschüssige Sulfo-SANPAH- und HEPES-Lösung ansaugen und das Hydrogel zweimal mit 0,1 M HEPES abspülen, gefolgt von zwei zusätzlichen Spülungen mit reinem Reinen.</li>
	<li>Überschüssiges reines Wasser ansaugen und Hydrogele mit 0,1 mg/ml Kollagen-I über Nacht bei 4 °C beschichten.</li>
	<li>Bedecken Sie die Gerichte und schützen Sie fluoreszierende Perlen vor Photobleichmittel. HINWEIS: PDMS-Schablonen werden verwendet, um mikrogemusterte Monolayer zu erstellen. Mikrogemusterte Monolayer werden verwendet, da sie es ermöglichen, mehrere Monolayer derselben Geometrie und Abmessungen gleichzeitig während jedes Experiments zu beobachten. Sollten jedoch Mikromuster nicht gewünscht werden, können die oben genannten Schritte mit Ausnahme von Schritt 4.2 befolgt werden.</li>
</ol>5. Erstellen von HUVEC-Monolayern auf Hydrogelen
<ol><li>Verwenden Sie 1x Trypsin, um Zellen von Gewebekulturkolben für 3-5 min im Inkubator zu lösen.</li>
	<li>Fügen Sie der Trypsin-Lösung nach der Trypsinisierung Zellkulturmedien hinzu und fügen Sie das 15 ml Zentrifugenrohr hinzu.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zelllösung für 3 min bei 1710 x g. Ein kleines, weißes Zellpellet sollte an der Unterseite des Zentrifugenrohrs sichtbar sein.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in Medien auf eine Konzentration von 50 x 104 Zellen/ml aus.</li>
	<li>Entfernen Sie Kollagen-I vom Hydrogel und spülen Sie 1x mit PBS ab.</li>
	<li>Fügen Sie 75 x 103 Zellen an die Oberseite der PDMS-Schablone und lassen Sie Zellen an der Hydrogeloberfläche für mindestens 1 h im Inkubator bei 37 °C und 5%CO2anhaften.</li>
	<li>Entfernen Sie die PDMS-Schablone, und fügen Sie der Petrischale mindestens 2 ML Medien hinzu. Tauchen Sie die PDMS-Schablone in 10x Trypsin ein, um alle angeschlossenen Zellen zu entfernen und durch Sprühen mit 70% Ethanol zu sterilisieren und dann 5 min unter das UV-Licht zu stellen.</li>
	<li>Legen Sie die Petrischale in den Inkubator und warten Sie mindestens 36 h oder bis eine konfluente Monoschicht beobachtet wird.</li>
</ol>6. 2,5 Dihydroxychalcon-Behandlung bei Cx43-Störung
<ol><li>2,5 Dihydroxychalcon (Chalcon) in Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen, um eine 0,1875 mg/ml-Stammlösung herzustellen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Stammlösung mit Zellkulturmedien, um eine niedrige Chalconkonzentration (0,2 g/ml) aliquot und eine hohe Chalconkonzentration (2 g/ml) aliquot zu bilden.</li>
</ol>7. Datenerfassung
<ol><li>Suchen Sie Zellinseln mit einem Mikroskop.</li>
	<li>Erfassen Sie Phasenkontrast- und Perlenbilder zur Bildzellmorphologie bzw. Hydrogelverschiebungen. HINWEIS: Dieses Protokoll verwendete ein 10-faches Ziel für die Datenerfassung.</li>
	<li>Am Ende des Experiments lösen Sie Zellen mit 10x Trypsin und erfassen Sie ein Bild der Geloberfläche ohne Zellen (Referenzbild).</li>
</ol>8. Immunostaining
<ol><li>Monolayer mit 4% Formaldehyd fixieren und 15 min bei 37 °C brüten.</li>
	<li>Entfernen Sie 4% Formaldehyd und fügen Sie 0,2% Triton X-100 für 5 min bei 37 °C, um Zellen zu permeabilisieren.</li>
	<li>Entfernen Sie 0.2% Triton X-100 und spülen Monolayer mit PBS 2x-3x.</li>
	<li>Cover Monolayer mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) Lösung für 45 min bei 37 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie die 2% BSA-Lösung und spülen Sie Monolayer mit PBS 2x-3x.</li>
	<li>Primären Cx43-Antikörper in einer Konzentration von 1:400 in die Probe geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie primärer Antikörper und spülen Sie die Probe mit PBS 2x-3x.</li>
	<li>Sekundärantikörper in einer Konzentration von 3:200 hinzufügen und 2 h bei 37 °C brüten. HINWEIS: Proben sollten abgedeckt werden, um Photobleichungen zu verhindern.</li>
	<li>Sekundären Antikörper entfernen und mit PBS 2x-3x ausspülen.</li>
	<li>Abdeckmuster mit Montagemedium (Fluromount-G DAPI) und Dichtung mit 18 mm Abdeckschlupf.</li>
</ol>9. Implementierung der Traktionskraftmikroskopie (TFM) und der Monolayer-Stressmikroskopie (MSM)
<ol><li>
Hydrogel-Deformationsberechnung HINWEIS: Im Folgenden wird eine Schritt-für-Schritt-Verschiebungsberechnungsprozedur mit MATLAB beschrieben.<ol>
<li>Öffnen Sie die Hauptdatei traction.m in MATLAB (für alle MATLAB-Routinen siehe Ergänzende Materialien). HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen im Code, um das MATLAB-Verzeichnis festzulegen.</li>
		<li>Definieren Sie die folgenden Variablen: Bildformat, Pixel-zu-Mikron-Konvertierung, Young-Modul, Poissons Verhältnis und Mikroskopobjektiv.</li>
		<li>Suchen Sie die Perle, das Trypsin-Bild und das Phasenbild mit der OpenFiles-Unterroutine. HINWEIS: Bei großen Datensätzen ist es am besten, Dateien in sequenzieller Reihenfolge zu benennen. Beispielsweise sollten Dateien den Namen "filename1.tif", "filename2.tif" usw. haben.</li>
