Name: Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Lernen Sie die Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch-Telencephalon. Diese Technik ermöglicht die effiziente Markierung einzelner Ependymogliazellen für Langzeitbeobachtungen.

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Besonderer Dank geht an James Copti für die Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken auch der Finanzierung von JN durch die Deutsche Forschungsstiftung (DFG) durch die SFB 870 und SPP "Integrative Analyse der Olfaction" und SPP 1738 "Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plastizität & disease", SPP1757 " Glial heterogenity" und Exzellenzstrategie im Rahmen des Munich Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Alle in diesem Protokoll verwendeten Tiere wurden unter Standardhaltungsbedingungen gehalten, und die Versuche wurden gemäß den Handhabungsrichtlinien und -vorschriften der EU und der Regierung von Oberbayern durchgeführt (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. Herstellung von Plasmidmischung zur Elektroporation
<ol><li>Verdünnen Sie das Plasmid von Interesse an sterilem Wasser und fügen Sie schnelle grüne Fleckenstammlösung [1 mg/ml] hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration des Plasmids 1 g/l beträgt. Fügen Sie den Fleck mit einer Konzentration von nicht mehr als 3% hinzu, da der einzige Zweck darin besteht, die Lösung zu färben und die ventrikuläre Injektion zu visualisieren.</li>
	<li>Nach der Herstellung die Plasmidlösung mischen, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen oder mit dem Finger tippen. Lagern Sie bei Raumtemperatur (RT) bis zur Nutzung. HINWEIS: Für die Ko-Elektroporation von zwei Plasmiden in dieselbe Zelle stellen Sie sicher, dass die Konzentration jedes einzelnen Plasmids, das in der Mischung verwendet wird, mindestens 0,8 ng/l mit einem Molverhältnis von 1:1 beträgt, um eine Co-Elektroporationseffizienz von 80 %–90 % zu erzielen.</li>
</ol>2. Vorbereitungen für Injektions- und Elektroporationsverfahren
<ol><li>Bereiten Sie die Glaskapillaren (Außendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser 0,58 mm) vor, die für die Injektion in das Nadelzuggerät erforderlich sind.</li>
	<li>Um die richtige Menge an Plasmid zu injizieren (siehe oben), ziehen Sie die Kapillare bei einer Temperatur von 68,5 °C mit zwei leichten und zwei schweren Gewichten (siehe Tabelle der Materialien für Abzieherspezifikationen). HINWEIS: Falls ein anderer Abzieher verwendet wird, kalibrieren Sie die Kapillare, um das entsprechende Volumen der Elektroporation zu liefern.</li>
	<li>Stellen Sie die Einspritzvorrichtung manuell auf einen Einspritzdruck von 200 hPa (durch Drehen des Pi-Reglers) und einen konstanten Druck von 0 hPa ein. Stellen Sie die Einspritzzeit manuell auf den manuellen Modus ein und steuern Sie den Druck mit dem Fußpedal.</li>
