Name: Adoptive Immuntherapie von iNKT-Zellen in Glucose-6-Phosphat-Isomerase (G6PI)-Induzierte RA-Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Erfahren Sie die adoptive Immuntherapie mit iNKT-Zellen zur Behandlung von rheumatoider Arthritis in einem G6PI-induzierten Mausmodell mit über 93 % Erfolgsrate. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Mechanismen.

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Unsere Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Colleges und dem Wissenschafts- und Technologie-Schlüsselforschungsprojekt der Provinz Hebei (ZD2017009) und dem Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University, unterstützt. Wir sind dankbar für ihre Unterstützung.

Alle Versuchsmäuse (insgesamt 150) waren gesunde männliche DBA/1-Mäuse, 6–8 Wochen alt (20,0 x 1,5 g), die in einer bestimmten pathogenfreien Umgebung (SPF) aufgezogen wurden. Es gibt keine spezielle Behandlung vor dem Modellieren. Das Experiment wurde in eine gesunde Kontrollgruppe (15 Mäuse), eine Modellkontrollgruppe (15 Mäuse) und eine Zelltherapiegruppe (55 Mäuse) unterteilt. Diese Studie wurde vom Tierschutz- und Ethikausschuss der Hebei University genehmigt.
1. Aufbau des Krankheitsmodells
<ol><li>Duplizieren des RA-Tiermodells<ol>
<li>Wiegen Sie 1,75 mg hG6PI 325-339 und hG6PI 469-483 Fragmente und lösen Sie sie in 5,25 ml mit 4 °C dreifach destilliertem Wasser auf.</li>
		<li>Komplettes Freund-Adjuvans (CFA) in einem 50 °C-Wasserbad auflösen, 5,25 ml in ein weiteres 10 ml Zentrifugenrohr ziehen und für den Einsatz abkühlen.</li>
		<li>Setzen Sie die Mischung aus hG6PI-Lösung und CFA-Lösung in eine künstliche Emulgierungseinheit mit zwei angeschlossenen Glasspritzen.</li>
		<li>Drücken Sie die Spritze mit einer konstanten Geschwindigkeit und Frequenz von 10–20x pro min, um die gemischte Peptidlösung und CFA-Lösung vollständig zu emulgieren. Führen Sie den Betrieb in einem Eisbad durch und halten Sie die Emulsionströpfchen nach Abschluss der Emulgierung 10 min im Wasser, ohne sich zu dispergieren.</li>
		<li>Injizieren Sie 150 l emulgierte hG6PIs subkutan in die Schwanzwurzel der Maus.</li>
		<li>Injizieren Sie 200 mg Pertussistoxin intraperitoneal bei 0 h und 48 h nach der hG6PI-Injektion in die Maus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Experimentelle Verifizierung des RA-Modells<ol>
<li>Messen Sie die Dicke der Mauspfote mit einem Vernier-Sattel (2x pro Tag).</li>
		<li>Beobachten und markieren Sie den Grad der Rötung und Schwellung des Fußes. Verwenden Sie die folgenden Bewertungskriterien: 1) Zehen mit leichter Schwellung; 2) dorsum pedis und Fußpolster mit klarer roter Schwellung; 3) Knöchel mit roter Schwellung.</li>
		<li>Euthanisieren Sie die Mäuse unter tiefer Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von 1% Natriumpentobarbital (50 mg/kg Körpergewicht) 14 Tage nach der Modellierung und entfernen Sie die Pfoten für HE Färbung.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Sekretionsniveaus von Serum IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-, und IFN-- mit einem kommerziellen cytometrischen Perlenarray (CBA) Assay gemäß dem Herstellerprotokoll.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Erhalt von iNKT-Zellen mit Adoptiv-Zelltherapie
<ol><li>Richtungsinduktion von iNKT-Zellen<ol>
<li>Injizieren Sie normale Mäuse intraperitoneal mit dem '-GalCer (0,1 mg/kg Körpergewicht).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung von iNKT-Zellen<ol>
<li>Drei Tage nach der Modellierung, injizieren Mäuse intraperitoneal mit 1% Natriumpentobarbital (50 mg/kg Körpergewicht) zur Anästhesie. Angemessen anästhesierte Mäuse zeigen keine Rückdpfotenentzugsreaktion auf eine Zehenklemme.</li>
		<li>Isolieren Sie die Milz einer DBA/1-Maus, nachdem Sie sie intraperitoneal mit dem GalCer injiziert haben. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension vor, indem Sie die Milz in einem 200-Mesh-Sieb schneiden und schleifen.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellsuspension mit PBS, Zentrifuge bei 200 x g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen mit 1 ml Vollblut- und Gewebeverdünnungslösung aus. Fügen Sie 3 ml Maus-Lymphozyten-Trennmedium hinzu, und zentrieren Sie dann die Zellen für 20 min bei 300 x g bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Sammeln Sie die Schicht der milchigen weißen Lymphozyten (d. h. die zweite Schicht von oben), waschen Sie sie 2x mit PBS und zählen Sie mit einem automatisierten Zellzähler.</li>
