Mechanistische Einblicke in die Entwicklung von TNBS-vermittelter Darmfibrose und Bewertung der hemmenden Wirkungen von Rapamycin

Dieses Protokoll zeigt eine sehr vergleichbare Pathophysiologie von Morbus Crohns Fibrose beim Menschen und diskutiert auch die rapamycinvermittelten hemmenden Wirkungen auf Darmfibrose. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es die Entwicklung von Darmfibrose in sehr kurzer Zeit von vier bis acht Wochen beschreibt, was uns die Möglichkeit gibt, Gewebereparatur und Geweberegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll wird für Forscher hilfreich sein, die in Eile sind, um den Mechanismus der Fibrose zu bekommen, und helfen, eine bessere Technologie zu finden, um Interventionen für Morbus Crohns damit verbundene Darmfibrose vorherzusagen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, rasieren Sie erwachsene Mäuse um den Halsbereich, um sie über eine dermale Exposition auf TNBS vorzusensitieren. Dann einen Coton-Tupfer mit TNBS einweichen und auf den rasierten Bereich des Maushalses auftragen. Acht Tage nach der Sensibilisierung, induzieren Colitis durch intrarektale Verabreichung einmal pro Woche, für sechs Wochen.

Um dies zu tun, wenden Sie vier Milligramm TNBS in 25%Ethanol mit einem 100 Mikroliter Einlauf über eine Ein-Milliliter-Spritze an einer Stahlgavage-Nadel befestigt. Geben Sie Kontrollmäusen 100 Mikroliter nur 25% Ethanol. Nach der Anästhesisierung der Mäuse, intraperitoneal injizieren entweder Rapamycin bei zwei Milligramm pro Kilogramm pro Tag, oder ein Fahrzeug, oder beides, jeden Wochentag für drei bis sechs Wochen sowohl an die Kontrolle und TNBS behandelt Mäuse.

Danach verwenden Sie sechswöchigeTNBS postbehandelte Mäusedärme zur Analyse der extrazellulären Assays. Zuerst öffnen Sie den Dickdarm längs in eiskaltem HBSS und waschen Sie den Dickdarm in HBSS. Schneiden Sie den Dickdarm mit einer sterilen Schere in kleine Stücke, die in HBSS etwa fünf Zentimeter groß sind.

Übertragen Sie die kleinen Dickdarmgewebestücke in ein 15 Milliliter konisches Rohr mit 10 Millilitern Vorverdauungspuffer. Schütteln Sie das Rohr bei 100 U/min in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Als nächstes passieren Sie die Suspension durch ein 40 Mikrometer Zellsieb, und entsorgen Sie das beigefügte Kolonepithel.

Sammeln Sie das restliche Gewebe vom Sieb und verdauen Sie es weiter im Verdauungspuffer mit Kollagenase Typ IV und DNASE1 in 1X HBSS mit 5%FBS für 20 Minuten in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, während sie bei 100 RPM schütteln. Danach wirbeln Sie das verdaute Gewebe für ca. 20 Sekunden aus und leiten es durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, um Lamina-Propria-Fraktionen zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Lamina-Propria-Fraktionen bei 700-fachem G und vier Grad Celsius, um die Zellen herunterzupelulieren.

Erstellen Sie dann 100 Milliliter mit 30 % und 70 % Mitgradienten-Medienlösungen. Setzen Sie die erhaltenen Zellen in 10 Milliliter der 30%-Lösung wieder auf und überlagern Sie diese zusätzlich zu fünf Millilitern der 70%-Lösung in einem 15-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie den Gradienten in einem pausenfreien Zustand bei 1 000 mal G und Raumtemperatur.

Sammeln Sie die weiße Ringphase mit den Lamina propria Lymphozyten, die zwischen den 30% und 70% Gradientenschichten liegen wird. Waschen Sie die erhaltenen Zellen, indem Sie sie in eiskaltem HBSS und Zentrifugieren bei 500 mal G und 10 Grad Celsius für 10 Minuten wieder aufsetzen. Setzen Sie dann die Zellen im FACS-Puffer erneut aus.

Blockieren Sie vor der Antikörperfärbung zunächst die Zelloberfläche der Lamina-Propria-Zellen, indem Sie sie 15 Minuten lang mit Anti-Maus-CD16 von 32FC-Blocker auf Eis inkubieren. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CX3CR1 PE-Antikörpern zusammen mit Anti-PE-Mikroperlen auf Eis für 30 Minuten, um die gebundenen Zellen zu erfassen, und waschen Sie dann die Zellen mit FACS-Puffer. Übergeben Sie den Antikörper und die perlengebundenen Zellen durch eine magnetisch aktivierte Zellsortierspalte in einem Magnetfeld, um die ungebundenen Zellen zu entfernen.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit FACS-Puffer. Entfernen Sie danach die Säule aus dem Magnetfeld und drücken Sie den Kolben in die Spalte, um die perlengebundenen Zellen zu erhalten. Blockieren Sie zunächst die Lamina-Propria-Zellen mit Anti-Maus-CD16 von 32FC-Blocker auf Eis.

Dehnen Sie die Zellen, indem Sie die Zellen mit Anti-CD64-, CD11c-, CD11b-, CX3CR1-, Ly6C- und MHC-Klasse II-Antikörpern auslegen und sortieren Sie die Zellen dann mit einem FACS-Durchflusszytometer, wie im Textprotokoll beschrieben. Lyse die sortierten Zellen für die gesamte RNA-Vorbereitung und nachweisen Zytokin und fibrotische Marker. Analysieren Sie die mRNA-Expression von fibrotischen Markern und die entzündliche Zytokinanalyse aus isolierten einzelzelligen Suspensionen aus der magnetischen Reinigung.

