Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

Kleine RNA regulieren viele biologische Prozesse. Daher ist es wichtig, sensible und unvoreingenommene Methoden zu ihrer Erkennung zu entwickeln. Unser Protokoll bietet Fortschritte in Richtung dieses Ziels.

Unser Protokoll leidet unter weniger Voreingenommenheitsproblemen als klassische Methoden zur Aneignung von RNA-Bibliotheken, und vor allem ermöglicht es eine sensiblere Detektion von zwei Prong- oder Meso-RNAs. Wie z. B. pflanzliche Mikro-RNAs. Nach Extraktion der gesamten RNA nach Standardprotokollen.

Führen Sie ein 15%TBE Harnstoffgel für 15 Minuten bei 200 Volt vor. Und mischen Sie fünf bis zwanzig Mikrogramm gesamter RNA in einem Volumen von fünf bis fünfzehn Mikrolitern mit einem gleichen Volumen an Formamid-Ladefarbstoff in einem 200-Mikroliter-Rohr. Nach fünf Minuten bei 65 Grad Celsius, in einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel, sofort die Rohre auf Eis legen und die letztere belasten und auf das Gel mit mindestens einer Spur zwischen ihnen proben.

Dann laufen Sie das Gel bei 200 Volt, bis das Bromphenol etwa zwei Drittel der Länge des Gels migriert hat. Um die RNA zu laden, punktieren Sie zuerst den Boden eines Nuklease-freien 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohrs mit einer 21-Spur-Nadel und legen Sie das punktierte Rohr in einen nukleasefreien runden Boden zwei Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Als nächstes inkubieren Sie das Gel bei Raumtemperatur mit Nukleinsäure-Gelfleck in Wasser für zehn bis fünfzehn Minuten, bevor Sie das Gel auf einem Transilluminator betrachten.

Schneiden Sie die Proben-RNA zwischen 17 und 29 Nukleotidleiterbändern aus und übertragen Sie das Gelstück in das punktierte Rohr. Drehen Sie das Gel in einer Mikrozentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für zwei Minuten, und entfernen Sie das 0,5 Milliliter Rohr, das jetzt leer sein sollte. Fügen Sie dem zerkleinerten Gel 300 Mikroliter Nukleasefreies 0,3 Molaren-Natriumchlorid hinzu und legen Sie das Rohr mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einen Rotator.

Am Ende des Endes der Inkubation die Suspension der zerkleinerten Gelteile in eine Spinsäule und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in der Mikrozentrifuge. Für die Elimination von drei Prime-Adaptern zehn Mikroliter freies Wasser mit der extrahierten RNA-Probe gründlich mischen und sechs Mikroliter von drei Molaren-Natriumacetat mit Mischen hinzufügen. Fügen Sie 40 Mikroliter magnetische Reinigungsperlen und 60 Mikroliter Isopropanol mit gründlicher Durchmischung in die Probe ein.

Und die Suspension für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Am Ende der Inkubation die Probe auf ein magnetisches Rack legen, bis die Lösung klar wird. Entfernen Sie den klaren Überstand und fügen Sie 180 Mikroliter frisch zubereitetes 80%Ethanol in die Perlen.

Entfernen Sie nach 30 Sekunden das Ethanol und drehen Sie das Rohr kurz. Entfernen Sie alle Restflüssigkeiten, die sich an der Unterseite des Rohres gesammelt haben, und lassen Sie die Perlen für zwei Minuten trocknen, bevor Sie die Probe in 22 Mikrolitern von 10 Millimolaren Tris wieder aufhängen. Nach zwei Minuten magnetisieren Sie die Probe, bis die Lösung klar erscheint.

Als nächstes mischen Sie 20 Mikroliter klaren Überstand mit sechs Mikrolitern von drei Molaren-Natriumacetat in einem neuen Rohr, und fügen Sie 40 Mikroliter magnetische Perlen und 60 Mikroliter 100%Isopropanol. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Probe magnetisieren, bis die Lösung klar erscheint, bevor Sie den Überstand entfernen. Behandeln Sie die Probe mit 180 Mikroliter frisch zubereitetem 80%Ethanol für 30 Sekunden, bevor Sie das Ethanol entfernen, das die Probe herunterdreht, und entfernen Sie alle Restflüssigkeiten, die sich an der Unterseite des Rohres angesammelt haben.