	</ol></li>
	<li>Magnetaktivierte Zellsortierung (MACS) positive Selektionsstrategie zur Reinigung von iNKT-Zellen ANMERKUNG: Für die Vorbehandlung von CD1d-Tetrameren wurden 1 mg/ml von '-Galcer mit 0,5% Tween-20 und 0,9% NaCl auf 200 g/ml verdünnt, und 5 l der resultierenden Lösung wurden 100 l der CD1d-Tetramerlösung zugesetzt. Die Mischung wurde für 12 h bei Raumtemperatur inkubiert und bei 4 °C zur Verwendung gestellt. TCR -wurde 80x mit entionisiertem Wasser verdünnt. Alle anderen Antikörper wurden als Lagerlösung eingesetzt.<ol>
<li>107 Zellen mit 100 l 4 °C PBS wieder aufhängen, 10 L mit dem Mit-GalCer-belasteten CD1d Tetramer-PE hinzufügen und bei 4 °C für 15 min im Dunkeln inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS und setzen Sie sie in 80 l PBS wieder auf.</li>
		<li>Fügen Sie 20 L Anti-PE-MicroBeads hinzu und inkubieren Sie sie bei 4 °C für 20 min im Dunkeln.</li>
		<li>Waschen Sie sie 2x mit PBS und suspendieren Sie die Zellen mit 500 l PBS.</li>
		<li>Legen Sie die Sortiersäule in das Magnetfeld des MACS-Sortierers und spülen Sie sie mit 500 l PBS.</li>
		<li>Fügen Sie die Zellensuspension aus Schritt 2.3.4 zur Sortierspalte hinzu, sammeln Sie den Flowthrough und spülen Sie 3x mit PBS-Puffer.</li>
		<li>Entfernen Sie das Magnetfeld und sammeln Sie die Zellen aus der Sortierspalte. Fügen Sie an dieser Stelle der Sortierspalte 1 ml PBS-Puffer hinzu, und drücken Sie den Kolben schnell mit konstantem Druck, um die beschrifteten Zellen in das Sammelrohr zu treiben und gereinigte iNKT-Zellen zu erhalten. Zählen Sie mit einem automatisierten Zellenzähler.</li>
	</ol></li>
	<li>Kennung des iNKT-Zellphänotyps<ol>
<li>Nehmen Sie 1 x 106 Zellen aus den Schritten 2.2.5 bzw. 2.3.7, und setzen Sie sie in 50 l PBS wieder aus.</li>
		<li>Antikörperinkubation: Fügen Sie den Antikörper nicht in das Negative Kontrollröhrchen, fügen Sie 0,5 l Tetramer von '-GalCer-PE-CD1d oder 10 'L FITC-TCR' in das einzelne Positivkontrollrohr ein. Fügen Sie 0,5 l des Tetramers von '-GalCer-PE-CD1d und 10 'L FITC-TCR' in das Probenröhrchen ein. Inkubieren Sie sie bei 4 °C für 30 min im Dunkeln.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen in PBS und zentrieren Sie dann bei 200 x g für 5 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml Foxp3 Foxation/Permeabilization Arbeitslösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 45 min bei 4 °C im Dunkeln.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml 1x 1x Permeabilisationspuffer-Arbeitslösung hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 500 x g bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 1 L Alexa Fluor 647 Maus Anti-PLZF und 1 l PerCP-Cy 5,5 Maus Anti-T-Bet (oder 1 l PerCP-Cy 5,5 Maus Anti-ROR-t) für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
		<li>Fügen Sie 2 ml Permeabilisationspuffer Arbeitslösung für die Reinigung.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 500 L PBS wieder aus und messen Sie die Durchflusszytometrie.</li>
	</ol></li>
	<li>Funktionelle Identifikation von iNKT-Zellen<ol>
<li>Nehmen Sie 3 x 106 iNKT-Zellen ab Schritt 2.3.7 und setzen Sie sie in 12 Brunnenplatten mit 1,5 ml RPMI-1640 unvollständigem Medium (d.h. ohne Serum) wieder auf.</li>
		<li>Phorbolester (PMA, 50 ng/ml) und Ionomycin-Calcium (IO, 1 g/ml) hinzufügen und 24 h in einen CO2-Inkubator geben.</li>
		<li>Sammeln Sie den Zellüberstand und erkennen Sie die Sekretionsstufen von IL-2, IL-17A, TNF-, IL-6, IL-4, IFN-, und IL-10 mithilfe eines kommerziellen CBA-Assays gemäß dem Herstellerprotokoll.</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentelle Studie zum Migrationsweg von iNKT-Zellen bei RA-Mäusen<ol>
<li>DiR-Farbstoff (2,5 mg/ml) in DMSO auflösen.</li>
		<li>Resuspend iNKT-Zellen in 6 Wellplatten mit RPMI-1640 unvollständigem Medium. Die Dichte beträgt 1 x 106 Zellen/ml.</li>
