Name: Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Lernen Sie eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen mittels Durchflusszytometrie. Die Hemmung von Efflux-Pumpen mit Verapamil ermöglicht präzise TMRM-basierte Quantifizierungen.

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Die Autoren danken allen Mitgliedern des Ito-Labors, insbesondere K Ito und H Sato, und dem Einstein Stem Cell Institute für Kommentare und den Kerneinrichtungen Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (gefördert vom National Cancer Institute Grant P30 CA013330) für Hilfe bei der Durchführung der Experimente. K.I. wird von den National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 und R01DK100689) und dem New York State Department of Health als Core Director of Einstein Single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154) unterstützt. K.I. Ito ist Forschungsstipendiat der Leukämie- und Lymphom-Gesellschaft.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Albert Einstein College of Medicine genehmigt.
1. Vorbereitung von Lösungen
<ol><li>Färbepuffer (phosphatgepufferte Saline (PBS) + 2% fetales Rinderserum (FBS)): Fügen Sie 10 ml FBS in 500 ml einer sterilen PBS-Lösung hinzu. HINWEIS: Diese Lösung kann bei 4 °C für mindestens einen Monat in sterilem Zustand gelagert werden. Bevor Sie mit den folgenden Verfahren beginnen, legen Sie ein Aliquot dieser Lösung (50 ml) auf Eis.</li>
	<li>ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysing-Puffer: Legen Sie einen Aliquot von ACK-Lysing-Puffer (1 ml) auf Eis, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen. HINWEIS: Um den gleichen nicht-kommerziellen Puffer vorzubereiten, lösen Sie 8,02 g NH4Cl, 1 g KHCO3 und 37,2 mg Na2EDTA in 1 L h2 O auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4 ein. Bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	<li>Kulturmedium: Hinzufügen von 50 ng/ml Stammzellfaktor (SCF) und 50 ng/ml Thrombopoietin (TPO) zum serumfreien Medium für Kultur und Expansion hämatopoetischer Zellen (siehe Tabelle material für kommerzielles Medium empfohlen).</li>
	<li>TMRM-Lagerlösung: Bereiten Sie die TMRM-Lösung (1 m) vor, indem Sie 5 g TMRM-Pulver in 10 ml Ethanol auflösen. Bewahren Sie diese Lösung bei -20 °C vor dem Licht schutzfrei auf.</li>
	<li>Verapamil-Lagerlösung: Bereiten Sie Verapamil (50 mM) Lösung vor, indem Sie 24 mg Verapamil in 1 ml Ethanol verdünnen. Bewahren Sie diese Lösung bei -20 °C auf.</li>
	<li>FCCP-Lagerlösung: Bereiten Sie carbonilcyanid p-Triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) Lösung vor, indem Sie 254 mg in 1 ml Ethanol auflösen. Bewahren Sie diese Lösung bei -20 °C vor dem Licht schutzfrei auf.</li>
</ol>2. Knochenmarkisolierung
<ol><li>Euthanisieren Sie die Maus durch CO2-Inhalation nach institutionellen Richtlinien und sprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol. HINWEIS: Dieser Schritt verhindert eine Kontamination der gefährdeten Zellen, ohne die experimentellen Ergebnisse zu beeinträchtigen.</li>
	<li>Mit einem Paar Zange und scharfe Schere, machen Sie einen kleinen Schnipsen in der ventralen Haut der Maus und dehnen Sie die Haut.</li>
	<li>Extrahieren Sie den Oberschenkelknochen und Tibia, während Sie darauf achten, die Köpfe des Oberschenkelknochens nicht zu vertreiben, da sie eine große Menge an Knochenmarkzellen enthalten. Legen Sie die entfernten Knochen in eine 6-Well-Platte, gefüllt mit 1,5 ml Färbepuffer. HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert keinen sterilen Bereich.</li>
	<li>Entfernen Sie die Muskeln aus den Knochen und schneiden Sie die Enden der Knochen, so dass der Ausgang des Knochenmarks (Abbildung 1A). Legen Sie die gereinigten Knochen in neue Brunnen mit 1,5 ml Färbepuffer. HINWEIS: Muskeln und andere Gewebe müssen sorgfältig entfernt werden, um spritzenverstopfen im nächsten Schritt zu vermeiden.</li>
	<li>Spülen Sie das Knochenmark mit einer 3 ml Spritze mit einer 25 G Nadel aus. HINWEIS: Spülen Sie das Knochenmark weiter, bis der Knochen weiß wird (Abbildung 1B).</li>
	<li>Sammeln Sie alle Zellen in einem 1,5 ml Rohr, Zentrifuge für 5 min bei 180 x g dann entsorgen Sie den Überstand (Abbildung 1C).</li>
	<li>Das Pellet in 300 l eiskalten ACK-Lysing-Puffer sehr sorgfältig aufsetzen, 1 min auf Eis legen und sofort inaktive Lyse durch Zugabe von 1 ml Färbepuffer. Zentrifuge für 5 min bei 180 x g. HINWEIS: Das Zellpellet erscheint weiß (Abbildung 1D). Die Gesamtzahl der isolierten Zellen beträgt etwa 2-4 x 107.</li>