Um mit der Zelloberflächenfärbung und -analyse zu beginnen, setzen Sie zwischen 500. 000 und 1 Million isolierte Lamina-Propria-Zellen in 15 Milliliter FACS-Puffer wieder aus. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD16 mit 32 Antikörpern bei einer Verdünnung von 1 bis 50 auf Eis für 10 Minuten. Danach waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitereeiskalten FACS-Puffer, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Oberflächenfleckkolonische Einzelzellsuspensionen mit fluoreszierend markierten Antikörpern bei einer Verdünnung von 1 bis 100 auf Eis für 30 Minuten. Waschen Sie die beschrifteten Zellen zweimal, um die ungebundenen Antikörper mit 500 Mikrolitereeisis FACS-Puffer für jede Wäsche zu entfernen. Analysieren Sie dann die beschrifteten mononukleären Zellen nach Durchflusszytometer, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um mit der intrazellulären Zytokinfärbung und -analyse zu beginnen, verwenden Sie ein Fixierungspermeabilisationslösungskit, um die oberflächenbefleckten Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu fixieren und zu permeabilisieren. Gate die Lamina Propria Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, um den intrazellulären Gehalt von IL-1 Beta-Zytokin zu erkennen. Als nächstes waschen Sie die Zellen, indem Sie FACS-Puffer und Zentrifugieren bei 200 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um überschüssigefixierungpuffer zu entfernen.

Wiederholen Sie diese Wäsche einmal. Um die Alpha-Glatte-Muskel-Actin-Ebene zu bestimmen, zuerst permeabilisieren Zellen mit der Fixierung Permeabilization Lösung Kit. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-Alpha SMA Alexa Fluor 488 Antikörpern bei einer Verdünnung von 1 bis 1000 auf Eis für 30 Minuten.

Waschen Sie dann die Zellen, indem Sie FACS-Puffer und Zentrifugieren bei 200 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten hinzufügen, um überschüssigen fixativen Puffer zu entfernen. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal. Führen Sie die FACS-Analyse durch, und richten Sie die Zellen wie im Textprotokoll beschrieben ab.

In dieser Studie wird das TNBS Colitis Mouse Modell angenommen, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Darmfibrose zu untersuchen und aufzuklären. Nach sechs Wochen TNBS-Behandlung ist zu erkennen, dass sich die Kolonnenlänge im Laufe der TNBS-Behandlung schrittweise von etwa fünf Zentimetern in der Kontrollgruppe auf etwa drei Zentimeter in der TNBS-Gruppe verkürzte. Um sicherzustellen, dass das Krankheitsmodell des TNBS Crohn mit dem Fibrosemodell des menschlichen Crohn vergleichbar ist und kein Artefakt im Zusammenhang mit der Methodik ist, werden die fibrotischen Marker in einer detaillierten Zeitstudienstudie auf mehreren Ebenen analysiert.

Die Akkumulation von Alpha-Glattmuskel-Actin-positiven Zellen und Kollagenablagerungen innerhalb submukosaler Schichten wurden in den meisten Fibrose-Inzidenzen berichtet und gelten als Kennzeichen für fibrotische Ereignisse Um TNBS-Fibrose mit Morbus Crohns assoziierter Fibrose zu vergleichen, wird die Expression von Fibrosemarkern und Zytokinen in frischer Gewebebiopsie aus dem Ileum von Patienten mit aktiver CD oder unter Remission analysiert. Bemerkenswert ist, dass eine ausgeprägte Induktion durch die Verdickung von Alpha-Glattmuskel-Actin-positiven Schichten und eine erhöhte Kollagenablagerung in aktiven CD-Abschnitten zu beobachten ist. Western Blot Analyse wird durchgeführt, um die Induktion der Alpha glatten Muskel-Actin-Expression in aktiven CD-Proben zu bestätigen.

Darüber hinaus wird eine signifikante Induktion von Fibrosemarkern durch qPCR-Analyse nachgewiesen. Die Wirkung von Rapamycin, einem pharmakologischen Inhibitor der M4-Aktivität, wird dann bewertet, um einen Mechanismus zur Begrenzung der TNBS-Fibrose zu bestimmen. Mäuse werden sowohl mit TNBS als auch mit Rapamycin behandelt und die Konzentrationen von Alpha-Glattmuskelaktin und Kollagen in der Darmhistologie werden analysiert.

Es ist wichtig, daran zu denken, die gleiche Menge an TNBS zu jeder Maus zu impfen und isolierte Lamina-Propria-Zellen so schnell wie möglich zu verarbeiten, um Zellverlust zu vermeiden sowie die Zelllebensfähigkeit zu erhalten. Unser Protokoll beschreibt TNBS-Fibrose und Remission von Fibrose sowie den hemmenden Faktor von Rapamycin bei der Fibrosebildung. Andere Forscher könnten daran interessiert sein, diese Technik zu verwenden, um ein besseres Wirkstoffziel für Fibrose und Dickdarmkrebs zu finden.

Bitte denken Sie daran, dass TNBS ein Hautreizungsmittel ist und Labormäntel während der Handhabung getragen werden sollten, um Hautkontakt zu vermeiden.