		<li>DiR-Lösung (5 g/ml) hinzufügen und 25 min in einem CO2-Inkubator inkubieren.</li>
		<li>Mit PBS waschen und die Zellen (3 x 106/300 l) wieder aussetzen, um DiR-markierte iNKT-Zellen (DiR-iNKT) zu erhalten.</li>
		<li>Injizieren Sie 1% Natriumpentobarbital (50 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal, um die Mäuse zu anästhesieren. Angemessen anästhesierte Mäuse zeigen keinen Hinterpfotenentzug, um zu kneifen. Tragen Sie die tierärztliche Salbe auf die Mausaugen auf, um Trockenheit unter Anästhesie zur Bildgebung zu verhindern.</li>
		<li>Injizieren Sie DiR-iNKT-Zellen 3 x 106 pro Maus in die Schwanzvene mit dem RA-Modell für 8 Tage. Überwachen Sie die iNKT-Zellen in Mäusen nach der Injektion für 0 min, 10 min, 30 min, 60 min und Tag 0 (nach 3 h), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38 und 42 Tage mit einem Kleintier-In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS). Die verwendete Anregungswellenlänge betrug 748 nm, die Emissionswellenlänge 780 nm und die Belichtungszeit war automatisch.</li>
		<li>Legen Sie jede Maus nach jeder Beobachtung in einen separaten Käfig und halten Sie die Brustbehebung aufrecht. Beobachten, bis er sich von der Anästhesie erholt.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bewertung der Adoptivimmuntherapie von RA-Mäusen mit iNKT-Zellen
<ol><li>iNKT-Zell-Adoptivimmuntherapie für RA-Mäuse<ol>
<li>Injizieren Sie 3 x 106 Zellen iNKT-Zellen pro Maus durch die Schwanzvene. Wählen Sie zufällig 15 Mäuse aus, die 8 Tage zuvor modelliert wurden, und erhalten Sie iNKT-Zellen ohne DiR-Beschriftung von Schritt 2.3.7 durch die Infusion der Schwanzvene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bewerten Sie die Wirksamkeit der Adoptivimmuntherapie für iNKT-Zellen.<ol>
<li>Messen Sie die Dicke der Pfote der Maus, quantifizieren Sie die Schwellung des Sprunggelenks und punkten Sie systematisch nach der Infusion von iNKT-Zellen, wie in den Schritten 1.2.1–1.2.2 beschrieben.</li>
		<li>Beobachten Sie die entzündliche Zellinfiltration und Gelenkveränderungen der Mausgelenke, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Sekretionsstufen von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-, und IFN--, wie in Schritt 1.2.4 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die Häufigkeit von iNKT-Zellen und Teilmengen.<ol>
<li>Isolieren Sie den Mausthymus und bereiten Sie eine Einzelzellsuspension vor.</li>
		<li>Trennen Sie die Lymphozyten mit Lymphozyten-Trennflüssigkeit.</li>
		<li>Bestimmen Sie die iNKT-Zellfrequenz und die Untergruppenhäufigkeit, wie in Schritt 2.4 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Statistische Auswertung ANMERKUNG: Alle Daten werden als Mittelwert sD dargestellt. Werte von P < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.<ol>
<li>Verwenden Sie die Ein-Faktor-Analyse der Varianz (ANOVA). Wenn die Varianz erfüllt ist, verwenden Sie den LSD-Test für einen weiteren Vergleich.</li>
		<li>Wenn die Varianz nicht einheitlich ist, verwenden Sie den nichtparametrischen Test. Verwenden Sie den Kruskal-Wallis H Test für den weiteren Vergleich31.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Parietti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+treatment+overcomes+reduction+of+regulatory+iNKT+cells+in+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).</li>
<li>Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mechanism%28s%29+of+the+inhibition+of+disease+progression+by+combination+treatment+with+fingolimod+plus+pathogenic+antigen+in+a+glucose-6-phosphate+isomerase+peptide-induced+arthritis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%2C+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model.</a> Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+adoptive+immunotherapy+on+rheumatoid+arthritis+with+Thymus-derived+invariant+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells.</a> International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).</li>
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Die Autoren erklären keine Finanzierung oder Interessenkonflikte.

