Name: Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung intakter Maus-Augäpfel mit Lidern und okulärer Oberfläche für histologische und immunhistochemische Analysen. Diese Methode bewahrt das Epithelgewebe und ermöglicht präzise Untersuchungen.

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Die Autoren danken Prof. Rong Ju für die kritische Lektüre des Manuskripts und allen Labormitgliedern für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Beijing, China), das Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, Provinz Guangdong, China), "100 People Plan" von der Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, Provinz Guangdong, China) und Forschungsgelder vom State Key Laboratory of Ophthalmology am Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, Provinz Guangdong, China).

Alle Verfahren zur Verwendung von Mäusen wurden vom Animal Care and Use Committee, Zhongshan Ophthalmic Center, genehmigt und befolgten die ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung.
1. Zerlegung des Augapfels mit intakter Augenoberfläche und Augenlidern
<ol><li>Sezieren Sie den Kopf.<ol>
<li>Euthanisieren Sie postnatale Tag 10 (P10) und P28 Mäuse (siehe Tabelle der Materialien für Mausstämme) durch Zervixdislokation, schneiden Sie den Kopf vom Hals durch eine scharfe Schere.</li>
		<li>Bisect Kopf mit einem Paar gerade Schere entlang der sagittalen Mittellinie beginnend an der interparietalen Knochen rostral zur Nasal (Abbildung 1A,B). HINWEIS: Der Schädelknochen härtet mit der Alterung der Maus aus, achten Sie darauf, dass die Schere so weit wie möglich entlang der Mittellinie schneidet.</li>
		<li>Legen Sie jede Hälfte des geteilten Kopfes in eine saubere Petrischale, schneiden Sie den Kiefer und die Zunge zuerst mit einer scharfen Schere ab. Befreien Sie den Sehnerv, indem Sie ihn vor der optischen Chiasm-Position aus dem Gehirn schneiden, und entfernen Sie alle Hirngewebe, einschließlich der Olfaktor-Lampe, die an der Schädelwand befestigt ist.</li>
		<li>Nun sollen die restlichen Gewebe alle Schädel-Orbital-Knochen haben, die mit dem Augapfel verbunden sind (Abbildung 1C,D). Waschen Sie den restlichen Teil mit PBS, um Blut und Haarreste zu reinigen.</li>
		<li>Präfixgewebe mit 4% Paraformaldehyd (PFA, in phosphatgepufferter Saline [PBS], pH 7,4) in einem 50 ml konischen Rohr bei Raumtemperatur (RT) mit Rotation. Die ungefähre Fixierungszeit ist wie folgt: 10 min für P0 bis P7; 20 min für P8 bis P28; und 30 min für P29 und älter. HINWEIS: Die Präfixierung bietet Gewebesteifigkeit, die die anschließende Zerlegung erleichtert. Darüber hinaus vermeidet die Präfixierung, dass frisches Gewebe zu lange vor der Zerlegung unfixiert bleibt. VORSICHT: PFA ist gefährlich und muss mit Vorsicht behandelt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie Schädel-Orbitalknochen.<ol>
<li>Nach der Präfixierung den sezierten Kopf in PBS dreimal schnell waschen, um die gebrochenen Haare und Fixativen weiter zu beseitigen, um mit der weiteren Zerlegung fortzufahren. VORSICHT: Die Exposition gegenüber Fixativen während der Zerlegung kann gesundheitsschädlich sein.</li>
		<li>Legen Sie das Gewebe in 10 cm Petrischale, schneiden Sie den Schädel in drei Teile entlang der in Abbildung 1D,Eangegebenen Ebenen. Der Augapfel in der Steckdose ist im mittleren Teil des Schädels unter ethmoiden, frontalen und kieferllbeinen Knochen versteckt (Abbildung 1D,E).</li>
		<li>Verwenden Sie zwei Paare von No. 4 geradeZange, um den ethmoiden Knochen abzuschälen, um die Frontal- und Kieferknochen vollständig freizulegen (Abbildung 1F).</li>
		<li>Teilen Sie die Schädeloberfläche (einschließlich Der Oberkiefer und der Frontalknochen) geographisch in 4 Bereiche (Abbildung 1F). Setzen Sie die Spitze der gekrümmten Zangen horizontal in jeden Bereich ein, um die Oberkiefer- und Frontalknochen sequenziell zu entfernen (Abbildung 1F). HINWEIS: Die Kieferknochen können nicht alle gleichzeitig entfernt werden. Geduldig sezieren sie Stück für Stück. Der Frontalknochen ist durch weiches Bindegewebe direkt mit dem Augapfel verbunden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie ihn aus dem Augapfel entfernen, um zu verhindern, dass sich der Augapfel dehnt und die Bindehaut beschädigt wird.</li>
		<li>Nach der Entfernung des partiellen Kieferknochens und aller Frontalknochen würden die darunter liegenden Tränen- und Jugalknochen freigelegt (Abbildung 1G). Entfernen Sie die beiden Knochen und die damit verbundenen subkutanen Muskeln und Fette, die den Augapfel umgeben, schneiden Sie den Augapfel mit angeschlossenen Augenlidern und Haut in einen kleinen quadratischen Block, um das Gewebevolumen zu reduzieren und die Orientierung des Gewebes beim Einbetten zu erleichtern(Abbildung 1 H).</li>
		<li>Den Augapfel und das zugehörige Gewebe wieder in 4% PFA geben und über Nacht bei 4 °C fixieren. Das feste Gewebe kann mindestens einen Monat lang bei 4 °C in PBS mit einem Zusatz von 0,02% NaN3konserviert werden. Alternativ können Sie sofort mit der histologischen Analyse fortfahren. HINWEIS: Wenn das Gewebe länger gelagert werden muss, kann es leicht in 70% Ethanol gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Histologische Analyse
<ol><li>Paraffin-Sektion und Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E)<ol>
<li>Befolgen Sie das an anderer Stelle beschriebene Standardprotokoll9, um Paraffineinbettungen und -schnitte durchzuführen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunhistochemie (IHC)<ol>