	<li>Stellen Sie das Elektroporationsgerät mit fünf Impulsen bei 54–57 V (je 25 ms mit 1 s Intervallen) auf "LV-Modus" ein. Schließen Sie die Elektroden an das Gerät an.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Fischtank mit sauberem Fischwasser vor, wo die Fische nach dem Elektroporationsverfahren aus der Anästhesie geweckt werden. Belüften Sie das Wasser, indem Sie den Luftstein während der gesamten Erholungsphase an der Luftpumpe befestigen, bis der Fisch vollständig erwacht ist.</li>
	<li>Nehmen Sie einen normalen Küchenschwamm und machen Sie einen Längsschnitt in den Schwamm, um Fische während des Injektions- und Elektroporationsvorgangs zu halten (siehe vorherige Veröffentlichung3). HINWEIS: Der Küchenschwamm sollte regelmäßig gewaschen oder ausgetauscht werden, um mögliche giftige Chemikalien zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie eine kleine Menge hochleitfähiges Mehrzweck-Ultraschallgel neben das Injektions- und Elektroporations-Setup. HINWEIS: Dadurch wird eine angemessene elektrische Leitfähigkeit und damit die Verteilung der elektropoierten Zellen über das gesamte Telencephalon gewährleistet.</li>
</ol>3. Zebrafisch Anästhesie
<ol><li>Vor der Anästhesisierung eine Anästhesielösung mit 0,2% MS222 in destilliertem Wasser vorbereiten und den pH-Wert mit Tris-HCl-Puffer auf 7 einstellen. Verdünnen Sie diesen Bestand 1:10 (d.h. auf 0,02% MS222) mit Fischwasser.</li>
	<li>Anästhesisieren Sie die Fische, indem Sie sie in dieser Arbeitslösung halten, bis die Bewegung des Körpers und der Kiemen nachlässt (in der Regel für ein paar Minuten).</li>
</ol>4. Plasmid-Lösungsinjektion
<ol><li>Füllen Sie die vorbereitete Glaskapillare mit 10 L Plasmidlösung mit Mikroladerspitzen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen innerhalb der Kapillare.</li>
	<li>Drücken Sie Menü/Änderungskapillare am Injektionsgerät. Setzen Sie die Nadel ein und befesten Sie sie.</li>
	<li>Unter einem Stereomikroskop mit einer Vergrößerung von 3,2x oder 4x nur die Spitze der Kapillare mit feinen Enden schneiden. Schalten Sie die Injektionsvorrichtung aus dem Kapillarmodus ändern in den Inject-Modus, und drücken Sie dann mit einem Fußpedal, um sicherzustellen, dass die Plasmidlösung leicht aus der Nadel herausläuft und ungehindert.</li>
	<li>Den Fisch aus dem Haltungsbehälter mit Anästhesielösung in den Behälter (Kunststoffbox) geben. Warten Sie einige Minuten, bis die Bewegung der Kiemen nachlässt.</li>
	<li>Legen Sie den Fisch in den vorbenetzten Schwamm mit der dorsalen Seite nach oben. Führen Sie alle folgenden Injektionsschritte unter dem Stereomikroskop durch, um die Genauigkeit des Verfahrens zu gewährleisten.</li>
	<li>Mit einem sezierenden Mikromesser aus Edelstahl mit 40 mm Schneide und 0,5 mm Dicke, schaffen Sie ein kleines Loch im Fischschädel an der hinteren Seite des Telencephalons (Abbildung 1B), direkt neben der Grenze mit optischem Tectum. HINWEIS: Dieser Schritt sollte sorgfältig durchgeführt werden, da das Loch sehr klein und oberflächlich sein sollte, nur in den Schädel eindringen, um Hirnschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Neigen Sie den Fisch nach Bedarf und richten Sie die Spitze der Glaskapillare in den richtigen Winkel, um das Eindringen der Kapillarspitze durch das Loch zu erleichtern.</li>