iNKT-Zellen sind spezielle T-Zellen, die angeborene und adaptive Immunität überbrücken und hauptsächlich aus CD4++/CD8+ Thymosyten entwickelt werden. iNKT-Zellen haben verschiedene immunregulierende Funktionen und interagieren mit anderen Immunzellen durch direkten Kontakt und Sekretion verschiedener Zytokine23, die dendritische Zellen (DCs), Makrophagen, Neutrophile, B-Zellen, T-Zellen und NK-Zelldifferenzierung und -Entwicklung beeinflussen<sup class...

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch chronische, fortschreitende Invasivität mit 0,5–1% Inzidenz1,2gekennzeichnet ist. Die zugrunde liegende Pathogenese wird auf die abnormale Proliferation von autoreaktiven CD4+ und CD8+ T-Zellen zurückgeführt, die sich durch einen Anstieg des Anteils von CD4+IFN-+ und CD4+IL-17A+ T-Zellen und die reduzierte Anzahl von CD4+IL-4+ und CD4+CD25 + FoxP3+T-Zellen manifestiert. Daher wird die Sekretion von entzündlichen Zytokinen erhöht, und eine übermäßige Entzündungsreaktion zerstört die native Gleichgewichts- und Toleranzfunktion des körpereigenen Immunsystems. Darüber hinaus verschlimmern der Helfer T Lymphozyten (Th) 1 Zellen, die das Gelenk durchdringen, die Entzündungsreaktion und Gelenkschäden. Daher sind die Hemmung einer übermäßigen Entzündungsreaktion und die Wiederherstellung der Immuntoleranz und des Immungleichgewichts der Schlüssel zur Behandlung von RA3,4.
Die iNKT-Zellen haben sowohl NK-Zell- als auch T-Zellfunktionen und -Eigenschaften. Die iNKT-Zellen beherbergen eine ausgeprägte, invariante T-Zell-Rezeptor-Kette (TCR) mit begrenztem TCR-Kettenrepertoire5 und erkennen das Glycolipid-Antigen, das durch das Hauptmolekül des Histokompatibilitätskomplexes (MHC) Der Klasse I auf der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zellen dargestellt wird. Mitsuo et al.6 entdeckten eine große Anzahl von iNKT-Zellen und funktionelle Defekte bei vielen Autoimmunerkrankungen, einschließlich RA. Aurore et al.7 zeigten, dass iNKT-Zellen einen positiven Effekt auf die Aufrechterhaltung der Autoimmuntoleranz haben und dass, wenn die Anzahl und Funktion der iNKT-Zellen wiederhergestellt werden, die Krankheit gelindert wird. Darüber hinaus fanden Miellot-Gafsou et al.8 heraus, dass iNKT-Zellen nicht nur die Krankheit aushoben, sondern auch das Fortschreiten der Krankheit erhöhten. Diese widersprüchlichen Ergebnisse deuten darauf hin, dass iNKT-Zellen heterogene T-Zellen sind und die Funktion verschiedener Teilmengen umgekehrt werden kann. In einer klinischen Studie mit RA korrelierte die Häufigkeit von iNKT-Zellen mit dem Score der Krankheitsaktivität9. Die Ergebnisse bestätigten auch, dass die Häufigkeit von iNKT bei RA-Patienten verringert wurde, die Anzahl der CD4+IFN-A+ T-Zell-Untergruppen stieg und die sekretorischen Konzentrationen der entzündlichen Zytokine IFN-- und TNF---Werte um10,11stiegen. Darüber hinaus untersuchten Sharif et al.12 Typ-1-Diabetes (T1D) und fanden heraus, dass eine selektive Infusion von iNKT-Zellen die Expression des entzündlichen Zytokins IL-4 hochregulierte, die Immuntoleranz aufrechterhielt und die Entwicklung von Typ-1-Diabetes verhinderte. Daher erhöht die Adoptivinfusion bestimmter iNKT-Zellen oder die gezielte Aktivierung von iNKT-Zellen das Niveau von iNKT-Zellen bei RA-Patienten, was ein Durchbruch in der RA-Behandlung sein kann.
Die zelluläre Immuntherapie ist derzeit von großem Interesse und wurde häufig in der Krebstherapie eingesetzt. INKT-Zellen sind jedoch seltene, heterogene immunregulierende Zellen (nur 0,3% der Gesamtzahl der PBMCs)13, was potenzielle klinische Anwendungen einschränkt. Diese Zellen sind hauptsächlich in drei Subpopulationen unterteilt: 1) iNKT1-Zellen, die eine hohe Expression von promyelocytischer Leukämie Zink-Finger-Protein (PLZF) und T-Box-Transkriptionsfaktor (T-bet) haben; 2) iNKT2-Zellen mit Zwischenexpression von PLZF und GATA-Bindungsprotein 3 (GATA3); 3) iNKT17-Zellen mit geringer Expression von PLZF und retinooid-bezogenen Orphan-Rezeptor (ROR)--,--, die IFN-, IL-4 und IL-1714absondern. Aktivierte iNKT-Zellen sezernieren Th1, Th2 und Th17-ähnliche Zytokine, die die verschiedenen immunmodulatorischen Wirkungen von iNKT-Zellen15bestimmen. Die immunmodulatorischen und immuntherapeutischen Wirkungen der spezifischen Aktivierung verschiedener Subpopulationen von iNKT-Zellen sind unterschiedlich. Daher kann die Auswahl spezifischer Phänotypen von iNKT-Zellen (hauptsächlich iNKT2) mit entzündungshemmenden Funktionen zur Reregulierung der Immunantwort des Körpers das Immunungleichgewicht und Immunstörungen bei RA korrigieren.
