Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen
30. Juli 2019
Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.
Die mitochondriale Funktion ist entscheidend für die hämatopoetische Stammzell-Selbsterneuerung. Mitochondrienaktivität ist ein Reflektor des inneren mitochondrialen Membranpotentials, das mit TMRM, einem zellfluoreszierenden, zellpermeant kationischen Farbstoff, gemessen werden kann. Xenobiotische Efflux-Pumpen sind in HSC sehr aktiv und verursachen TMRM-Extrusion.
Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Korrektur dieses Effekts, wobei Verapamil, ein Inhibitor der Effluxpumpen, verwendet wird. Beginnen Sie mit der Isolierung des Knochenmarks von Denfemuren der Maus. Verwenden Sie ein Paar Zangen und scharfe Schere, um die beiden hinteren Pfoten zu schneiden.
Dann machen Sie einen kleinen Schnipsel in der ventralen Haut der Maus, und dehnen Sie es. Extrahieren Sie den Oberschenkelknochen und die Tibia, wobei Sie darauf achten, die Köpfe des Oberschenkelknochens nicht zu lösen, und legen Sie die Knochen in eine Sechs-Brunnen-Platte, gefüllt mit 1,5 Milliliter Färbepuffer. Entfernen Sie die Muskeln aus den Knochen, und schneiden Sie die Enden der Knochen, so dass Knochenmark zu verlassen.
Legen Sie die gereinigten Knochen in neue Brunnen, mit 1,5 Milliliter Nstrich. Dann spülen Sie das Knochenmark mit einer Drei-Milliliter-Spritze und einer 25-Meter-Nadel aus, bis der Knochen weiß wird. Sammeln Sie alle Zellen in einem 1,5 Milliliter-Rohr, und zentrifugieren Sie sie für fünf Minuten bei 180 mal G, dann entsorgen Sie den Überstand.
Das Pellet vorsichtig in 300 Mikrolitere eiskaltem ACK-Lysing-Puffer aussetzen und die Zellen für eine Minute auf Eis legen. Deaktivieren Sie dann sofort die Lyse, indem Sie einen Milliliter Färbepuffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 180-fachg. G.Resuspend das Zellpellet, das weiß erscheinen sollte, in einem Milliliter Färbepuffer.
Filtern Sie die Zellen mit einer Zellsiebkappe mit einem 35 Mikrometer Nylongewebe, um mononukleäre Zellen zu erhalten. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Linie Cocktail, und Fluorophor konjugierte Antikörper, nach Manuskript Richtungen. Bewahren Sie die Antikörper auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht.
Zentrifugieren Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 180 mal G und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 400 Mikroliter des Lineage-Cocktails und vier Mikroliter CD135-Biotinyl-Antikörper in das Zellpellet und wirbeln Sie die Mischung aus. Dann inkubieren Sie es auf Eis für 30 Minuten.
Waschen Sie die Probe nach der Inkubation, indem Sie drei Milliliter Färbepuffer hinzufügen, sie fünf Minuten bei 180 mal G nach unten drehen und den Überstand entsorgen. Dann 400 Mikroliter Antikörperlösung hinzufügen und die Mischung wirbeln. Bebrüte es noch 30 Minuten auf Eis und die Wäsche mit dem Färbepuffer wiederholen.
Um die TMRM-Färbelösung vorzubereiten, fügen Sie 2,2 Mikroliter TMRM-Stammlösung und 1,1 Mikroliter Verapamil zu 1,1 Milliliter serumfreies hämatopoetisches Kulturmedium mit Thrombopoietin und Stammzellfaktor hinzu. Setzen Sie das Knochenmark in einem Milliliter der TMRM-Färbelösung wieder auf, wirbeln Sie schnell aus und brüten Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Filtern Sie die Probe mit einer Zellsiebkappe mit einem 35 Mikrometer Nylongewebe, um eine Verstopfung des Durchflusszytometers zu vermeiden.