Nachdem Sie die Perlen für zwei Minuten trocknen lassen, setzen Sie sie in 10 Mikroliter nukleasefreies Wasser für zwei Minuten wieder auf, bevor Sie die Probe magnetisieren, bis die Lösung klar wird. Dann übertragen Sie neun Mikroliter Überstand in ein neues Rohr und fügen Sie einen Mikroliter T4-RNA-Ligasepuffer und einen Micrcoliter Wasser in die Probe. Für die Gelreinigung fünf, zehn und zwanzig Mikroliter PCR-Produkt auf einem nativen 6%TBE-Gel für etwa eine Stunde laufen.

Inkubieren Sie das fertige Gel mit Nukleinsäure-Gel-Färbung in Wasser für zehn bis fünfzehn Minuten, und sehen Sie sich das Gel auf einem Transilluminator an, um die Extraktion des 150 Base pair Bibliotheksbandes zu ermöglichen. Da es schwierig ist, das 150 Basispaarband, das sie darstellt, zu isolieren, sind dies unsere Bibliothek, aufgrund des Vorhandenseins von eng migrierenden Nebenprodukten müssen Sie das Gel sehr sorgfältig schneiden. Dann isolieren Sie die RNA, wie gerade gezeigt.

Laden Sie für die Änderung der Rohsequenzdatei die fastq-Sequenzdateien herunter, die während des Sequenzierungslaufs generiert wurden, und preform demultiplexing mit bcl2fastq2 bei Bedarf. Entfernen Sie Adaptersequenzen mit cutodapt, und verwenden Sie den Befehl wie gezeigt. Verwenden Sie seqtk, wie angegeben, um die terminalen zufälligen Nukleotide in den Sequenzen zu entfernen.

Verwenden Sie dann den Befehl awk wie angegeben, um die Sequenzen zu verwerfen, die kürzer als 10 Nukleotide sind. Um die getrimmten Sequenzen zuzuordnen, öffnen Sie miRBase und laden Sie die ausgereifte Fa-Datei herunter. Verwenden Sie den angegebenen Befehl, um U-Rückstände durch T-Rückstände zu ersetzen, um eine vollständige Liste aller Mikro-RNAs in der Datenbank zu erstellen, die aus einer Vielzahl von Organismen stammen.

Wählen Sie die Mikro-RNA-Sequenzen des Organismus von Interesse, mit dem Befehl wie angegeben, und ordnen Sie die Lesevorgänge der Datei mit bowtie2, so dass keine Inkongruenzen. Verwenden Sie das Tool, um die Sequenzen in der Datenbank auszurichten, sodass ein Lesecode vollständig einer Mikro-RNA der Datenbank zugeordnet werden muss, ohne dass die sukzessorische Übereinstimmungen, wie angegeben, enthalten sind. Verwenden Sie dann den Befehl, um die Lesevorgänge zu verwerfen, die nicht ausgerichtet wurden.

Nachdem die Mengen einer PCR-verstärkten Bibliothek wie nachgewiesen auf ein Gel geladen wurden, können die Produkte, die der erwarteten Größe entsprechen, extrahiert werden. Nach der Elution kann die gereinigte Bibliothek auf einem Kapillargel-Elektrophorese-Chip überprüft werden. Zusätzlich zu den erwarteten 150 Basispaarprodukt, und immer mehr Anteil einer 130 Basispaar-Arten entsprechend Adapter-Dimer, werden in der Regel beobachtet, wie zunehmende Menge an PCR-Produkt geladen werden.

Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn Bibliotheken aus einer Mischung synthetischer kleiner RNAs mit Reagenzien aus Kits oder anderen Verbrauchsmaterialien hergestellt werden. Zum Vergleich werden zuvor veröffentlichte Ergebnisse für den gleichen kleinen RNA-Mix angezeigt. Hier wird ein Leistungsvergleich des Protokolls TS5 mit dem Standard-TS-Protokoll zum Nachweis von menschlichen unveränderten und zwei erstklassigen O-Methal-modifizierten Pflanzenmikro-RNAs gezeigt.

Der Nachweis von zwei erstklassigen O-Methal-modifizierten PiRNAs in menschlichen Proben wurde ebenfalls getestet. Wie beobachtet, hat TS5 deutlich besser als TS für den Nachweis von zwei erstklassigen O-Methal RNAs vorgeformt, jedoch nicht für unveränderte RNAs. Bereiten Sie Replikationsbibliotheken für jedes Beispiel zu unterschiedlichen Datumsangaben vor.

In der Regel gibt es wenig Variation zwischen Replikationen gleichzeitig gemacht, oder es kann erhebliche Variationen zwischen Bibliotheken zu verschiedenen Datumsvorbereitungen.