Die Etablierung eines idealen Tiermodells ist von großer Bedeutung für die Behandlung und Untersuchung der RA-Pathogenese. Derzeit, die am häufigsten verwendeten und reifen Tiermodelle gehören Kollagen-induzierte Arthritis, adjuvante Arthritis, Zymosan-induzierte Arthritis, und Polysaccharid-induzierte Arthritis16–17. Es gibt jedoch kein Modell, das alle Funktionen menschlicher RA vollständig simulieren kann. Typ II Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) ist ein klassisches Arthritis-Modell. Die CIA wird durch Immunisierung von Mäusen mit Typ-II-Kollagen-spezifischen monoklonalen Antikörpern induziert, die die Antikörperabhängigkeit dieses Krankheitsmodells widerspiegeln. Benurs et al. beschrieben ein Modell mit einer systemischen Immunantwort auf Glucose-6-Phosphat-Isomerase (G6PI), das periphere symmetrische Polyarthritis bei anfälligen Mausstämmen18,19induziert. In diesem Modell hängt die Entwicklung von Arthritis von T-Zellen, B-Zellen und angeborener Immunität18,19,20ab. Horikoshi21 fand heraus, dass RA-Modelle, die aus der Immunisierung von DBA/1-Mäusen mit G6PI-Polypeptidfragmenten resultieren, in Bezug auf CD4+ T-Zellen und Zytokine (d. h. IL-6 und TNF-A) ähnlicher sind als die CIA-Modelle. Um die stimulierende Wirkung auf die TCR-Erkennungsstelle zu erhöhen, wurden die gemischten Polypeptidfragmente von G6PI (hGPI325-339 und hGPI469-483) verwendet, um DBA/1-Mäuse zu immunisieren, um das RA-Mausmodell zu konstruieren. Die Erfolgsrate dieses Ansatzes kann hoch sein, da hGPI325-339 und hGPI469-483 immundominant für I-A q-eingeschränkte T-Zellreaktionen sind. Daher kann dieses Modell die Überproliferation von CD4+ T-Zellen und iNKT-Zelldefekten bei RA-Patienten simulieren22. Die Grundlagenforschung der RA-Immunpathologie legte den Grundstein für unsere weitere vertiefte Untersuchung.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Maus Anti-PLZF</td><td>BD</td><td>563490</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>Anti-PE Mikrobeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td>Deutschland</td></tr><tr><td>Säulen</td><td>Miltenyi</td><td>MS</td><td>Deutschland</td></tr><tr><td>Kryogene Zentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Allegra&reg; X-15R</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>DiR</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific D12731</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>Einbettungszentrum</td><td>Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.</td><td>BMJ-1</td><td>China</td></tr><tr><td>FITC Hamster Anti-Maus TCR &beta; Chain</td><td>BD</td><td>553170</td><td>America</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td>America</td></tr><tr><td>Freund's komplettes Adjuvans</td><td>Sigma</td><td>F5881</td><td>America</td></tr><tr><td>hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)</td><td>Karebay Biochem</td><td>18062202</td><td>China</td></tr><tr><td>hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)</td><td>Karebay Biochem</td><td>18062203</td><td>China</td></tr><tr><td>In-vivo-Bildgebungssystem</td><td>PerkinElmer</td><td>Messschieber IVIS lumina II</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>Ionomycin Calcium</td><td>Cayman</td><td>10004974</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>KRN7000</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CN2-0013</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>Maus CD1d Tetramer-PE</td><td>MBL</td><td>TS-MCD-1</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Maus percoll</td><td>Solarbio</td><td>P8620</td><td>China</td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus-II</td><td>Japan</td></tr><tr><td>PerCP-CyTM5.5 Maus Anti-ROR-&upsih; t</td><td>BD</td><td>562683</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>PerCP-CyTM5.5 Maus Anti-T-bet</td><td>BD</td><td>561316</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>Pertussis</td><td>Toxin Sigma</td><td>P7208</td><td></td></tr><tr><td>Amerika Phorbolester</td><td>Kaiman</td><td>10008014</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>Rote Blutkörperchen Lysepuffer</td><td>BD</td><td>555899</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Biologische Industrie</td><td>01-100-1ACS</td><td>Israel</td></tr><tr><td>Th1/Th2/Th17 Zytokine Kit</td><td>BD</td><td>560485</td><td>Amerika</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>Leica EM UC6</td><td>Deutschland</td></tr></tbody></table>