<li>Paraffinabschnitte mit Xylol ableiten und die Abschnitte durch Alkoholreihen (100%, 95%, 80%) rehydrieren in destilliertes Wasser (dH2O).</li>
		<li>Antigenabruf durch Mikrowellenbehandlung der Geweberutschen im 0,01 M Zitronensäurepuffer (3 g Trinatriumcitrat, 0,4 g Zitronensäure pro 1 L doppelt destilliertemH2O) in einem Glasschieber glas mit geringer Leistung (120 W). Die Energie sollte zeitweise für insgesamt 5-10 min mit jedem Intervall von etwa 2 min geliefert werden. HINWEIS: Hochleistungs-Mikrowelle oder gleichmäßige Erwärmung würde zur Ablösung von Gewebeabschnitten von der Rutsche führen.</li>
		<li>Wählen Sie die Dias aus dem Glas, wischen Sie die Restflüssigkeit, die jeden Abschnitt umgibt, vorsichtig mit Gesichtsgewebeabsaugen ab und legen Sie sie in einer Histologiebox auf das Diaregal. Zeichnen Sie ein Quadrat um jeden Abschnitt mit einem wasserdichten histologischen Stift. Legen Sie 100 l Blockierpuffer (0,1% Triton X-100 und 10% Eselserum in 1x PBS) auf jedes Quadrat und brüten 30 min bei RT.</li>
		<li>Entfernen Sie die Blockierlösung vorsichtig mit Vakuum, fügen Sie den primären Antikörper (siehe Materialtabelle) mit der gewünschten Verdünnung im Sperrpuffer hinzu und inkubieren Sie die Dias 24 h oder länger bei 4 °C. HINWEIS: Die Konzentration für jeden primären Antikörper, der für IHC verwendet wird, variiert und muss in Pilotversuchen getestet werden.</li>
		<li>Waschen Sie Gewebeschlitten mit PBST (0,1% Triton in PBS) dreimal, für jeweils 10 min. Wiederholen Sie Schritt 2.2.4 mit dem sekundären Antikörper (siehe Materialtabelle) zusammen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), der den Sperrpuffer ersetzt. Bei Raumtemperatur (RT) mindestens 4 h oder länger weiter inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie den sekundären Antikörper, waschen Gewebeabschnitte mit PBST-Lösung dreimal, für jeweils 10 min, dann mit sauberen PBS für weitere 5 min waschen.</li>
		<li>Wischen Sie die verbleibenden PBS-Umhänge ab, montieren Sie Abdeckungen auf Abschnitten mit Montagemedium. Führen Sie eine fluoreszierende Mikroskopie durch, um Bilder zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).</li>
<li>Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Morphology+of+the+Lipid+Layer+of+the+Tear+Film%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film.</a> Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).</li>
<li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+immunology+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Immunology+and+Allergy%22%5BJournal%5D)">Anatomy and immunology of the ocular surface.</a> Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).</li>
<li>Mizoguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+alkali+injury+damages+meibomian+glands+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice.</a> The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).</li>
<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+of+the+conjunctiva%3A+A+review+of+recent+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).</li>
<li>Nowell, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+imposes+aberrant+cell+fate+in+regenerating+epithelia+through+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).</li>
<li>Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histochemical+study+of+the+development+of+premaxilla+and+maxilla+during+secondary+palate+formation+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Histology+and+Cytology%22%5BJournal%5D)">A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo.</a> Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+MEK+kinase+1+in+TGF-beta%2Factivin-induced+epithelium+movement+and+embryonic+eyelid+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure.</a> The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).</li>
<li>Sharov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+overexpression+inhibits+eyelid+opening+by+altering+epidermal+apoptosis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation.</a> The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).</li>
<li>Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+symptoms+are+increased+in+mice+deficient+in+phospholipid+transfer+protein+%28PLTP%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP).</a> The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastermind-like+transcriptional+co-activator-mediated+Notch+signaling+is+indispensable+for+maintaining+conjunctival+epithelial+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity.</a> Development. 140 (3), 594-605 (2013).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signaling+inhibits+goblet+cell+differentiation+via+SPDEF+in+conjunctival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium.</a> Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Eine wichtige Erinnerung für die Vorbereitung des intakten Augapfels ist, dass alle Orbitalknochen vollständig entfernt werden müssen, insbesondere die Juga- und Tränenknochen, die klein sind und sich in der Nähe der Unterseite der Augenhöhle befinden. Alle übrig gebliebenen Knochen können die anschließende Histologie erschweren. Falls ein winziges Stück Knochen nicht versehentlich vollständig aus der Zerlegung entfernt wurde, kann es aus dem Einbettungsparaffinblock mit einem Paar Scharfmacher herausgenommen werden. Das...