	<li>Setzen Sie die Pellets in 1 ml Färbepuffer wieder auf und filtern Sie mit einer Zell-Siebkappe (12 x 75 mm2, 5 ml Kapazität) mit einem 35 m Sm Nylongewebe, das zur Gewinnung mononukleistischer Zellen eingebaut ist. Nach dem Blockieren die Probe auf Eis halten.</li>
</ol>3. Immunostainierung zur Detektion von HSC
<ol><li>Bereiten Sie Lineage (Lin) Cocktail. In 400 l Desfärbepuffers 4 l der folgenden biotinilierten Antikörper gegen CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM und Il7Ra hinzufügen, um eine endgültige Verdünnung 1:100 zu erhalten.</li>
	<li>Vorbereiten von fluorophoren konjugierten Antikörpern (Abs). In 400 l DesFärbepuffers 4 l der folgenden Abs hinzufügen, um eine endgültige Verdünnung 1:100 zu erhalten. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 und CD34-FITC. Im Eis aufbewahren, vor Licht geschützt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 180 x g, dann entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 400 L L Lin-Cocktail-Lösung zu den Zellen Pellet. Fügen Sie 4 L CD135-biotinilierten Ab. Vortex schnell zu mischen und für 30 min in Eis zu brüten.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe mit 3 ml Färbepuffer, drehen Sie sie 5 min bei 180 x g nach unten und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 400 L Abs-Lösung hinzu. Wirbel schnell zu mischen und inkubieren für 30 min auf Eis.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben mit 3 ml Färbepuffer, drehen Sie sie 5 min bei 180 x g herunter und entsorgen Sie den Überstand.</li>
</ol>4. TMRM Färbung
<ol><li>Bereiten Sie die TMRM-Färbelösung vor. Fügen Sie 2,2 l TMRM-Stammlösung und 1,1 l Verapamil (2 nM bzw. 50 m als Endkonzentration) in 1,1 ml serumfreiem Medium für die Kultur und Expansion hämatopoetischer Zellen (siehe Tabelle des Materials für kommerzielles Medium empfohlen) mit TPO hinzu. und SCF. HINWEIS: Dies ist der wichtigste Schritt des Protokolls. Verapamil Addition ist notwendig, um die Efflux-Pumpen zu blockieren, die stark in den HSCs exprimiert werden und TMRM extrudieren können.</li>
	<li>Das Knochenmark in 1 ml TMRM-Färbelösung wieder aufsetzen, schnell wirbeln und 1 h bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: TMRM-Färbung darf nicht ausgewaschen werden. Die PE-dedicated Compensation Control wird auch in 100 l TMRM-Färbungslösung resuspendiert und nach schnellem Wirbel für 1 h bei 37 °C inkubiert.</li>
	<li>Filtern Sie die Probe mit einer Zell-Siebkappe (12 x 75 mm2, 5 ml Kapazität) mit einem 35 m Nylongewebe eingebaut, um eine Verstopfung des Durchflusszytometers zu vermeiden. HINWEIS: TMRM-Färbung erhöht die Möglichkeit der Verstopftenbildung in der Probe. Die Filtration der Probe kurz vor flow assays wird empfohlen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 l von 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) hinzu, um abgestorbene Zellen durch Durchflusszytometrie auszuschließen.</li>
</ol>5. Erfassung durch Flow Cytometer
<ol><li>Führen Sie eine Knochenmarkprobe aus und erfassen Sie mindestens 1 x 106 Ereignisse.</li>
	<li>
Richten Sie die Gating-Strategie ein, um die verschiedenen hämatopoetischen Populationen zu identifizieren (Abbildung 2).
	<ol>
<li>Zeigen Sie lebende Knochenmark-Mono-Kernzellen (BM-MNCs), DAPI- Fraktion, im Diagramm für Pacific Blue an, um CD135-Lin- (Lin)und Lin+ Brüche zu identifizieren. </li>
		<li>Plot Lin- Fraktion für APC/Cy7 (c-kit) versus PE/Cy7 (Sca-1) zur Identifizierung multipotenter Vorläufer (MPP) Fraktion, als c-Kit+ und Sca-1+.</li>
		<li>Plot MPP-Fraktion für APC (CD48) im Vergleich zu PerCP/Cy5.5 (CD150), um HSC-Fraktion zu identifizieren, als CD150+ und CD48.</li>
		<li>Anzeige des HSC-Anteils für FITC (CD34), um CD34-HSCund CD34+-HSC zu teilen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erfassen Sie die TMRM-Intensität (PE-Kanal) in jeder Grundgesamtheit.</li>
	<li>Nach dem Erwerb zur Probe 1 l FCCP hinzufügen, um die Endkonzentration von 1 mM zu erhalten und bei 37 °C für 5 min zu inkubieren, dann 1 x 106 Ereignisse zu erwerben. HINWEIS: FCCP ist ein mitochondrialer Entkoppler, der verwendet wird, um die 'm zu zerstreuen. Es wird als experimentelle Kontrolle verwendet, um zu bestätigen, dass TMRM Färbung richtig funktioniert. Nach der Verabreichung von FCCP sollte die TMRM-Intensität drastisch verringert werden (Abbildung 3A).</li>
	<li>Analysieren Sie Daten, die die durchschnittliche Intensität von PE jeder Population durch die Intensität von PE aller BM-MNCs normalisieren.</li>
</ol>