adoptive immuntherapie von inkt-zellen in glucose-6-phosphat-isomerase (g6pi)-induzierte ra-mäuse

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine komplexe chronisch entzündliche Autoimmunerkrankung. Die Pathogenese der Krankheit ist mit invarianten natürlichen Killer-T-Zellen (iNKT) verwandt. Patienten mit aktiver RA präsentieren weniger iNKT-Zellen, defekte Zellfunktion und übermäßige Polarisation von Th1. In dieser Studie wurde ein RA-Tiermodell mit einer Mischung aus hGPI325-339 und hGPI469-483 Peptiden erstellt. Die iNKT-Zellen wurden durch In-vivo-Induktion und In-vitro-Reinigung gewonnen, gefolgt von einer Infusion in RA-Mäuse für die Adoptivimmuntherapie. Das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS)-Tracking ergab, dass iNKT-Zellen hauptsächlich in Milz und Leber verteilt waren. Am 12. Tag nach der Zelltherapie verlangsamte sich die Krankheitsprogression signifikant, die klinischen Symptome wurden gelindert, die Häufigkeit von iNKT-Zellen im Thymus nahm zu, der Anteil von iNKT1 im Thymus nahm ab, und die Konzentrationen von TNF-, IFN-, und IL-6 in das Serum verringerte sich. Die Adoptivimmuntherapie von iNKT-Zellen stellte das Gleichgewicht der Immunzellen wieder her und korrigierte die übermäßige Entzündung des Körpers.