Die Augenoberfläche besteht aus einem kontinuierlichen Blatt regionalisiertes Epithel einschließlich palpebrale Bindehaut, Bulbar-Konjunktiva und Hornhaut1. Viele Drüsenstrukturen sind mit dem Augenoberflächenepithel assoziiert und erzeugen zusammen eine Schicht Tränenfolie, die die Hornhautoberfläche vor Trocknung und Umweltinvasionen schützt2. Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). Sowohl genetische Faktoren als auch Umweltreizstoffe oder ihre Wechselwirkungen tragen zu pathologischen Veränderungen des OS3,4bei. Dementsprechend wurden eine Vielzahl von gentechnisch veränderten und physikalisch oder chemisch induzierten Tiermodellen zur Untersuchung von Krankheitsprozessen des menschlichen Betriebssystems verwendet.
Die Struktur und Funktion des Maus-OS ist ähnlich wie die des Menschen in vielerlei Hinsicht. Die von den Augendrüsen sezernierten Tränenfilmkomponenten ähneln auch bei Mäusen und Menschen. Eine Fülle von Studien wurde mit Mausmodellen zur Aufklärung von Mechanismen menschlicher OS-Erkrankungen5,6,7durchgeführt. In vielen Fällen ist es wichtig, globale statt lokale molekulare Veränderungen des Betriebssystems zu analysieren, um umfassende Informationen unter der gleichen experimentellen Behandlung zu erhalten. Daher ist eine Probenvorbereitung mit guter Integrität erforderlich, um sicherzustellen, dass jeder Teil des Betriebssystems gleichzeitig analysiert wird.
Das Mausbetriebssystem verbindet sich eng mit dem Augapfel, der in die Augenhöhle/Orbit eingebettet war (eine knöcherne Tasse aus mehreren verschiedenen Schädelknochen) und verbindet sich mit ihm durch dünnes Bindegewebe. Es gibt enorme Herausforderungen für die Sezieren der gesamten Augenoberfläche, ohne die palpebrale oder bulbar Konjunktiva zu beschädigen. Diese Herausforderungen gehen von: (i) das Betriebssystem ist weich und dünn und befestigt an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln, daher anfällig für Verzerrungen und Beschädigungen; und (ii) der begrenzte Abstand zwischen den Orbitalknochen und dem Augapfel die Seziervorgänge einschränken. Die Herausforderungen sind viel größer für die erwachsene Maus. In der embryonalen Maus ist die Orbitalknochenverknösung nicht vollständig und das umgebende Gewebe ist relativ locker8. Der Kopf kann entfernt und zerlegt werden und dann direkt paraformaldehyd (PFA) Fixierung und Einbettungausgesetzt 9. Im Gegensatz dazu sind die postnatalen und erwachsenen Maus-Orbitalknochen vollständig mit dicken umgebenden Geweben verknözt, was das Eindringen von Fixativen weniger effizient macht. Darüber hinaus sind die Orbital-/Schädelknochen hart und spröde, leicht gebrochen, wenn sie in die weichen Einbettverbindungen wie Paraffin geschnitten werden. Die gebrochenen Knochenstücke reißen einstimmig die nahegelegenen Gewebe, was zu einer minderwertigen Gewebemorphologie führt.
Viele veröffentlichte Studien zeigten oft partielle Augenoberfläche, die für ihre speziellen Forschungszwecke ausreichen kann10,11. Eine grobe Untersuchung der Literatur ergab nur wenige Studien, die zeigten, dass die gesamte intakte Augenoberfläche ohne detaillierte Beschreibung der Sezierprotokolle12,13nachgewiesen wurde. In diesem Protokoll haben wir eine Seziermethode beschrieben, um eine integrierte postnatale Augenoberfläche zu erhalten, bei der Orbital- und Schädelknochen geordnet entfernt wurden, wobei die unberührte Augenoberfläche zusammen mit dem Augapfel und den Augenlidern zurückbleibt, wodurch die körperlichen Schäden minimiert werden. Wir untersuchten die OS-Histologie und führten die Immunhistochemie mit den mit diesem Protokoll hergestellten Gewebeabschnitten durch.