		<li>Definieren Sie einen quadratischen ROI (Interessenbereich) um die Zellmonolayer, und führen Sie die Cell_cropper-Unterroutine aus, um das Originalbild zuzuschneiden.</li>
		<li>Führen Sie die Unterroutine displacement_finder aus, um Verschiebungen zu berechnen.</li>
		<li>Führen Sie die Dedrift-Unterroutine aus, um zusätzliche nichtzelluläre Verschiebungen zu entfernen, die auf die Drift des Mikroskopstadiums zurückzuführen sein können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Berechnung der Traktionen HINWEIS: Hier werden uneingeschränkte Traktionen mit unserer kundenspezifischen MATLAB-Routine berechnet. Schritt für Schritt wird die Traktionsberechnung mit der oben erwähnten MATLAB-Routine unten angegeben.<ol>
<li>Definieren Sie die folgenden Variablen innerhalb der traction.m-Routine: Randbedingung, Geldicke, Gelhöhe und Dedrift.</li>
		<li>Führen Sie die Unterroutine traction_finder aus, um Traktionen zu berechnen, und führen Sie die Unterroutine plot_traction aus, um Traktionen zu zeichnen. Alle Traktionen in x-Richtung (Tx) und y-Richtung (Ty) zusammen mit den entsprechenden Pixelpositionen finden Sie in einer traction.dat-Datei, die vom Code generiert wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Berechnung interzellulärer Spannungen HINWEIS: Schritt für Schritt Anweisungen für die interzelluläre Spannungsberechnung mit der matLAB-Routine, die bereits erwähnt wurde, sind unten aufgeführt.<ol>
<li>Führen Sie die Unterroutine mark_circular_domain aus, um die Einlayer-Grenze anzugeben. Diese Routine fordert alle zugeschnittenen Phasenbilder sequenziell auf, damit der Benutzer manuell eine Grenze um die Monolayer zeichnen kann. Notieren Sie sich die im Befehlsfenster generierten nXPts und verwenden Sie sie später als Rasterparameter in der X-Achse und der Y-Achse für die FEM-Analyse (siehe Schritt 9.3.2).</li>
		<li>Führen Sie Run_StressCode aus, um interzelluläre Spannungen zu berechnen. Diese Unterroutine liest direkt Parameter aus der Datei "model.in" und führt "island.exe" aus, um eine FEM-Analyse durchzuführen. Stellen Sie vor dem Ausführen dieser Routine sicher, dass alle Parameter in der model.in Datei, d. h. Rasterparameter in X und Y, Pixel-zu-Mikron-Konvertierung, Youngs Gelmodul, Poissons Verhältnis, Monolayer-Höhe und Monolayer-Muster (Streifen oder Loch), bearbeitet werden. richtig.</li>
		<li>Zeichnen Sie alle FEM-Ergebnisse mit der Unterroutine plot_FEM_results. HINWEIS: Alle generierten Ergebnisse werden automatisch im Ordner Ergebnisse im Verzeichnis MATLAB gespeichert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li>
<li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates%3A+A+guide+to+recent+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+%28STFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li>
<li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Journal+of+Science+%26+Technical+Research%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).</li>
<li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear%2C+intercellular+stress%2C+and+endothelial+cell+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+forces+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+forces%3A+a+useful+parameter+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li>
<li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706(2018).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+stress+microscopy%3A+limitations%2C+artifacts%2C+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172(2013).</li>
<li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li>
<li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li>
<li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li>
<li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li>
<li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327(2019).</li>
<li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li>
<li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li>
<li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+phosphorylation+in+brain%2C+cardiac%2C+endothelial+and+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li>
<li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li>
<li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li>
<li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C5%27-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li>
<li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li>
<li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+cytotoxicity+of+2%2C5-dihydroxychalcones+and+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Unsere Gruppe, wie auch andere, hat erfolgreich TFM und MSM verwendet, um den Einfluss von Zell-Zell-Verbindungen in verschiedenen pathologischen und physiologischen zellulären Prozessen in vitro7,15,18,27 zu untersuchen . Zum Beispiel präsentierten Hardin et al. eine sehr aufschlussreiche Studie, die interzelluläre Spannungsübertragung schlägt parazelluläre Spaltbildung in Endothelzellen<sup c...