Die Arthritis Index-Score und Pfotendicke erhöht nach dem Modellieren. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die Zehen der RA-Modellgruppe 6 Tage nach dem Modellieren eine rote Schwellung, mit allmählicher Verschlimmerung. Nach 14 Tagen erreichte die rote Schwellung im Sprunggelenk ihren Höhepunkt, gefolgt von einer allmählichen Linderung. Die Dicke der Pfote änderte sich ähnlich (P &lt; 0.05) (Abbildung 1).
Die entzündliche Zellinfiltration nahm nach d...

Dieses Protokoll verwendet G6PI gemischte Peptide, um rheumatoide Arthritis-Modelle zu konstruieren, die näher an denen der menschlichen rheumatoiden Arthritis in CD4+ T-Zellen und Zytokinen sind. Hochreine invariante natürliche Killer-T-Zellen (hauptsächlich iNKT2) mit spezifischen Phänotypen und Funktionen wurden durch In-vivo-Induktion und In-vitro-Reinigung zur Adoptivimmuntherapie erhalten.

Adoptive Immuntherapie von iNKT-Zellen in Glucose-6-Phosphat-Isomerase (G6PI)-Induzierte RA-Mäuse

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Unser Protokoll beschreibt eine Methode zum Erstellen eines RA-Modells. Seine Erfolgsrate liegt bei über 93 Prozent und seine Pathogenese hängt von T-Zellen, B-Zellen und angeborener Immunität ab, was es Forschern ermöglicht, die Pathogenese von RA aus einer globalen Immunperspektive besser zu untersuchen. Dann verwenden wir INKT-Zellen mit immunmodulatorischen Wirkungen für ihre Behandlung.INKT-Zellen haben eine gute Wirkung auf die Behandlung durch in vivo Einführung, die grundlegende Datenunterstützung für die klinische Anwendung von INKT-Zellen bieten und den klinischen Anwendungswert von INKT-Zellen wirklich explodieren lassen. Der größte Vorteil dieser Technologie ist, dass sie einfach zu bedienen und einfach zu kopieren ist. Demonstriert wird das Verfahren von Chen Shengde, Gao Xiang und Zhang Jingnan, Doktoranden meines Labors.Zunächst wiegen 1,75 Milligramm HGPI325 bis 339 und HGPI469 bis 483 Fragmente und lösen sie in 5,25 Milliliter n.G. 4 Grad Celsius dreifach destilliertem Wasser auf. Lösen Sie Complete Freund es Adjuvant in einem 50 Grad Celsius Wasserbad auf. 5,25 Milliliter in ein weiteres 10 Milliliter Zentrifugenrohr ziehen und für den Einsatz abkühlen lassen.Setz

adoptive-immunotherapy-inkt-cells-glucose-6-phosphate-isomerase-g6pi

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T (TEM)-Lymphozyten vermittelt. Hier zeigen wir, wie um Antigen-spezifische TEM-Zellen zu aktivieren, bewegen Adoptiveltern DTH in Lewis-Ratten und überwachen die entzündliche Reaktion.

Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten

Generierung von T-Lymphozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) gibt einen alternativen Ansatz der Verwendung von embryonalen Stammzellen für die T-Zell-basierten Immuntherapie. Verfahren zeigt, dass durch Verwendung von...

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von invarianten natürlichen Killer-T-Zellen, auch bekannt als iNKT-Zellen. Das Verfahren beginnt mit der Injektion eines synthetischen Glykolipids in eine Maus, um die Aktivierung und Proliferation von iNKT-Zellen in der Milz zu stimulieren. Anschließend werden einzellige Suspensionen aus der Milz hergestellt und mit iNKT-Zell-erkennenden Komplexen, die mit Fluorophoren markiert sind, inkubiert, gefolgt von einer magnetischen Bead-basierten...

Isolierung invarianter natürlicher Killer-T-Zellen aus einem Mausmodell

Dieses Video zeigt eine zellbasierte Therapie für Autoimmunarthritis bei Mäusen. iPSC-abgeleitete T-regulatorische Zellen, die Ovalbumin-spezifische Rezeptoren exprimieren, werden mit methyliertem Rinderserumalbumin (mBSA) injiziert, das in einem Adjuvans emulgiert wird. Murine Antigen-präsentierende Zellen (APCs) verarbeiten und präsentieren das mBSA an T-Zellen, was zur Aktivierung der T-Zellen und zur Migration zur Synovialmembran des Kniegelenks führt. Nachfolgende Injektionen umfassen mBSA...

Eine zellbasierte Therapie für Autoimmunarthritis im Mausmodell

Dieses Video demonstriert eine bildgebende Methode zur Visualisierung transplantierter Luciferase-exprimierender Betazellen in einer nicht adipösen diabetischen immundefizienten Maus. Die Einführung von Splenozyten aus einer diabetischen Maus führt zu einer fortschreitenden Zerstörung der Betazelle, die visuell durch eine abnehmende Lumineszenz nach Substrateinführung bestätigt wird.

Bildgebung transgener Betazellen in einer immundefizienten Maus, die mit diabetischen Splenozyten konfrontiert war

Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

Wir stellen hier eine Methode zur Entwicklung von funktionellen Antigen (Ag)-spezifischen regulatorischen T-Zellen (Tregs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) für die Immuntherapie von Autoimmunarthritis in einem Mausmodell vor.

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Der nicht-menschliche Primat (NHP) ist aufgrund der anatomischen und genetischen Ähnlichkeiten ein ideales Modell für die Untersuchung der zellulären Therapeutika der menschlichen Netzhaut. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur submakulären Transplantation von retinalen Pigmentepithelzellen im NHP-Auge und Strategien zur Verhinderung intraoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit der Makulamanipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt eine unkomplizierte und minimalinvasive Methode zur Transplantation und Bildgebung von NIT-1-Zellen in nicht-adipösen diabetischen (NOD)-schweren kombinierten immundefizienten Mäusen, die mit Splenozyten konfrontiert wurden, die von spontan diabetischen NOD-Mäusen gereinigt wurden.

Biolumineszentes Monitoring des Transplantatüberlebens in einem adoptiven Transfermodell des Autoimmundiabetes bei Mäusen

Hier berichten wir über ein Protokoll, das ein Mausmodell für rheumatoide Arthritis (RA) durch adoptiven Transfer von CD4+ T-Zellen von SKG-Mäusen etabliert und ein schnelles und zuverlässiges experimentelles Werkzeug zur Untersuchung der immunologischen Mechanismen, des pathologischen Fortschreitens und der Entwicklung neuer Therapien für RA bietet.

Ein adoptives Transfermodell der rheumatoiden Arthritis bei Mäusen

Erfahren Sie die adoptive Immuntherapie mit iNKT-Zellen zur Behandlung von rheumatoider Arthritis in einem G6PI-induzierten Mausmodell mit über 93 % Erfolgsrate. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Mechanismen.

Adoptive Immuntherapie von iNKT-Zellen in Glucose-6-Phosphat-Isomerase (G6PI)-Induzierte RA-Mäuse

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