<table><tbody><tr><td>1&mal; Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>FG701-01</td><td></td></tr><tr><td>50ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Selbstklebende Objektträger</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Empfohlene Konzentration 1:500 - 1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>Empfohlene Konzentration 1:500 - 1.000</td></tr><tr><td>Anti-K12-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab124975</td><td>Empfohlene Konzentration 1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-K14-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>Empfohlene Konzentration 1:800</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckobjektträger</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop.</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskope</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Eindeckmedien</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere - gerade Klinge</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowellenherde</td><td>Galanz</td><td>P70D20TL-D4</td><td></td></tr><tr><td>Mausstämme</td><td>C57/BL6 und Sv129 gemischt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nr.4 gerade Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>501978-6</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)Verschiedenes</td><td></td><td></td> <td>Bereiten Sie eine 4%ige Lösung in 1&mal; PBS und Filter mit 0,45 μm m Filtermembran</td></tr><tr><td>Gewebekulturschale</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBW6818</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von intaktem augapfel zur beschaffung von integralem okularemoberflächengewebe für die histologische untersuchung und immunhistochemie

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Die Augenoberfläche (OS) besteht aus einem Epithelblatt mit drei verbundenen Teilen: palpebrale Bindehaut, Bulbarkonjunktiviva und Hornhautepithel. Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). In experimentellen Tiermodellen mit bestimmten genetischen Modifikationen oder künstlichen Operationen ist es sinnvoll, alle Teile des OS-Epithelblatts zu untersuchen, um relative pathogenetische Veränderungen jedes Teils parallel zu bewerten. Die Zerlegung des OS-Gewebes als Ganzes ohne Verzerrung oder Beschädigung war jedoch eine Herausforderung, vor allem aufgrund der Weichheit und Dünnheit des Os, das an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln befestigt ist. Darüber hinaus ist die tiefe Augenhöhle, die durch die harten Schädel/Orbitalknochen gebildet wird, durch den Augapfel voll belegt, so dass nur begrenzter Platz für die Bedienung von Sezierungen bleibt. Als Ergebnis würde eine direkte Zerlegung des Augapfels mit zugehörigem OS-Gewebe von der Gesichtsseite oft zu Gewebeschäden führen, insbesondere der palpebralen und bulbaren Bindehaut. In diesem Protokoll beschrieben wir eine Methode, um den Schädel und die Orbitalknochen sequenziell von einem zerkularten Mauskopf zu entfernen, wobei Augenlider, Augenoberfläche, Linse und Netzhaut in einem Stück zusammengelassen werden. Die Integrität des OS-Blattes war gut erhalten und konnte durch Histologie oder Immunostainierung in einem einzigen Abschnitt untersucht werden.