	<li>Legen Sie die Spitze der Kapillare vorsichtig durch das Loch in den Schädel, bis er die telenzephalische Herzkammer erreicht (siehe Abbildung 1B). Dies erfordert das Eindringen durch die dorsale ependymale Zellschicht. Achten Sie besonders darauf, die Kapillare nicht zu tief einzufügen, um den Kontakt mit dem Hirngewebe zu vermeiden. Halten Sie die Kapillare genau zwischen den Hemisphären und bleiben Sie innerhalb der Herzkammer, kurz nachdem sie die dorsale ependymale Schicht durchbohrt hat. HINWEIS: Das ist ein sehr heikler Schritt. Die Genauigkeit dieses Verfahrens wird durch Pigmentierung mutierte Linien wie messingy24verbessert, so dass eine bessere Visualisierung der Glaskapillarposition während der Injektion.</li>
	<li>Mit der Kapillarspitze im Inneren des Ventrikels, injizieren Sie die Plasmidlösung, indem Sie Druck mit dem Fußpedal für ca. 10 s, was etwa 1 l Plasmidlösung entspricht. HINWEIS: Beim Wechsel des Nadelziehers, der Kapillaren oder des Injektors sollte das System kalibriert werden, um immer eine Plasmidlösung von 1 L zu liefern. Die Kalibrierung kann durchgeführt werden, indem der Durchmesser des in ein Mineralöl ausgestoßenen Plasmidtröpfchens (z. B. Paraffinöl) gemessen und anschließend das Volumen des Tröpfchens berechnet wird. Nach 10 s Injektion sollte in das Mineralöl 1 L Plasmidflüssigkeit ausgestoßen werden.</li>
	<li>Bestätigen Sie den Erfolg des vorherigen Schritts, indem Sie die Ausbreitung der Flüssigkeit im gesamten Ventrikel beobachten.</li>
</ol>5. Elektroporation
<ol><li>Entfernen Sie den Fisch aus dem Injektionssetup, während Sie ihn noch im Schwamm halten.</li>
	<li>Tauchen Sie die Innenseite der Spitze der Elektroden in das Ultraschallgel ein.</li>
	<li>Bedecken Sie den Fisch Telencephalon mit einer kleinen Menge Ultraschallgel.</li>
	<li>Positionieren Sie den Fischkopf zwischen den Elektroden, platzieren Sie die positive Elektrode an der ventralen Seite des Fischkopfes und die negative Elektrode auf der dorsalen Seite(Abbildung 1C), während Sie den Körper des Fisches noch im Schwamm halten. Dadurch wird die Strömungsrichtung des Stroms festgelegt, der erforderlich ist, um Ependymoglia in der subventrikulären Zone zu elektroporatieren.</li>
	<li>Drücken Sie die Elektroden vorsichtig und präzise gegen das Telencephalon (Abbildung 1C). Den Strom mit dem Fußpedal abstellen. Halten Sie die Elektroden an Ort und Stelle, bis alle fünf Impulse fertig sind.</li>
</ol>6. Fischrückgewinnung
<ol><li>Lassen Sie die Fische im zuvor vorbereiteten, kontinuierlich belüfteten Tank erholen, bis er aufwacht. Lidocain-Gel könnte auf den Schädel aufgetragen werden, um eventuell entwickelte Schmerzen zu lindern.</li>
</ol>