Das Feld, das sich auf die Untersuchung der Auswirkungen physikalischer Kräfte und mechanischer Eigenschaften auf die Zell- und Gewebephysiologie und Pathologie bezieht, ist als Mechanobiologie1bekannt. Ein paar nützliche Techniken, die in der Mechanobiologie verwendet wurden, sind Monolayer-Stressmikroskopie und Traktionskraftmikroskopie. Die Traktionskraftmikroskopie ermöglicht die Berechnung von Traktionen, die an der Zell-Substrat-Schnittstelle erzeugt werden, während die monoschichtige Spannungsmikroskopie die Berechnung interzellulärer Spannungen ermöglicht, die zwischen benachbarten Zellen innerhalb einer Monoschicht erzeugt werden2 ,3,4,5,6. Die Ergebnisse früherer Methoden deuten darauf hin, dass zellabgeleitete mechanische Spannungen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Schicksals einer Vielzahl zellulärer Prozessespielen 3,4,5. Wenn z. B. eine externe mechanische Kraft ausgesetzt wird, kann eine Gruppe von Zellen, die als Kollektiv migrieren, ihre Morphologie verändern und ihre Form polarisieren, um die Richtung der angewendeten Kraft auszurichten und zu migrieren, indem sie teilweise Traktionen erzeugen7, 8. Traktionen bieten eine Metrik, die zur Bewertung der Zellkontraktilität verwendet werden kann und mittels Traktionskraftmikroskopie (TFM) berechnet wird. Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) beginnt mit der Bestimmung zellinduzierter Substratverformungen, gefolgt von der Berechnung des Traktionsfeldes unter Verwendung eines mathematisch strengen, mechanikbasierten Berechnungsansatzes. Da die Fähigkeit, Traktionen zu berechnen, schon seit geraumer Zeit besteht, haben Forscher TFM genutzt, um die Auswirkungen von Traktionen auf eine Vielzahl von Prozessen zu offenbaren, einschließlich Krebs9,Wundheilung10 und Bewertung von technischen Herz Gewebe11.
Die Implementierung von TFM und MSM kann in drei wesentliche Schritte unterteilt werden, die in der folgenden Reihenfolge ausgeführt werden müssen: Erstens werden die von den Zellen erzeugten Hydrogelverformungen bestimmt; zweitens werden Traktionen aus Hydrogelverformungen zurückgewonnen; und drittens wird ein Finite-Elemente-Ansatz verwendet, um normale und scherende interzelluläre Spannungen innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. Um Gelverschiebungen zu berechnen, wurden Fluoreszenzperlenbilder mit Zellen mit dem Referenzperlenbild (ohne Zellen) verglichen, indem eine benutzerdefinierte Partikelbild-Velocimetrie (PIV)-Routine verwendet wurde. Die Kreuzkorrelationsfenstergröße und -überlappung für die PIV-Analyse wurden für 32 x 32 Pixel bzw. 0,5 ausgewählt. Zu diesem Zeitpunkt wurden Pixelverschiebungen in Mikrometer umgewandelt, indem sie mit einem Pixel-zu-Mikron-Umrechnungsfaktor multipliziert wurden (für unser Mikroskop beträgt dieser Umrechnungsfaktor 0,65), um Verschiebungen in der Ebene zu erhalten. Fehler, die mit dem Ignorieren von Verschiebungen a-ebener Weise verbunden sind, sind vernachlässigbar12,13. Nach der Berechnung von Gelverschiebungen gibt es zwei Arten von Traktionsmessungen, die verwendet werden können, eingeschränkte Traktionen und uneingeschränkte Traktionen8,14. Unbeschränkte Traktionen stellen das Traktionsfeld für das gesamte Sichtfeld (einschließlich Regionen mit und ohne Zellen) bereit, während eingeschränkte Traktionen das Traktionsfeld nur für Regionen bereitstellen, die Zellen14enthalten. Anschließend werden interzelluläre Spannungen mittels Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) berechnet, was eine Erweiterung der Traktionskraftmikroskopie darstellt. Die Implementierung von MSM basiert auf der Annahme, dass lokale Traktionen, die von einer Monoschicht von Zellen an der Zell-Substrat-Schnittstelle ausgeübt werden, durch mechanische Kräfte ausgeglichen werden müssen, die zwischen den Zellen an der Zell-Zell-Schnittstelle übertragen werden, wie es in Newtons Gesetzen gefordert wird7 ,12,13. Eine wichtige Annahme ist dabei, dass die Zellmonoschicht als dünnes elastisches Blatt behandelt werden kann, da die Traktionsverteilung in der Monoschicht bekannt ist und die Kraftbalance nicht von den Zellmaterialeigenschaften abhängt. Eine weitere wichtige Annahme ist, dass die Zugkräfte durch lokale interzelluläre Spannungen innerhalb des optischen Sichtfeldes (innerhalb der Monoschicht) ausgeglichen werden und der Einfluss dieses Kraftgleichgewichts im distalen Bereich (außerhalb der Monolayer) minimal ist13. Daher sind die Randbedingungen, die durch interzelluläre Spannungen, Verschiebungen oder eine Kombination aus beidem an der Einschichtgrenze definiert sind, entscheidend für die Ausführung von MSM13. Unter Berücksichtigung der oben genannten Informationen verwenden wir MSM, um eine Finite-Elemente-Analyse (FEM) durchzuführen, um die maximale Hauptspannung(max.) und die minimale Hauptspannung(min) durch Drehen der Spannungsebene an jedem Punkt innerhalb des Monolayer. Diese Hauptspannungen werden anschließend verwendet, um die durchschnittliche durchschnittliche normale interzelluläre Spannung von 2D [(max +min) /2] und die maximale 2D-Scherspannung[(max -min) /2] innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. 12,13. Dieses Verfahren wird von Tambe et al.12,13 näher beschrieben.
Die Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) ermöglicht die Berechnung von zellzellulären Spannungen, die in einer Monoschicht6,7,8,12,13erzeugt werden. Diese interzellulären Spannungen wurden vorgeschlagen, wichtig für Gewebewachstum und -reparatur, Wundheilung und Krebsmetastasen12,15,16,17zu sein. Darüber hinaus wurden interzelluläre Spannungen vorgeschlagen, auch bei der Endothelzellmigration und endotheliale Barrierefunktion17,18wichtig zu sein. Während Zell-Zell-Kreuzungen wie enge Kreuzungen und Adhäsivverbindungen beide als eine entscheidende Rolle bei der erzeugung und Transmission von endothelialen interzellulären Spannungen vorgeschlagen wurden, bleibt die Rolle von Spaltknoten schwer fassbar. Lückenknoten verbinden benachbarte Zellen physisch und bieten einen Weg für elektrischen Strom und Moleküle (<1 KDa), um zwischen benachbarten Zellen19,20,21zu passieren. Obwohl Endothelzellen Cx37, Cx40 und Cx43 Spaltknoten19,22ausdrücken, ist Cx43 wohl die wichtigste in Bezug auf die Krankheitsprogression23. Ein Beweis für die Bedeutung von Cx43 kann in der Tatsache gefunden werden, dass die genetische Deletion von Cx43 bei Mäusen zu Hypotonie24 führt und nachteilige Auswirkungen auf die Angiogenese25hat. Darüber hinaus wurde cx43 als wichtig für die Zellmigration und Proliferation und im Fortschreiten der Arteriosklerose18,22,23,24,25 .
In diesem Protokoll untersuchten wir mit TFM und MSM, ob Traktion und interzelluläre Spannungserzeugung innerhalb der konfluenten, endotheliaalen Monolayer durch die Störung der endotheliale Spaltkreuzung Cx43 beeinträchtigt würden. Wir störten Cx43 mit 2,5-Dihydroxychalcon (Chalcon), einem Molekül, das dokumentiert ist, um die Cx43-Expression26zu hemmen. Chalcone wurde verwendet, um Cx43 anstelle von siRNA zu stören, da Chalcone zuvor von Lee et al. berichtet wurde, um cx43 Expression26zu stören. Darüber hinaus waren wir besonders an chalcones Einfluss auf das Endothel interessiert, da es auch als entzündungshemmende und thromboplättliche Verbindung berichtet wurde, die potenziell zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Pathologien26. Chalcone-Behandlungen wurden eine Stunde nach Beginn des Experiments durchgeführt, mit Chalcone behandelte Monolayer wurden insgesamt sechs Stunden lang abgebildet, und die Bildverarbeitung wurde mit einem kundenspezifischen MATLAB-Code durchgeführt, um Traktionen und anschließend interzelluläre Betont. Unsere Ergebnisse zeigten eine allgemeine Abnahme der Traktionen und interzellulären Spannungen, was darauf hindeutet, dass Cx43 eine Schlüsselrolle in der endothelialen Biomechanik spielt.