Die wichtigsten Schädelknochen aus verschiedenen Perspektiven wurden in Abbildung 1A-Edargestellt, mit Farben, die verschiedene Knochen bezeichnen. Wir benutzten vier Wochen altes Tier, um die Sezierprozesse zu demonstrieren. Nach den Sezierschritten 1.1.1-1.1.3 und einer kurzen Präfixierung (Schritt 1.1.4) wird der Augapfel mit den zugehörigen Gesichtsknochen in Abbildung 1Egezeigt. Weitere Trim...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung des Mausauges mit Augenlid-, Augenoberfläche-, vorderen und hinteren Segmenten in relativ intakter Position.

Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Unser Labor konzentriert sich auf die Augenentwicklung und die Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um den Schädel und die Orbitalknochen sequenziell vom sezierten Mauskopf zu entfernen. Augenlider, Augenoberfläche, Linse und Netzhaut in einem Stück zusammen lassen. Das Protokoll kommt Augenärzten zugute, die sich für Augenoberflächendidaktik interessieren. Ich bin Dianlel Guo, um die Technik mit einem wahrscheinlichen Kampf zu erzählen, wenn ich versuche, die Beschädigung des Augapfels zu vermeiden, während die Gesichtsknochen sezieren. Der Hauptvorteil dieser Sezierstoffe besteht darin, dass die Integrität des Augenoberflächenepithelblatts gut erhalten ist und die verschiedenen Teile der Augenoberfläche durch Histologie oder Immunfärbung in einem einzigen Abschnitt untersucht werden können. Achten Sie darauf, alle kleinen Knochen und Ablagerungen von den Weichteilen abzuschneiden. Grund, es wird Narbenspuren auf Gewebeabschnitt sonst verursachen. Nach der Einschläferung der Maus, verwenden Sie eine gerade Schere, um den Kopf abzuschneiden und bisect es entlang der sagittalen Mittellinie beginnend an der intraparietalen Knochen rostral zur Nase. Legen Sie jede Hälfte des geteilten Kopfes in eine saubere Petrischale und schneiden Sie den Kiefer und die Zunge mit einer scharfen Schere ab. Befreien Sie den Sehnerv, indem Sie ihn vor der optischen Chiasm-Position vom Gehirn abschneiden. Und entfernen Sie alle Hirngewebe einschließlich der Olfaktor-Lampe, die an der Schädelwand befestigt ist. Nun sollen alle verbleibenden Gewebe alle Schädel- und Orbitalknochen haben, die mit dem Augapfel verbunden sind. Waschen Sie die restlichen Teile mit PBS, um Blut und Haarreste zu reinigen. Fixieren Sie das Gewebe vorab, indem Sie es in ein 50-Milliliter-Rohr legen, das 4% Paraformaldehyd enthält, und sie bei Raumtemperatur drehen. Nachdem die Präfixierung abgeschlossen ist, waschen Sie den sezierten Kopf in PBS dreimal schnell, um die gebrochenen Haare und Fixativen weiter zu beseitigen. Legen Sie das Gewebe in eine 10 Zentimeter lange Petrischale und schneiden Sie den Schädel in drei Teile entlang der in Abbildung eins des Textprotokolls angegebenen Ebenen. Der Augapfel und die Steckdose sind im mittleren Teil des Schädels unter ethmoiden, frontalen und kieferllbeinen Knochen versteckt. Verwenden Sie zwei Paare von Nummer vier geradeZange, um den ethmoiden Knochen abzuschälen und die Frontal- und Kieferknochen vollständig freizulegen. Dann teilen Sie die Schädeloberfläche geographisch in vier Bereiche. Setzen Sie die Spitze der gekrümmten Zangen horizontal in jeden Bereich ein, um die Oberkiefer- und Frontalknochen sequenziell zu entfernen. Danach werden die darunter liegenden Tränen- und Jugalknochen freigelegt. Entfernen Sie die beiden Knochen und die damit verbundenen subkutanen Muskeln und Fette, die den Augapfel umgeben. Schneiden Sie den Augapfel mit befestigten Augenlidern und Haut in einen kleinen, quadratischen Block, um das Gewebevolumen zu reduzieren und die Orientierung des Gewebes beim Einbetten zu erleichtern. Augapfel und zugehöriges Gewebe wieder in 4%Paraformaldehyd geben und über Nacht bei 4 fixieren