Fügen Sie dann einen Mikroliter DAPI hinzu und fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort. Führen Sie die Knochenmarkprobe aus, und erfassen Sie mindestens eine Million Ereignisse. Zeigen Sie dann die lebenden Knochenmark-Mononuklezellen in einem Diagramm für pazifisches Blau an, um CD135 Lin-negative und Lin-positive Fraktionen zu identifizieren.
Plotten Sie die Lin-negative Fraktion für APC/Cy7 im Vergleich zu PE/Cy7, um den multipotenten Vorläufer oder mPP-Anteil zu identifizieren. Zeichnen Sie dann die MPP-Fraktion für APC versus PerCP/Cy5.5, um die hämatopoetische Stammzelle oder HSC-Fraktion zu identifizieren. Zeigen Sie den HSC-Anteil für FITC oder CD34 an, um ihn in CD34-negative HSC- und CD34-positive HSC-Fraktionen aufzuteilen.
Schließlich erwerben Sie die TMRM-Intensität in jeder Population. Um sicherzustellen, dass die TMRM-Färbung korrekt funktioniert, fügen Sie der Probe einen Mikroliter FCCP für eine Endkonzentration von einem Millimolar hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Dann erwerben Sie eine Million Ereignisse.
Nach der FCCP-Zugabe sollte die TMRM-Intensität drastisch erhöht werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um das mitochondriale Membranpotenzial in verschiedenen Zellpopulationen mit TMRM-Farbstoff zu quantifizieren. Es wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von PBS und FBS im Kulturmedium die TMRM-Signalintensität beeinflusst.
Daher ist es wichtig, TMRM Färbung in serumfreien Expansionsmedium durchzuführen. Hämatopoetische Stammzellen drücken hohe Aktivitätsniveaus von xenobiotischen Effluxpumpen aus, die TMRM-Farbstoff extrudieren. So variieren TMRM Profile auch in Gegenwart von Verapamil oder Cyclosporin H, die die Pumpen blockieren.
Um die Genauigkeit der TMRM-Färbung zu überprüfen, kann FCCP die Mitochondrien depolarisieren und die TMRM-Intensität reduzieren. Dieses Protokoll kann leicht für das Studium von HSC mit einem anderen mitochondrialen Membranpotentialfarbstoff, einschließlich TMRE oder JC-1, angepasst werden. Ebenso wie andere mitochondriale Farbstoffe wie MitoTracker oder MitoSOX.
Die kritischen Probleme, die durch die unterschiedliche Aktivität von Efflux-Pumpen unter der Knochenmarkpopulation geerbt wurden, wurden erst vor kurzem aufgezeigt. Dieses Protokoll zielt daher darauf ab, die Diskrepanz zwischen früheren Erkenntnissen zu verringern.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie untersucht das mitochondriale Membranpotential in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) unter Verwendung von TMRM, einem fluoreszierenden Farbstoff, sowie den Einfluss von Xenobiotika-Ausstrompumpen. Es wird ein Protokoll vorgestellt, das Verapamil zur genauen Messung der TMRM-Konzentrationen durch Hemmung dieser Pumpen einbezieht, wodurch eine zuverlässige Beurteilung der mitochondrialen Funktion ermöglicht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Mitochondriale Dynamik in Stammzellen
- Celluläre Effluxmechanismen
- Messung des Membranpotentials
Hintergrund
- Bedeutung der mitochondrialen Funktion für die Stammzellvermehrung
- Herausforderungen durch Effluxpumpen bei der Farbstoffmessung
- Verwendung von TMRM als Indikator für das mitochondriale Membranpotential
Verwendete Methoden
- Isolierung des Knochenmarks von Mäusen
- Durchflusszytometrie zur Analyse von Zellpopulationen
- Hemmung von Effluxpumpen mittels Verapamil
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials in HSPCs
- Nachgewiesene Wirkungen von Verapamil auf die TMRM-Retention
- Anpassungsfähigkeit des Protokolls für alternative mitochondriale Farbstoffe
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der mitochondrialen Aktivität in Stammzellen.