<table><tbody><tr><td>18 mm Deckglas</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>Unverzichtbar zum Glätten von Polyacrylamid-Gelen</td></tr><tr><td>2% Bis-Acrylamid</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>Bestandteil des Polyacrylamid-Gels</td></tr><tr><td>2&prime;,5&prime;-Dihydroxychalcon</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Zum Aufbrechen der Cx43-Struktur</td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>Stammlösung zur Herstellung eines Bindungssilangemisches mit Essigsäure und Reinstwasser</td></tr><tr><td>40% Acrylamid</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>Bestandteil des Polyacrylamidgels</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>64-19-7</td><td>Unerlässlich für die Herstellung von Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Alexa Fluro 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG;</td><td>ThermoFisher</td><td>Katalog # A-11001</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>Polyacrylamid-Gelpolymerisationsmittel</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td>Zur Herstellung von Blockierungslösung</td></tr><tr><td>Rinder Typ I Atelo-Kollagen-Lösung, 3 mg/ml, 100 mL</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005-100ML</td><td>Verwendung als extrazelluläre Matrix</td></tr><tr><td>Corning Zellkultur Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x)</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>Puffersalzlösung für die Zellkultur</td></tr><tr><td>benötigt Dimethylsulfoxid, Fisher BioReagents</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>Zum Auflösen von Chalkon und zur Herstellung einer Stammlösung</td></tr><tr><td>Fluoromount-G mit DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52</td><td>Eindeckmedium für die Immunstaierung zur Färbung von DAPI</td></tr><tr><td>Fluoroszierende Mikrosphäre Carboxylat-modifizierte Kügelchen</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>0,5 Mikron Carboxylat-modifizierte Kügelchen (rot), 2 % Feststoffe</td></tr><tr><td>HEPES-Pufferlösung 1 M</td><td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td>Essentiell für</td></tr><tr><td>LVES</td><td>ThermoFisher A1460801</td><td></td><td>Essential HUEVC media 200 Supplement</td></tr><tr><td>Medium 200</td><td>ThermoFisher</td><td>M200500</td><td>Essentielle Medien für die HUVEC-Zellkultur</td></tr><tr><td>Monoklonaler Maus-Cx43-Antikörper (CX - 1B1)</td><td>ThermoFisher</td><td>Katalog #13-8300</td><td>Primärer Antikörper für Cx43</td></tr><tr><td>Petrischale (35 mm Durchmesser)</td><td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H</td><td>35 mm Petrischale mit einer 20 mm Mittelvertiefung</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH-Vernetzer 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>Unverzichtbar für die Funktionalisierung der Polyacrylamid-Geloberfläche</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silikonelastomer Kit</td><td>DOW Corning</td><td>2646340</td><td>Silikonelastomer mit Härter zur Herstellung von PDMS</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BIO-RAD</td> 1610801 <td></td><td>Polymerisationsmittel Polyacrylamid-Gel</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>Zur Permeabilisierung von Zellen</td></tr><tr><td>Trypsin -EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td>Zur Zellablösung</td></tr></tbody></table>