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie retinalen Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in Kultur zu klonalen Netzhaut Kugeln zu bilden. Die Kugeln, die isoliert besitzen den Kardinal Eigenschaften von Stammzellen: Selbsterneuerung und multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

Das Papier beschreibt ein vereinfachtes Verfahren zur Hornhaut-und Verbrauchssteuern zu retinalen Gewebe aus dem Augapfel von menschlichen Leichen Spendern auszuhöhlen. Die hier beschriebene Technik wird verbrauchsteuerpflichtige guter Qualität zu Geweben zur Transplantation oder chirurgische Zwecke oder Forschungszwecke ohne Beschädigung anderer Gewebe des Augapfels verwendet werden zu helfen.

Ein vereinfachtes Verfahren für<em&gt; In-situ</em&gt; Exzision der Hornhaut und der Netzhaut Ausweiden von Gewebe aus menschlichen Augapfel

Dieses Video zeigt eine Methode zur Induktion von Entzündungen der Augenoberfläche und einer Meibom-Drüsendysfunktion in einem Mausmodell. Die Stimulation des Immunsystems der Maus mit einem Immunogen und die spätere Restimulation mit demselben Immunogen fördert die Entzündung der Augenoberfläche, die zu einer Verstopfung der Meibom-Drüsensekretion durch neutrophilenproduzierte aggNETs führt und zu einer Erkrankung des trockenen Auges führt.

Eine Methode zur Induktion von Entzündungen der Augenoberfläche in einem Mausmodell

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine effektive Technik zur Isolierung des ganzen, intakten Glaskörperkerns und der Rinde aus post mortem enukleierten Schweineaugen zu zeigen.

Ganze Glaskörper Dissection für Vitreodynamic Analysis

Die exponierte normale Okularoberfläche besteht aus Hornhaut und Bindehaut. Epithelzellen, Becherzellen und Immunzellen sind in der Bindehaut vorhanden. Hier wird eine nicht-invasive Technik der Impressionszytologie beschrieben, die eine Impressionszytologie-Vorrichtung und Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in der Bindehaut verwendet.

Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein neuartiges Modell der glaukomatösen Neurodegeneration zu charakterisieren, das auf einer thermischen 360°-Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus basiert und eine subakute okuläre Hypertonie induziert.

Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die okuläre Mikrodissektion bei Nagetieren vorgestellt. Der Prozess beinhaltet die Enukleation des Augapfels zusammen mit der Nickhaut (d.h. dem dritten Augenlid). Es folgt die Trennung der hinteren und vorderen Augenmuscheln.

Mikrodissektion des Nagetierauges

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus lokal gewonnenen Schweineaugen. Diese Zellen dienen als hochwertige Alternative zu Stammzellen und eignen sich für die In-vitro-Netzhautforschung .

Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen von Schweinen für die In-vitro-Modellierung

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung retinaler glialer Müller-Zellen aus Mausaugen. Das Protokoll beginnt mit der Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von Müller-Zellen.

Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

Eine gründliche Hochberechnung und standardisierte Schnitte von nicht-neoplastischen Kugeln sind wichtig, um qualitativ hochwertige, reproduzierbare histopathologische Schnitte zu erhalten. Richtlinien für eine standardisierte Bruttoisierung von adulten und fötalen nicht-neoplastischen Globen werden hierin bereitgestellt. Es werden verschiedene Optionen für die Globusschnittung aufgezeigt und diskutiert, einschließlich Kriterien für fallbasierte Entscheidungsfindung.

Bruttoisierung von nicht-neoplastischen Kugeln, einschließlich fötaler Augen

Diese Studie stellt eine Methodik für die Verabreichung von Therapeutika in die Netzhaut und die Sehnerven der erwachsenen Ratte vor. Darüber hinaus wird eine einzigartige Gewebeentnahmemethode für eine Top-Down-Entnahme des Sehnervs und der Netzhaut bei einer erwachsenen Ratte eingeführt.

Okuläre therapeutische Verabreichung und fortgeschrittene Gewebeentnahme bei erwachsenen Ratten

Erfahren Sie die Isolierung intakter Maus-Augäpfel mit Lidern und okulärer Oberfläche für histologische und immunhistochemische Analysen. Diese Methode bewahrt das Epithelgewebe und ermöglicht präzise Untersuchungen.

Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie (Video) | JoVE Journal

Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie

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