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</ol>

Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Elektroporationsprotokoll ist eine zuverlässige In-vivo-Methode zur Kennzeichnung einzelner ependymotaler Zellen. Das Protokoll kann eine weitere Anpassung benötigen, um andere Zelltypen wie Neuronen oder Oligodendrozyten zu kennzeichnen. Um eine erfolgreiche Kennzeichnung zu erreichen, können Plasmide verwendet werden, die verschiedene Promotoren enthalten. Chicken-beta Actin Promoter, eF1alpha, CMV und Ubiquitin Promoter wurden zuvor verwendet, um die Expression von verschiedenen Transgenen in Ependymoglia und i...

Zebrafische sind ausgezeichnete Tiermodelle, um die Hirnregeneration nach einer Stichwunde zu untersuchen. Im Vergleich zu Säugetieren weisen auf der evolutionären Leiter weniger entwickelte Arten wie Zebrafische im Allgemeinen höhere Raten konstitutiver Neurogenese und breitere Bereiche des aufenthaltes von adulten neuronalen Stammzellen auf, was zu einer konstanten Erzeugung neuer Neuronen im gesamten die meisten Hirnbereiche im Erwachsenenleben. Diese Funktion scheint mit deutlich höheren Regenerationsfähigkeit von Zebrafischen im Vergleich zu Säugetieren1korrelieren, da Zebrafische ein bemerkenswertes Potenzial haben, in den meisten untersuchten Hirnverletzungsmodellen effizient neue Neuronen zu erzeugen2, 3,4,5,6,7,8. Hier wird der Zebrafisch Telencephalon untersucht, da es sich um ein Hirngebiet mit prominenter Neurogenese im Erwachsenenalter handelt. Diese Zonen der adulten Neurogenese sind homologe zu neurogenen Zonen im erwachsenen Säugetiergehirn9,10,11.
Reichlich neurogene Bereiche im Zebrafisch Telencephalon sind aufgrund der Existenz von radialen Glia wie Zellen oder Ependymoglia-Zellen vorhanden. Ependymogliade Zellen fungieren als ansässige adulte neuronale Stammzellen und sind verantwortlich für die Erzeugung neuer Neuronen sowohl im intakten als auch im regenerierenden Gehirn3,5. Lineage-Tracing-Experimente haben gezeigt, dass ventrikuläre Ependymoglia auf Verletzungen reagieren, sich dannvermehren und neue Neuroblasten erzeugen, die zur Läsionsstelle 5 wandern. Aufgrund der immerleten Natur von Zebrafischtelencephalon säumen ependymogliale Zellen die ventrikuläre Oberfläche und bauen die ventrale ventrikuläre Wand. Die dorsale ventrikuläre Wand wird durch eine dorsale ependymale Zellschicht gebildet (Abbildung 1A). Wichtig ist, dass Zebrafische ependymoglia die Eigenschaften sowohl der Radialglia als auch der ependymalen Zellen verkörpern. Lange radiale Prozesse sind ein typisches Merkmal von radialen Gliazellen, während Zellverlängerungen und enge Knoten (sowie ihre ventrikulären Positionen) typische Merkmale der ependymalen Zellen12,13,14sind. Daher werden diese Zellen als ependymogliade Zellen bezeichnet.
Um dem In-vivo-Verhalten einzelner ependymotgliaaler Zellen während der Regeneration zu folgen, müssen sie zuverlässig beschriftet werden. Verschiedene Methoden der In-vivo-Zellbeschriftung für die fluoreszierende Mikroskopie wurden bereits beschrieben, wie z. B. endogene Reporter oder lipophile Farbstoffe15. Diese Methoden können im Gegensatz zur Elektroporation längere Zeiträume erfordern und bieten oft nicht die Möglichkeit der Einzelzellkennzeichnung oder permanenten Langzeitverfolgung. Die Elektroporation bietet jedoch (neben der Einzelzellbeschriftung) die Möglichkeit, neue DNA in die Wirtszelle einzuführen. Darüber hinaus hat sich im Vergleich zu anderen Methoden der DNA-Übertragung in die Zellen gezeigt, dass die Elektroporation eine der effizientesten Methoden16,17,18,19ist.
Hier wird ein Elektroporationsprotokoll vorgestellt, das verfeinert wurde, um einzelne ependymogliale Zellen im erwachsenen Zebrafischtelencephalon zu kennzeichnen. Dieses Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einzelner ependyglialer Zellen, um ihnen über einen längeren Zeitraumvon 20 zu folgen oder bestimmte Wege zellautonom zu manipulieren21,22.

<table><tbody><tr><td>Reagenz/Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>Zum Färben der Plasmidlösung</td></tr><tr><td>MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>MS222 sollte bei RT (bis zu zwei Wochen) gelagert und vor Licht geschützt werden</td></tr><tr><td>Ultraschallgel</td><td>SignaGel, Parker Laboratories INC.</td><td>15-60</td><td>Elektroden Gel</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luftpumpe</td><td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td><td></td><td>Kann im Zoofachhandel gekauft</td></tr><tr><td>werden BTX Pinzetten Elektroden</td><td>Platinum Pinzetten, BTX Harvard Gerät</td><td>45-0486</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsgerät</td> mit 1 mm Durchmesser <td>BTX ECM830 Rechteck-Elektroporationssystem, BTX Harvard Gerät</td><td>45-0662</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsgerät</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td></td></tr><tr><td>Standard Wall Borosillicate Glas Kapillare</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0766</td><td>Modellnummer: G100-4</td></tr><tr><td>Microloader-Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micro-knife</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Mikromanipulator</td><td>Narishige Japan</td><td>MN - 151</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Nadelhalter wird zusammen mit der Injektionsvorrichtung</td></tr> geliefert <tr><td>Nadelzugvorrichtung</td><td>Narishige Japan</td><td>Modellnummer: PC-10</td><td>Der PC-10 wurde 2017 von Narishige eingestellt und durch die PC-100</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>633161</td><td></td></tr></tbody></table> ersetzt

elektroporationsmethode zur in-vivo-lieferung von plasmid-dna im erwachsenen zebrafisch telencephalon