störende endothelial biomechanik über connexin 43 strukturelle störung

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Endothelzellen wurden etabliert, um interzelluläre Spannungen und Traktionen zu erzeugen, aber die Rolle, die Lückenknoten bei endothelialen interzellulären Spannungen und Traktionsgenerierung spielen, ist derzeit nicht bekannt. Daher stellen wir hier ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Einfluss des Spaltknotens Connexin 43 (Cx43) auf die endotheliale Biomechanik zu untersuchen, indem konfluente endotheliale Monolayer einem bekannten Cx43-Inhibitor 2,5-Dihydroxychalcon (Chalcon) und Messung der Auswirkungen dieses Inhibitors auf Traktionen und interzelluläre Spannungen. Wir präsentieren repräsentative Ergebnisse, die eine Abnahme sowohl der Traktionen als auch der interzellulären Spannungen unter einer hohen Chalcon-Dosierung (2 g/ml) im Vergleich zur Kontrolle zeigen. Dieses Protokoll kann nicht nur auf Cx43 angewendet werden, sondern auch auf andere Spaltknoten, vorausgesetzt, der entsprechende Inhibitor wird verwendet. Wir glauben, dass dieses Protokoll in den Bereichen kardiovaskuläre und mechanobiologische Forschung nützlich sein wird.