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<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die mitochondriale Membranpotentialmessung ist ein Eckpfeiler der Analyse und Bewertung von Mitochondrien, die für den Stoffwechselzustand der Zelle entscheidend sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse von M durch TMRM-Färbung. TMRM ist ein zellpermeant Fluoreszenzfarbstoff, der sich in aktiven Mitochondrien aufgrund von m ansammelt, und seine jeweiligen Werte bleiben im Gleichgewicht zwischen den extrazellulären, zytoplasmatischen und mitochondrialen Kompartimenten10. Dieses Protokol...

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind sich selbst erneuernd, multipotent und in der Lage, alle Zellen des Blutes1,2zu entsteht. Der Zellstoffwechsel ist ein wichtiger Regulator der HSC-Wartung, zusammen mit Transkriptionsfaktoren, intrinsischen Signalen und der Mikroumgebung3,4,5. Die richtige Kontrolle der mitochondrialen Funktion und Qualität ist daher entscheidend für die HSC-Wartung6,7.
Mitochondriales Membranpotential ist ein wichtiger Parameter bei der Beurteilung von Mitochondrien, da sie direkt ihre Funktionalität widerspiegelt, die sich aus dem Gleichgewicht der Protonenpumpaktivität in der Elektronentransportkette und des Protonenflusses durch F ergibt. 1/FO ATP-Synthase. Diese sind beide (abhängig von der Genexpression und substratverfügbarkeit) für die sauerstoffabhängige Phosphorylierung von ADP zu ATP8,9erforderlich. Unter Ausnutzung der Elektronegativität des mitochondrialen Fachs wurden verschiedene potentiometrische Farbstoffe entwickelt, um die Messung von m zu messen. Eines davon ist Tetramethylrhodinmethylesterperchlorat (TMRM), das ausgiebig verwendet wurde, um die Durchflusszytometrie in einer Vielzahl von Zellen10zu messen, einschließlich hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen11.
Mitochondriale Farbstoffe müssen jedoch mit einer gewissen Vorsicht in HSCs verwendet werden, da die hohe Aktivität der xenobiotischen Efflux-Pumpen dieser Zellen zu Farbstoffextrusion führen kann12. Tatsächlich hat die Extrusion von mitochondrialen Farbstoffen wie Rhodamine 123 es Forschern ermöglicht, HSCs13 zu isolieren oder HSC-"Seitenpopulationen" zu identifizieren, indem sie die Differentialextrusion der Farbstoffe Hoechst Blue und Hoechst Red14 ausnutzen. 15. Es hat sich auch gezeigt, dass Fumitremorgin C, ein spezifischer Blocker des ATP-bindenden Kassetten-Unterfamilien-Unterfamilien-G-Mitglieds-2 (ABCG2)-Transporters, das Färbemuster von MitoTracker in HSPCs16nicht beeinflusst. Nach der Veröffentlichung dieser Ergebnisse wurden mehrere Studien mit mitochondrialen Farbstoffen in Abwesenheit von xenobiotischen Efflux-Pumpeninhibitoren durchgeführt, was zu dem weit verbreiteten Eindruck führte, dass HSCs nur eine geringe Anzahl von Mitochondrien mit niedrigem , 17 , 18.
Kürzlich wurde jedoch nachgewiesen, dass Verapamil, ein Breitspektrum-Inhibitor von Efflux-Pumpen, das Färbemuster des mitochondrialen Farbstoffs MitoTracker Green19signifikant verändert. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass Fumitremorgin C sehr selektiv für Abcg2 ist, während HSCs auch andere Transporter wie Abcb1a (das nur schwach empfindlich auf Fumitremorgin C)19ausdrückt. Wir haben auch berichtet, dass andere mitochondriale Farbstoffe, wie TMRM, Nonyl-Akridin-Orange und Mitotracker Orange (MTO) die gleichen Muster wie Mitotracker Green aufweisen. Noch wichtiger ist, dass wir beobachtet haben, dass die zytometrischen Strömungsmuster von HSPCs zusätzlich zu der mitochondrialen Masse11ihre M widerspiegeln.