- Die Ergebnisse vertiefen das Verständnis der Stammzellbiologie und der Wirkungen pharmakologischer Substanzen auf die mitochondriale Funktion.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die genaue Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen ist entscheidend für das Verständnis der Selbstvermehrung von Stammzellen und deren metabolischer Regulation. Die Aktivität von Effluxpumpen in diesen Zellen kann die Messung fluoreszierender Farbstoffe verfälschen und zu verzerrten Daten führen, die die Zielvalidierung und die Zuverlässigkeit präklinischer Modelle beeinträchtigen. Dieses Protokoll behebt eine wesentliche technische Einschränkung bei auf Durchflusszytometrie basierenden Assays und verbessert die Datenkonsistenz für nachgeschaltete Forschungs- und translationsmedizinische Anwendungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der mitochondrialen Funktion als therapeutisches Ziel in hämatopoetischen Stammzellen, indem Messartefakte durch Farbstoffausstrom reduziert werden.
- Operationaler Wert: Unterstützt den konsistenten Vergleich von Stamm- und Vorläuferzellpopulationen über verschiedene experimentelle Modelle hinweg, indem Variabilität xenobiotischer Transporter korrigiert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte hämatopoetische Systeme für die Wirkstoff-Screening vor, indem sichergestellt wird, dass die Messung des mitochondrialen Membranpotentials den tatsächlichen biologischen Zustand widerspiegelt und nicht von Effluxaktivität beeinflusst wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays durch die Verwendung von Effluxpumpeninhibitoren wie Verapamil in Färbeprotokollen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die mechanistische Risikominderung, indem zuverlässige Daten zur mitochondriellen Aktivität bereitgestellt werden, die mit Stammzell-Selbsterneuerungswegen verknüpft sind.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem ein zentraler funktioneller Endpunkt über verschiedene Modellsysteme hinweg standardisiert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess ein, indem sie die Hypothesenprüfung in der Stammzellbiologie unterstützt und zuverlässige funktionelle Profilierungen ermöglicht, bevor Ansatzpunkte identifiziert werden.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Validierung mitochondrialer Zielstrukturen und die Aufklärung von Signalwegen in hämatopoetischen Systemen, indem falsch niedrige Signale durch Farbstoffausscheidung minimiert werden.
- Screening: Ermöglicht quantitative und reproduzierbare Messungen des mitochondrialen Membranpotentials bei gehemmter Efflux, wodurch die Detektion von Substanzeffekten verbessert wird.
- Analytik: Erzeugt auf Durchflusszytometrie basierende Messgrößen (TMRM-Intensität), die den Vergleich von Stoffwechselzuständen zwischen verschiedenen Zellfraktionen und Behandlungsbedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Vernetzt mit präklinischer Forschung, indem eine übertragbare Messgröße für die Fitness von Stammzellen bereitgestellt wird, die mit funktionellen Ergebnissen korreliert.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen wiederverwendbaren Workflow der Durchflusszytometrie zur Beurteilung der mitochondrialen Gesundheit in Stammzellmodellen über mehrere Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei Studien zu Stammzellmechanismen, indem eine wesentliche Quelle für Variabilität in Assays eliminiert wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Mitochondrienassays in der hämatopoetischen Forschung.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen bei der Zielvalidierung, indem falsch-negative Ergebnisse, die auf Farbstoffefflux zurückzuführen sind, reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Stammzellzielen auf Grundlage genauere funktioneller Daten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Durchflusszytometrie, der Stammzellisolierung und im Umgang mit fluoreszierenden Farbstoffen.
- Hängt vom Zugang zu Verapamil oder alternativen Effluxpumpeninhibitoren sowie kompatiblen Färbepuffern ab.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen, um eine konsistente Inkubationsdauer und Konzentration der Inhibitoren sicherzustellen.
- Muss potenzielle Nebenwirkungen von Verapamil auf die Zellviabilität oder den Stoffwechsel in Langzeitkulturen berücksichtigen.
- Auf Anwendungen beschränkt, bei denen das mitochondriale Membranpotenzial eine relevante funktionelle Messgröße darstellt und bekannt ist, dass Effluxaktivität stört.