Phasenkontrastbilder der Steuerung, 0,2 g/ml und 2 g/ml-Chalcone-behandelte Monolayer wurden 30 Minuten vor der Chalcon-Behandlung (Abbildung 1A-C) und 2 Stunden nach der Chalcon-Behandlung (Abbildung 1D-F) aufgenommen. Es wurden zellinduzierte Perlenverschiebungen (m) beobachtet, die sowohl bei niedrig dosierten Chalcone- als auch bei hochdosierten Chalcon-Bedingungen abnehmen (<strong class="xf...

Hier stellen wir ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Spaltknoten-Anschluss 43 zu stören und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die endotheliale Biomechanik durch Beobachtung von Traktionen und interzellulären Spannungen zu messen.

Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Aufklärung der Rolle ermöglicht, die zelluläre Kräfte in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen spielen, wie z. B. Wundheilung und Krebsmetastasen. Der Hauptvorteil dieser mechanikbasierten Technik ist ihre Fähigkeit, Zell-Zell-Verbindungen gleichzeitig zu unterbrechen und ihre Auswirkungen auf zellgenerierte mechanische Kräfte, vor allem Traktionen und interzelluläre Stressoren, zu messen. Unser Protokoll ist auf eine Breite von pathophysiologischen Prozessen anwendbar, wie z. B. Krebsmetastasen, Atherosklerosen und Bluthochdruck.Unsere Methoden können integriert werden, um sowohl biochemische als auch biomechanische Analysen mit Organ-on-Chip-Modellen, biotechnischen Gewebekonstrukten, In-vitro-Medikamentenabgabesystemen und Gewebe-Cokultursystemen durchzuführen. Unser Protokoll ist ziemlich einfach durchzuführen. Wir raten jedoch denjenigen, die dieses Protokoll zum ersten Mal tun, Geduld zu haben und nicht durch die Schritte dieses Protokolls zu eilen.Unser Protokoll verfügt über einzigartige Schritte, die für Erstbenutzer möglicherweise nicht klar sind. Daher empfehlen wir Benutzern, unsere schriftlichen Schritt-für-Schritt-Verfahren zu befolgen und visuelle Demonstrationen als Anleitung zu verwenden. Zu Beginn bereiten Sie Blind-Silan-Lösung durch Mischen von 200 Milliliter ultrareinem Wasser mit 80 Mikroliter Essigsäure und 50 Mikroliter Silanmethacrylat.Die Bind-Silan-Lösung mindestens eine Stunde lang auf einer Rührplatte rühren. Behandeln Sie die Mitte gut einer Petrischale mit der Bind-Silan-Lösung für 45 Minuten. Entfernen Sie die Bind-Silan-Lösung und spülen Sie die Petrischale zwei- bis dreimal mit ultrareinem Wasser ab.Trocknen Sie die Petrischale Oberfläche und lagern Sie bei Raumtemperatur für die zukünftige Verwendung. Zur Herstellung der Hydrogellösung 12,49 Milliliter Reinstwasser in 2,062 Milliliter 40%Acrylamid und 375 Mikroliter 2%Bisacrylamid in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr mischen. Fügen Sie der Hydrogellösung 80 Mikroliter fluoreszierende Perlen hinzu.Schütteln Sie die Röhre vorsichtig, um die Perlen mit der Gellösung zu mischen. Halten Sie die Kappe locker auf dem Zentrifugenrohr und legen Sie sie in eine Vakuumkammer. Entgasen Sie die Gellösung für mindestens 45 Minuten in der Vakuumkammer.Um das Hydrogel zu polymerisieren, fügen Sie zunächst 75 Mikroliter 10%Ammoniumpersulfat hinzu und fügen Sie dann acht Mikroliter TEMED in die Hydrogellösung ein. 24 Mikroliter der Hydrogellösung in die Mitte der Petrischale stellen. Drücken Sie auf das Hydrogel mit einem 18-Millimeter-Abdeckungsschlupf, um das Hydrogel abzuflachen und eine Höhe von ca. 100 Mikrometern zu erreichen.Warten Sie mindestens 30 bis 40 Minuten auf die Gelpolymerisation. Tauchen Sie das polymerisierte Hydrogel in reines Ultrawasser ein, um eine Gelaustrocknung zu verhindern. Bedecken Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie, um das Photobleichen von fluoreszierenden Perlen zu verhindern und bei vier Grad Celsius aufzubewahren.Mischen Sie zunächst die PDMS-Silikonbasis mit dem Silikonhärtemittel im Verhältnis 20 zu eins in einem 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Invertieren Sie das Rohr auf den Kopf und schütteln Sie kräftig mehrmals, um eine ordnungsgemäße Durchmischung der PDMS-Lösung zu gewährleisten. Entfernen Sie die Blasen in der PDMS-Lösung, indem Sie eine Minute lang bei 190-fachen G.Pour fünf bis sechs Milliliter der PDMS-Lösung in der Mitte einer 100-Millimeter-Petrischale zentrieren, und erregen Sie die Schale, bis die PDMS-Lösung die gesamte Petrischalenoberfläche abdeckt.Härten Sie die PDMS-Lösung über Nacht bei 50 bis 60 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend eine kreisförmige PDMS-Schablone mit einem Lochstanzer mit einem Durchmesser von 16 Millimetern. Verwenden Sie einen Biopsies-Punch mit einem Durchmesser von 1,25 Millimetern, um kleine Löcher in der PDMS-Schablone zu erstellen.Sterilisieren