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Elektroporation ist ein Transfektionsverfahren, bei dem ein elektrisches Feld auf Zellen angewendet wird, um temporäre Poren in einer Zellmembran zu erzeugen und ihre Durchlässigkeit zu erhöhen, wodurch verschiedene Moleküle in die Zelle eingeführt werden können. In diesem Papier wird Elektroporation verwendet, um Plasmide in ependymogliale Zellen einzuführen, die die ventrikuläre Zone des erwachsenen Zebrafischtelencephalons aussäumen. Ein Bruchteil dieser Zellen zeigt Stammzelleigenschaften und erzeugt neue Neuronen im Zebrafischgehirn; Daher ist es wichtig, ihr Verhalten zu untersuchen, um ihre Rolle bei der Neurogenese und Regeneration zu bestimmen. Die Einführung von Plasmiden über Elektroporation ermöglicht die langfristige Kennzeichnung und Verfolgung einer einzelnen ependymogliaalen Zelle. Darüber hinaus können Plasmide wie Cre recombinase oder Cas9 an einzelne ependymogliade Zellen abgegeben werden, was eine Genrekombination oder Genbearbeitung ermöglicht und eine einzigartige Gelegenheit bietet, die autonome Genfunktion der Zelle in einer kontrollierten, natürlichen umgebung. Schließlich wird dieses detaillierte, schrittweise Elektroporationsprotokoll verwendet, um eine erfolgreiche Einführung von Plasmiden in eine große Anzahl von einzelnen ependymogliaalen Zellen zu erhalten.

Die beschriebene Elektroporationsmethode ermöglicht die Abgabe von Plasmid-DNA in ependymogliale Zellen, die sich oberflächlich im Zebrafischtelencephalon und knapp unter der dorsalen ependymalen Zellschicht befinden (Abbildung 1A).
Wenn das Ergebnis der Elektroporation positiv ist, können markierte einzelne ependygliale Zellen (rote Zellen in Abbildung 2A,B) unter anderen ependymog...

Präsentiert wird hier eine Elektroporationsmethode für die Plasmid-DNA-Abgabe und ependymogliale Zellbeschriftung im erwachsenen Zebrafischtelencephalon. Dieses Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Visualisierung und Verfolgung einzelner ependymoglialer Zellen und eröffnet neue Möglichkeiten, Elektroporation auf eine breite Palette genetischer Manipulationen anzuwenden.

Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einzelner ependymogliale Zellen im ZebrafischTelencephalon, um ihre Langzeitüberwachung zu ermöglichen, sowie die Manipulation bestimmter Wege auf zellautonome Weise. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Einzelzellbeschriftung auf schnelle und effiziente Weise sowie die Genbearbeitung und Signalwegmanipulation auf zellautonome Weise ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung grundlegender zellbiologischer Fragen, z. B. zur Zelldelamination, zur Aufrechterhaltung der epitheliaalen Homöostase und zur Symmetrie der Zellteilung.Beginnen Sie mit einem Nadelziehgerät, um Glaskapillaren vorzubereiten. Verwenden Sie Mikrolader-Spitzen, um eine vorbereitete Glaskapillare mit zehn Mikrolitern Plasmidlösung zu füllen. Dann drücken Menü wechselkapillar"auf der Injektionsvorrichtung, damit die Nadel in den Nadelhalter geladen werden kann.Wechseln Sie dann die Injektionsvorrichtung von der Kapillare in den Injektionsmodus. Dann schneiden Sie mit einem Stereomikroskop mit vierfacher Vergrößerung und Einer Zange nur die Spitze der Kapillare. Dann drucke auf das Fußpedal, um zu bestätigen, dass die Plasmidlösungen problemlos aus der Nadel herauslaufen.Wenn die Nadel fertig ist, übertragen Sie einen Zebrafisch aus dem Haltungsbecken in einen Behälter mit Anästhesielösung. Und warten Sie ein paar Minuten, bis die Bewegung der Kiemen nachlässt. Drücken Sie die sedierte Fisch-Rückenseite auf einen vorbenetzten Schwamm unter dem Stereomikroskop und verwenden Sie ein Edelstahl-Sezierendes Mikromesser mit einer 40-Millimeter-Schneide und einer Dicke von 0,5 Millimetern, um vorsichtig ein kleines Loch im Fischschädel an der hinteren Seite des Telencephalons zu schaffen, direkt neben dem Rand des optischen Tektums.Neigen Sie den Fisch nach Bedarf und richten Sie die Spitze der Glaskapillare in den richtigen Winkel, um das Eindringen der Kapillarspitze durch das Loch zu erleichtern. Dann legen Sie die Spitze der Kapillare sehr vorsichtig durch die dorsale ependymale Zellschicht in das Loch ein, bis sie die telenzephalische Herzkammer erreicht, und drücken Sie das Fußpedal für etwa 10 Sekunden, um etwa 1 Mikroliter der Plasmidlösung zu liefern. Der Erfolg der Lieferung kann durch die Beobachtung der Ausbreitung der grünen Flüssigkeit im gesamten Ventrikel bestätigt werden.Bedecken Sie den Fisch Telencephalon mit einer kleinen Menge Ultraschallgel. Für die Elektroporation des Plasmid-injizierten Tieres, entfernen Sie den Schwamm aus dem Injektionsaufbau und tauchen Sie die Innenseite der Elektrospitzen in Ultraschallgel. Positionieren Sie den Fischkopf zwischen den Elektroden, mit der positiven Elektrode an der ventralen Seite des Kopfes und der negativen Elektrode auf der dorsalen Seite.Dann, während Sie noch den Körper des Fisches im Schwamm halten, drücken Sie die Elektroden sanft und präzise gegen das Telencephalon und verabreichen Sie den Strom mit dem Fußpedal, wobei die Elektroden an Ort und Stelle gehalten werden, bis alle fünf Impulse fertig sind. Wenn die Elektroporation erfolgreich ist, können Plasmid-markierte einzelne ependymogliaale Zellen unter den nicht-plasmidmarkierten ependymogliaalen Zellen beobachtet werden. Je nach Effizienz des Elektroporationsprozesses kann eine höhere oder geringere Anzahl von ependymogliaalen Zellen beschriftet werden.Dennoch ergibt das demonstrierte Protokoll eine höhere Anzahl von markierten Zellen als zuvor veröffentlichte Protokolle. Beachten Sie, dass die höchste Dichte der markierten Zellen meist an der inneren ventrikulären Seite beider Hemisphären entsteht, da sich die injizierte Plasmidflüssigkeit zwischen den Hemisphären verteilt. In diesem Video wird eine Hemisphäre des Zebrafischtelencephalons in 3D dargestellt, wo die ependymogliale Zellen mit Radioprozessen in Magenta sind, wenn sie von der Seite beobachtet werden.Durch Ko-Elektroporation mit einem anderen Plasmid, das Kerne etikettiert, kann die Zellteilung von ependymogliaalen Zellen beobachtet werden. Erfolglose Elektroporation führt zu einer sehr geringen Anzahl oder keine beschrifteten ependymogliaalen Zellen. Dorsale ependymale Zellen sind jedoch am ehesten beschriftet.Ihr Soma ist im Quader größer und sie besitzen keine radiolänglichen Prozesse, wie aus einer Seitenansicht der ependymoglialzelligen Zellschicht ersichtlich ist. tdTomato-mem-markierte Zellen sind höchstwahrscheinlich ependymale Zellen, die sich oberhalb der Schicht von Ependymoglia befinden. Im Gegensatz dazu führt die Einführung eines tdTomato-mem, das Plasmid in einzelne ependmyogliale Zellen ausdrückt, zusätzlich zur anfänglichen Zellbeschriftung zu einer tdTomato-mem-Expression.Die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, sind, nur die Spitze der Kapillare zu schneiden und die ependymale Schicht während der Injektion zu durchdringen, so dass sich die Flüssigkeit über den Ventrikel ausbreitet. Diese Technik ermöglicht die langzeitige Überwachung einzelner ependymotaler Zellen durch In-vivo-Bildgebung und damit die Etablierung ihrer Rolle bei der Regeneration des Gehirns sowie ihrer enormen genetischen In-vivo-Verbindung.

