Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie
20. Oktober 2019
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung des Mausauges mit Augenlid-, Augenoberfläche-, vorderen und hinteren Segmenten in relativ intakter Position.
Unser Labor konzentriert sich auf die Augenentwicklung und die Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um den Schädel und die Orbitalknochen sequenziell vom sezierten Mauskopf zu entfernen. Augenlider, Augenoberfläche, Linse und Netzhaut in einem Stück zusammen lassen. Das Protokoll kommt Augenärzten zugute, die sich für Augenoberflächendidaktik interessieren. Ich bin Dianlel Guo, um die Technik mit einem wahrscheinlichen Kampf zu erzählen, wenn ich versuche, die Beschädigung des Augapfels zu vermeiden, während die Gesichtsknochen sezieren. Der Hauptvorteil dieser Sezierstoffe besteht darin, dass die Integrität des Augenoberflächenepithelblatts gut erhalten ist und die verschiedenen Teile der Augenoberfläche durch Histologie oder Immunfärbung in einem einzigen Abschnitt untersucht werden können. Achten Sie darauf, alle kleinen Knochen und Ablagerungen von den Weichteilen abzuschneiden. Grund, es wird Narbenspuren auf Gewebeabschnitt sonst verursachen. Nach der Einschläferung der Maus, verwenden Sie eine gerade Schere, um den Kopf abzuschneiden und bisect es entlang der sagittalen Mittellinie beginnend an der intraparietalen Knochen rostral zur Nase. Legen Sie jede Hälfte des geteilten Kopfes in eine saubere Petrischale und schneiden Sie den Kiefer und die Zunge mit einer scharfen Schere ab. Befreien Sie den Sehnerv, indem Sie ihn vor der optischen Chiasm-Position vom Gehirn abschneiden. Und entfernen Sie alle Hirngewebe einschließlich der Olfaktor-Lampe, die an der Schädelwand befestigt ist. Nun sollen alle verbleibenden Gewebe alle Schädel- und Orbitalknochen haben, die mit dem Augapfel verbunden sind. Waschen Sie die restlichen Teile mit PBS, um Blut und Haarreste zu reinigen. Fixieren Sie das Gewebe vorab, indem Sie es in ein 50-Milliliter-Rohr legen, das 4% Paraformaldehyd enthält, und sie bei Raumtemperatur drehen. Nachdem die Präfixierung abgeschlossen ist, waschen Sie den sezierten Kopf in PBS dreimal schnell, um die gebrochenen Haare und Fixativen weiter zu beseitigen. Legen Sie das Gewebe in eine 10 Zentimeter lange Petrischale und schneiden Sie den Schädel in drei Teile entlang der in Abbildung eins des Textprotokolls angegebenen Ebenen. Der Augapfel und die Steckdose sind im mittleren Teil des Schädels unter ethmoiden, frontalen und kieferllbeinen Knochen versteckt. Verwenden Sie zwei Paare von Nummer vier geradeZange, um den ethmoiden Knochen abzuschälen und die Frontal- und Kieferknochen vollständig freizulegen. Dann teilen Sie die Schädeloberfläche geographisch in vier Bereiche. Setzen Sie die Spitze der gekrümmten Zangen horizontal in jeden Bereich ein, um die Oberkiefer- und Frontalknochen sequenziell zu entfernen. Danach werden die darunter liegenden Tränen- und Jugalknochen freigelegt. Entfernen Sie die beiden Knochen und die damit verbundenen subkutanen Muskeln und Fette, die den Augapfel umgeben. Schneiden Sie den Augapfel mit befestigten Augenlidern und Haut in einen kleinen, quadratischen Block, um das Gewebevolumen zu reduzieren und die Orientierung des Gewebes beim Einbetten zu erleichtern. Augapfel und zugehöriges Gewebe wieder in 4%Paraformaldehyd geben und über Nacht bei 4 fixieren
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Übersicht
Dieses Protokoll konzentriert sich auf eine Methode zur Isolierung des Mausaugapfels mit intaktem Augenlid und okularem Epithel, wodurch die Anatomie für anatomische Untersuchungen erhalten bleibt. Die Technik ist besonders vorteilhaft für Augenärzte, die okulare Oberflächen untersuchen möchten, ohne empfindliche Gewebe zu beschädigen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Augenentwicklung
- Augenerkrankungen
- Histologie und Immunfärbung
Hintergrund
- Bedeutung der Erhaltung der Integrität der okularen Oberfläche
- Herausforderungen beim Präparieren von Mausaugen ohne Beschädigung
- Anwendungen für die augenärztliche Ausbildung
Verwendete Methoden
- Schrittweise Entfernung von Schädel- und Orbitaknochen
- Mausmodell
- Verwendung von Paraformaldehyd zur Gewebefixierung
Hauptergebnisse
- Das Protokoll erhält das epitheliale Blatt der Augenoberfläche für weitere Untersuchungen
- Ermöglicht histologische oder immunhistochemische Analysen