Sie PDMS-Schablonen, indem Sie sie zwei bis drei Minuten lang in 70% Ethanol eintauchen, überschüssiges Ethanol absanieren und dann fünf Minuten unter UV-Licht stellen. Alle überschüssigen Flüssigkeiten ansaugen und den Deckelschlupf aus dem Hydrogel entfernen. Legen Sie die PDMS-Schablone auf die Hydrogeloberfläche und verwenden Sie eine Pinzette, um leichten Druck auf die PDMS-Schablone auszuüben, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen der PDMS-Schablone und der Hydrogeloberfläche zu gewährleisten.Bedecken Sie die Hydrogeloberfläche mit Sulfo-SAMPA gelöst in 0,1 Molaren-HEPES-Pufferlösung in einer Konzentration von 1 bis 1 000 und legen Sie das Hydrogel acht Minuten lang unter eine UV-Lampe mit einer Leistung von 36 Watt. Die überschüssige Sulfo-SAMPA- und HEPES-Lösung ansaugen und das Hydrogel zweimal mit 0,1 Mol-HEPES abspülen, gefolgt von zwei zusätzlichen Spülungen mit reinem Ultrawasser. Aspirieren Sie überschüssiges ultrareines Wasser und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um das Hydrogel mit 0,1 Milligramm pro Milliliter Kollagen-1 zu beschichten.Bedecken Sie die Schale, um die fluoreszierenden Perlen vor Photobleichungen zu schützen, und lagern Sie das Hydrogel über Nacht bei vier Grad Celsius. Fügen Sie nun drei Milliliter 1X Trypsin in den Kolben und legen Sie es in den Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten, um die Zellen von der Gewebekultur-Flasche zu lösen. Nach der Trypsinisierung drei Milliliter Zellkulturmedien in den Kolben geben, wirbeln und die Mischung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr geben.Zentrifugieren Sie die Zelllösung für drei Minuten bei 1, 710 mal G.Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in den Medien auf eine Konzentration von 50 mal 10 zu den vier Zellen pro Milliliter wieder aus. Nehmen Sie die Hydrogelschale aus dem Kühlschrank. Entfernen Sie das Collagen-1 aus dem Hydrogel und spülen Sie es einmal mit PBS ab.Fügen Sie 75 mal 10 zu den dritten Zellen an der Spitze der PDMS-Schablone hinzu und lassen Sie die Zellen mindestens eine Stunde lang im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid an der Hydrogeloberfläche anhaften. Entfernen Sie die PDMS-Schablone und tauchen Sie die PDMS-Schablone 10 x 15 Sekunden lang in 10-fache Trypsin-Datei unter, um alle angeschlossenen Zellen zu entfernen. Fügen Sie mindestens zwei Milliliter Medien in die Petrischale und sterilisieren Sie die Schablone, indem Sie mit 70% Ethanol sprühen und dann fünf Minuten unter das UV-Licht stellen.Legen Sie die Petrischale mindestens 36 Stunden im Inkubator oder bis eine konfluente Monoschicht beobachtet wird. Phasenkontrastbilder von 30 Minuten vor der Chalcone-Behandlung und zwei Stunden nach der Chalcone-Behandlung wurden verglichen. Zellinduzierte Perlenverschiebungen wurden beobachtet, um sowohl bei niedrig dosierten Chalcone- als auch bei hochdosierten Chalcon-Bedingungen im Vergleich zu HUVEC-Monolayern zu verringern.Vor der Chalcone-Behandlung lagen die RMS-Traktionen für alle Erkrankungen bei rund 51 Pascal. Nach der Chalcone-Behandlung gab es einen leichten Anstieg der RMS-Traktionen auf 59 Pascal in niedrig dosierten, mit Chalcon behandelten Monolayern und eine fast zweifache Abnahme der RMS-Traktionen auf 18 Pascal in hochdosierten, mit Chalkonbehandelten Monolayern im Vergleich zur Kontrolle. Die Chalcone-Behandlung erhöhte die durchschnittliche normale interzelluläre Stressgröße mit niedriger Dosis, verringerte aber signifikant die durchschnittliche normale interzelluläre Stressgröße mit hoher Dosis im Vergleich zur Kontrolle.Die Chalcone-Behandlung verringerte auch die maximale reinzelluläre Belastung bei niedriger und hoher Chalcone-Konzentration im Vergleich zur Kontrolle. Die Auswirkungen der Chalcone-Behandlung sind statistisch signifikant, basierend auf T-Tests und Einem-Faktor-ANOVA-Tests. Stellen Sie beim Auflegen der PDMS-Schablone auf das Gel sicher, dass das Gel trocken genug ist, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen der PDMS-Schablone und dem Gel zu gewährleisten.Dieses Protokoll kann auch angewendet werden, um den biomechanischen Beitrag einer Vielzahl von Zell-Zell-Verbindungen, Zytoskelettproteinen, Zellmatrix-Adhäsionsmolekülen oder extrazellulären Molekülen mit Live-Bildgebung zu untersuchen. Mit diesem In-vitro-Protokoll können Forscher nun erfolgreich eine Vielzahl biomechanischer sowie biochemischer Eigenschaften bei Gewebereparatur, Wundheilung oder Krebsmetastasen ohne Tiermodell untersuchen. Wir raten unseren Zuschauern, sehr vorsichtig zu sein, während chalcone und DMSO als Inhalation dieser Medikamente wird berichtet, schädlich zu sein.