electroporation-method-for-vivo-delivery-plasmid-dna-adult-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Die zeitliche und räumliche Auflösung von genetischen Manipulationen bestimmt das Spektrum der biologischen Phänomene, die sie stören. Hier haben wir zeitlich und räumlich diskreten...

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Wir beschreiben ein Verfahren zur bedingten Knockdown die Expression eines Zielproteins im Erwachsenenalter Zebrafisch Flossenregeneration. Diese Technik beinhaltet Mikrospritzvorrichtung und Elektroporation Antisense-Oligonukleotid in Morpholinos Flossengewebes das Testen des Proteins Rolle in verschiedenen Stadien der Flossenregeneration, einschließlich Wundheilung, Blastembildung und regenerative Auswachsen ermöglicht.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Dieses Video beschreibt die in vivo Elektroporation, eine Technik zur DNA-Abgabe in Ependymogliazellen bei erwachsenen Zebrafischen.

im lebenden Organismus Elektroporation: Eine ortsspezifische Methode zur Transfektion von Zebrafischen

Dieses Video beschreibt die Technik der intramuskulären Injektion zur Abgabe von Verbindungen in die Rückenmuskulatur eines erwachsenen Zebrafisches.

Intramuskuläre (IM) Injektion: Verabreichung von Verbindungen in den Rückenmuskel eines erwachsenen Zebrafisches

In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Neurogenese und Regeneration adulter Zebrafische zu beleuchten, haben wir ein Protokoll für invasive Operationen entwickelt, die mechanische Verletzungen im adulten Telencephalon des Zebrafisches verursachen, und die anschließende Überwachung von Veränderungen in der gestochenen Hemisphäre durch Immunhistochemie oder in situ Hybridisierung.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Wir präsentieren Ihnen eine effiziente und einfach zu bedienende Protokoll für die Zubereitung von primären Zellkulturen von Zebrafisch-Embryonen zu Transfektion und live Cell Imaging sowie ein Protokoll Primärzellen von Erwachsenen Zebrafisch Gehirn vorzubereiten.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Impfung von der Erwachsenen Zebrabärbling (Danio Rerio) mit einem DNA-basierten Impfstoff und die Validierung einer erfolgreichen Impfung Veranstaltung zu demonstrieren. Diese Methode eignet sich für die präklinische Screening Impfstoffkandidaten in verschiedenen Infektionsmodelle.

Impfung von Erwachsenen Zebrafisch für die präklinische Screening von DNA-basierte Impfstoffe

Eine neue intraperitoneale (IP) Injektionsmethode bei adulten Zebrafischen wird beschrieben. Beim Umgang mit toxischen Verbindungen wie Doxorubicin ist dieses Verfahren wirksamer als die beiden bisher berichteten IP-Methoden. Die Technik ist so konzipiert, dass sie von Forschern mit begrenzter Erfahrung im Zebrafischmodell leicht übernommen werden kann.

Eine intraperitoneale Injektionstechnik bei erwachsenen Zebrafischen, die Körperschäden und die damit verbundene Mortalität minimiert

Lernen Sie die Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch-Telencephalon. Diese Technik ermöglicht die effiziente Markierung einzelner Ependymogliazellen für Langzeitbeobachtungen.

Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon

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