- Veranschaulicht effektive Techniken für die okulare Dissektion
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt eine zuverlässige Methode zur Isolierung des Mausaugapfels mit anhängenden Strukturen
- Bedeutsam für Untersuchungen im Zusammenhang mit der Gesundheit und Erkrankungen des Auges
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Erhaltung der Integrität des okularen Oberflächenepithels ermöglicht die parallele Untersuchung des Lidbindehautepithels, Bindehautepithels und Hornhautepithels in Krankheitsmodellen. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem er die gleichzeitige Beurteilung pathogenetischer Veränderungen in miteinander verbundenen Geweben erlaubt. Er erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Studien, die eine intakte Gewebearchitektur für die histologische und immunhistochemische Analyse erfordern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die räumlichen Beziehungen innerhalb des okularen Oberflächenepithels erhalten bleiben.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch die Verwendung intakter Gewebeproben für die parallele histologische Untersuchung krankheitsbedingter Veränderungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme mit erhaltenem okularem Oberflächenarchitektur für nachgeschaltete Immunfärbungen und histologische Analysen vor.
- Operativer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Analysen, indem Gewebeverzerrungen während der Dissektion minimiert werden, was die Reproduzierbarkeit zwischen den Schnitten verbessert.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die systemische Integrität mit krankheitsrelevanter Relevanz und ermöglicht die translationale Abstimmung von Biomarkern über verbundene okuläre Oberflächenbereiche hinweg.
- Operationaler Wert: Stellt durch die Erhaltung der Gewebemorphologie eine kontinuierliche Übertragbarkeit von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher, um konsistente Schnittführung und Analyse zu gewährleisten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in Entdeckungsbiologie-Arbeitsabläufe, indem sie die Vorbereitung intakter Gewebe für histologische und immunhistochemische Auswertungen ermöglicht, die Hypothesentests und die Aufklärung von Signalwegen unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die Integrität des epithelialen Zellblatts erhalten bleibt, um parallele Untersuchungen der Konjunktiva- und Kornealbereiche durchzuführen.
- Screening: Verbessert die Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare Gewebeisolation, wodurch die Variabilität beim histologischen Schneiden verringert wird.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen abhängiger Variablen mittels Immunfärbung und Histologie an intakten Gewebeschnitten.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem die Architektur der okularen Oberfläche erhalten bleibt, um eine konsistente pathologische Beurteilung zu gewährleisten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Methode zur Vorbereitung der okularen Oberfläche über mehrere Krankheitsmodelle und Screening-Kampagnen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch erhaltene Gewebearchitektur, die die gleichzeitige Analyse mehrerer Kompartimente der okularen Oberfläche ermöglicht.
- Operativer Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch ein konsistentes Dissektionsprotokoll, das Gewebeschäden und Schnittartefakte minimiert.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unklarheiten in Modellen okularer Erkrankungen mittels Untersuchung intakter Gewebe.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung, ermöglicht durch zuverlässige histologische und immunhistochemische Daten aus intakten Präparationen der okularen Oberfläche.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrochirurgischen Dissektionstechniken, um Gewebeschäden während der Knochenentfernung zu vermeiden.
- Benötigt den Einsatz scharfer Scheren und feiner Pinzetten zur präzisen Trennung von Schädel- und Orbitaknochen von Weichgeweben.
- Setzt standardisierte Fixierungsprotokolle unter Verwendung von Paraformaldehyd voraus, um die Gewebeintegrität für die Schnittführung zu bewahren.
- Erfordert Anpassungserwägungen bei der Anwendung auf verschiedene Modellsysteme oder Entwicklungsstadien.
- Praktische Einschränkung: Die Wirksamkeit des Verfahrens hängt von der vollständigen Entfernung knöcherner Rückstände ab, um Schnittartefakte zu vermeiden.