perturbing-endothelial-biomechanics-via-connexin-43-structural

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Mikroskopische Aufnahmen von Live-Endothelzellen exprimieren GFP-Aktin ermöglicht die Charakterisierung der dynamischen Veränderungen in Zytoskelettstrukturen. Im Gegensatz zu Techniken, die fixierten Proben verwenden, bietet diese Methode eine detaillierte Bewertung der zeitlichen Veränderungen in der Aktin-Zytoskelett in den gleichen Zellen vor, während und nach verschiedenen physikalischen, pharmakologischen oder entzündliche Reize.

Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

Es ist bekannt, dass verschiedene Niveaus und Muster der Flüssigkeitsscherung die endotheliale Genexpression, den Phänotyp und die Anfälligkeit für Krankheiten modulieren. Wir diskutieren den Aufbau und die Verwendung von "Scherringen": ein Modell, das unidirektionale, periodische Schubspannungsmuster erzeugt. Scherringe sind einfach zu montieren, wirtschaftlich und können hohe Zellausbeuten erzeugen.

Die Montage und Anwendung der &quot;Shear Ringe &#39;: A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien wird beschrieben, so dass für die Zerlegung der Signalwege im Endothel, glatte Muskulatur, oder zwischen Endothel und glatte Muskulatur (der Myoendothelial-Kreuzung). Die selektive Anwendung des Agonisten oder Protein isoliert, Elektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenz kann mit diesem Handy-Kultur-Modell genutzt werden.

Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell für Gefäßerkrankungen, um Vollblut-Wechselwirkungen mit patientenabgeleitetem Endothel zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften der primären Endothelzellen unter verschiedenen Umständen. Das Verfahren eignet sich besonders zur Beurteilung der Thrombogenität und Antikoagulationstherapie in verschiedenen Phasen der Gerinnung.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung humaner Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Wir stellen auch detaillierte Methoden zur Erzeugung von Scherspannung und Dehnung zur Verfügung, um mechanische Spannungen in hSVECs zu untersuchen.

Humane Endothelzellisolierung der Vena saphena und Exposition bei kontrollierter Scherspannung und Dehnung

Hier stellen wir ein assembloides Modellsystem vor, um die zelluläre Wechselwirkung zwischen dem tragenden Sehnenkerngewebe und einem extrinsischen Kompartiment mit Zellpopulationen nachzuahmen, die durch Krankheit und Verletzung aktiviert werden. Als wichtigen Anwendungsfall demonstrieren wir, wie das System eingesetzt werden kann, um die krankheitsrelevante Aktivierung von extrinsischen Endothelzellen zu untersuchen.

Entwicklung von Sehnen-Assembloiden zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen bei Krankheit und Reparatur

Erfahren Sie, wie Sie Connexin 43 in Endothelzellen mechanisch disruptieren und Zugkräfte sowie interzelluläre Spannungen messen. Diese Methode ermöglicht biomechanische Analysen für Wundheilung und Krebsmetastasen.

Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Weitere Videos entdecken