Die Aufnahme von TMRM-Farbstoff hängt streng von der negativen Ladung von Mitochondrien ab, aber die resultierende Ansammlung von Farbstoff ist in einem konstanten Gleichgewicht zwischen seiner Aufnahme und Clearance durch Effluxpumpen20. Der Unterschied in der xenobiotischen Efflux-Pumpenexpression zwischen HSCs und reifen Zellpopulationen wirkt sich auf dieses Gleichgewicht aus und kann zu verzerrten Ergebnissen führen. Die Verwendung von speziellen Inhibitoren wie Verapamil sollte bei der Analyse von 'm durch potentiometrische Farbstoffe berücksichtigt werden. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zur genauen Messung durch TMRM-basierte Durchflusszytometrie, das die xenobiotische Transportaktivität durch den Einsatz spezieller Inhibitoren korrigiert.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing Puffer</td><td>Life Technologies</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD3e-Biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-0031-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-Biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553309</td><td></td></tr><tr><td>CD19-Biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>CD48-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0481-82</td><td></td></tr><tr><td>CD135-Biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-PerCP/Cy5.5&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>115922</td><td></td></tr><tr><td>c-kit-APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Cyclosporin H</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1575-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Lösung (1 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gr1-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>IgM-Biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-5790-85</td><td></td></tr><tr><td>Il7R&alpha;-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td></td></tr><tr><td>Nk1.1-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sca-1-PE/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-81</td><td></td></tr><tr><td>SCF murin</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03-10UG</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM Medium</td><td>STEMCELL technologies</td><td>9605</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Pacific Blue</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-Biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553672</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5428-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>315-14-10UG</td><td></td></tr><tr><td>Verapamilhydrochlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>V4629-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

verbesserung der genauigkeit der zytometrischen bewertung des mitochondrialen membranpotenzials in hämatopoetischen stamm- und vorläuferzellen durch die hemmung von efflux-pumpen

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Da der Zellstoffwechsel ein wichtiger Regulator der hämatopoetischen Stammzell-Selbsterneuerung (HSC) ist, wurden die verschiedenen Rollen, die die Mitochondrien bei der hämatopoetischen Homöostase spielen, von HSC-Forschern ausgiebig untersucht. Die mitochondrialen Aktivitätsniveaus spiegeln sich in ihren Membranpotentialen wider, die durch zellpermeant kationische Farbstoffe wie TMRM (Tetramethylrhodamin, Methylester) gemessen werden können. Die Fähigkeit von Effluxpumpen, diese Farbstoffe aus Zellen zu extrudieren, kann jedoch ihre Nützlichkeit einschränken. Die resultierende Messverzerrung ist besonders kritisch bei der Beurteilung von HSCs, da xenobiotische Transporter in HSCs eine höhere Expression und Aktivität aufweisen als in differenzierten Zellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Verapamil, einen Efflux-Pumpeninhibitor, verwendet, um mehrere Knochenmarkpopulationen genau zu messen. Die daraus resultierende Hemmung der Pumpenaktivität erhöht nachweislich die TMRM-Intensität in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), während sie in reifen Fraktionen relativ unverändert bleibt. Dies unterstreicht die Aufmerksamkeit auf die Farb-Efflux-Aktivität, die erforderlich ist, wenn m-abhängige Farbstoffe verwendet werden, und wie geschrieben und visualisiert, kann dieses Protokoll verwendet werden, um entweder verschiedene Populationen innerhalb des Knochenmarks oder die gleiche Population genau zu vergleichen. über verschiedene experimentelle Modelle hinweg.

Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die einfache Isolierung von BM-MNCs von einem Mausmodell. Abbildung 1 fasst die wichtigsten Schritte des Protokolls zusammen: Knochenisolierung, Ausspülen aus dem Knochenmark, Rote Blutzelllyse und Antikörperfärbung gefolgt von TMRM-Färbung zur Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in einer bestimmten hämatopoetischen Population .
BM-MNCs enthalten mehrere Zellpopulationen, einschließlich HSCs. Die in diesem Proto...

Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Die mitochondriale Funktion ist entscheidend für die hämatopoetische Stammzell-Selbsterneuerung. Mitochondrienaktivität ist ein Reflektor des inneren mitochondrialen Membranpotentials, das mit TMRM, einem zellfluoreszierenden, zellpermeant kationischen Farbstoff, gemessen werden kann. Xenobiotische Efflux-Pumpen sind in HSC sehr aktiv und verursachen TMRM-Extrusion.Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Korrektur dieses Effekts, wobei Verapamil, ein Inhibitor der Effluxpumpen, verwendet wird. Beginnen Sie mit der Isolierung des Knochenmarks von Denfemuren der Maus. Verwenden Sie ein Paar Zangen und scharfe Schere, um die beiden hinteren Pfoten zu schneiden.Dann machen Sie einen kleinen Schnipsel in der ventralen Haut der Maus, und dehnen Sie es. Extrahieren Sie den Oberschenkelknochen und die Tibia, wobei Sie darauf achten, die Köpfe des Oberschenkelknochens nicht zu lösen, und legen Sie die Knochen in eine Sechs-Brunnen-Platte, gefüllt mit 1,5 Milliliter Färbepuffer. Entfernen Sie die Muskeln aus den Knochen, und schneiden Sie die Enden der Knochen, so dass Knochenmark zu verlassen.Legen Sie die gereinigten Knochen in neue Brunnen, mit 1,5 Milliliter Nstrich. Dann spülen Sie das Knochenmark mit einer Drei-Milliliter-Spritze und einer 25-Meter-Nadel aus, bis der Knochen weiß wird. Sammeln Sie alle Zellen in einem 1,5 Milliliter-Rohr, und zentrifugieren Sie sie für fünf Minuten bei 180 mal G, dann entsorgen Sie den Überstand.Das Pellet vorsichtig in 300 Mikrolitere eiskaltem ACK-Lysing-Puffer aussetzen und die Zellen für eine Minute auf Eis legen. Deaktivieren Sie dann sofort die Lyse, indem Sie einen Milliliter Färbepuffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 180-fachg. G.Resuspend das Zellpellet, das weiß erscheinen sollte, in einem Milliliter Färbepuffer.Filtern Sie die Zellen mit einer Zellsiebkappe mit einem 35 Mikrometer Nylongewebe, um mononukleäre Zellen zu erhalten. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Linie Cocktail, und Fluorophor konjugierte Antikörper, nach Manuskript Richtungen. Bewahren Sie die Antikörper auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht.Zentrifugieren Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 180 mal G und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 400 Mikroliter des Lineage-Cocktails und vier Mikroliter CD135-Biotinyl-Antikörper in das Zellpellet und wirbeln Sie die Mischung aus. Dann inkubieren Sie es auf Eis für 30 Minuten.Waschen Sie die Probe nach der Inkubation, indem Sie drei Milliliter Färbepuffer hinzufügen, sie fünf Minuten bei 180 mal G nach unten drehen und den Überstand entsorgen. Dann 400 Mikroliter Antikörperlösung hinzufügen und die Mischung wirbeln. Bebrüte es noch 30 Minuten auf Eis und die Wäsche mit dem Färbepuffer wiederholen.Um die TMRM-Färbelösung vorzubereiten, fügen Sie 2,2 Mikroliter TMRM-Stammlösung und 1,1 Mikroliter Verapamil zu 1,1 Milliliter serumfreies hämatopoetisches Kulturmedium mit Thrombopoietin und Stammzellfaktor hinzu. Setzen Sie das Knochenmark in einem Milliliter der TMRM-Färbelösung wieder auf, wirbeln Sie schnell aus und brüten Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Filtern Sie die Probe mit einer Zellsiebkappe mit einem 35 Mikrometer Nylongewebe, um eine Verstopfung des Durchflusszytometers zu vermeiden.Fügen Sie dann einen Mikroliter DAPI hinzu und fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort. Führen Sie die Knochenmarkprobe aus, und erfassen Sie mindestens eine Million Ereignisse. Zeigen Sie dann die lebenden Knochenmark-Mononuklezellen in einem Diagramm für pazifisches Blau an, um CD135 Lin-negative und Lin-positive Fraktionen zu identifizieren.Plotten Sie die Lin-negative Fraktion für APC/Cy7 im Vergleich zu PE/Cy7, um den multipotenten Vorläufer oder mPP-Anteil zu identifizieren. Zeichnen Sie dann die MPP-Fraktion für APC versus PerCP/Cy5.5, um die hämatopoetische Stammzelle oder HSC-Fraktion zu identifizieren. Zeigen Sie den HSC-Anteil für FITC oder CD34 an, um ihn in CD34-negative HSC- und CD34-positive HSC-Fraktionen aufzuteilen.Schließlich erwerben Sie die TMRM-Intensität in jeder Population. Um sicherzustellen, dass die TMRM-Färbung korrekt funktioniert, fügen Sie der Probe einen Mikroliter FCCP für eine Endkonzentration von einem Millimolar hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Dann erwerben Sie eine Million Ereignisse.Nach der FCCP-Zugabe sollte die TMRM-Intensität drastisch erhöht werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um das mitochondriale Membranpotenzial in verschiedenen Zellpopulationen mit TMRM-Farbstoff zu quantifizieren. Es wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von PBS und FBS im Kulturmedium die TMRM-Signalintensität beeinflusst.Daher ist es wichtig, TMRM Färbung in serumfreien Expansionsmedium durchzuführen. Hämatopoetische Stammzellen drücken hohe Aktivitätsniveaus von xenobiotischen Effluxpumpen aus, die TMRM-Farbstoff extrudieren. So variieren TMRM Profile auch in Gegenwart von Verapamil oder Cyclosporin H, die die Pumpen blockieren.Um die Genauigkeit der TMRM-Färbung zu überprüfen, kann FCCP die Mitochondrien depolarisieren und die TMRM-Intensität reduzieren. Dieses Protokoll kann leicht für das Studium von HSC mit einem anderen mitochondrialen Membranpotentialfarbstoff, einschließlich TMRE oder JC-1, angepasst werden. Ebenso wie andere mitochondriale Farbstoffe wie MitoTracker oder MitoSOX.Die kritischen Probleme, die durch die unterschiedliche Aktivität von Efflux-Pumpen unter der Knochenmarkpopulation geerbt wurden, wurden erst vor kurzem aufgezeigt. Dieses Protokoll zielt daher darauf ab, die Diskrepanz zwischen früheren Erkenntnissen zu verringern.

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Biology

Biologie

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die JC-1 Farbstoff verwendet, um die Mitochondrien-Membran-Potential der Zellen beurteilen nach Hypoxie/flussbettfilters mit oder ohne einem Schutzmittel ausgesetzt wird.

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

Die metabolische Anpassung ist für T-Zellen von grundlegender Bedeutung, da sie Differenzierung, Persistenz und Zytotoxizität bestimmt. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Überwachung der mitochondrialen Atmung in ex vivo Zytokin-differenzierten humanen primären T-Zellen vorgestellt.

Echtzeitüberwachung der mitochondrialen Atmung in zytokindifferenzierten humanen primären T-Zellen

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

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In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

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Diese Technik beschreibt einen effektiven Arbeitsablauf zur Visualisierung und quantitativen Messung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels in HeLa-Zellen mittels fluoreszenzbasierter Live-Bildgebung.

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Die Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik unter physiologisch relevanten Substratkonzentrationen in Immunzellen sind begrenzt. Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das hochauflösende Fluorespirometrie verwendet, um Veränderungen in der Reaktion des mitochondrialen Membranpotentials auf den Energiebedarf in menschlichen T-Zellen, Monozyten und peripheren mononukleären Zellen zu bewerten.

Hochauflösende Fluorespirometrie zur Beurteilung dynamischer Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials in menschlichen Immunzellen

Lernen Sie eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen mittels Durchflusszytometrie. Die Hemmung von Efflux-Pumpen mit Verapamil ermöglicht präzise TMRM-basierte Quantifizierungen.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen (Video) | JoVE Journal

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

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