A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, ein Profil von Hepatozyten-Kern-DNA-Gehalt aus 2D-Gewebe-Sektionen für die Untersuchung der Leberentwicklung, Regeneration, und chronische Krankheiten zu generieren. Dieser automatisierte Hochdurchsatzansatz kann auf alle 2D-Lebergewebeabschnitte angewendet werden, die eine intern kalibrierte Auslesung der Kernploidie für alle einfachen kreisförmigen Hepatozytenkerne bieten. Veränderungen in der Hepatozyten-Kernploidie sind mit Alterung, chronischeleber Erkrankungen und Krebs verbunden.

Diese Technik bietet eine einfache Möglichkeit, die Kernploidie in festen oder kryokonservierten Leberproben zu profilieren. In situ ploidy Profiling-Methoden haben erhebliches Potenzial als Forschung und klinische Werkzeuge zur Verfolgung der Lebererkrankung Progression, da sie keine Gewebe-Desegregation oder Zugang zu frischem Material erfordern. Nach der Ernte der murinen Lebergewebeprobe, betten Sie die Leber-Lobule in eine optimale Schneidtemperatur mittelgefüllt Kryomold und sofort legen Sie die Form auf Trockeneis, um ein schnelles Einfrieren zu gewährleisten.

Um Scheiben der gefrorenen Leberlupenprobe zu erhalten, schneiden Sie die Probe mit einer Dicke von sechs Mikrometern ab und legen Sie einen beschrifteten polyamidbeschichteten Schlitten für fünf Sekunden über jede Probe, um jede Probe auf dem Dia kleben zu lassen. Wenn alle Scheiben gesammelt wurden, lassen Sie die Proben drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur vor der Immunetikettierung ausdemieren. Am Ende des Gleichgewichts die Gewebeabschnitte in einer Dunstabzugshaube mit einem Milliliter 4%Paraformaldehyd in PBS 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren.

Am Ende der Fixierung spülen Sie die Dias mit drei dreiminütigen Wärten in PBS mit sanfter Rührung ab. Nach der letzten Wäsche den Bereich um jeden Gewebeabschnitt trocknen und einen hydrophoben Stift verwenden, um einen Kreis um jede Probe zu ziehen. Um die Proben zu permeabilisieren, behandeln Sie die Abschnitte mit einem 0,5% nichtionischen Tensid in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Am Ende der Inkubation die Proben für drei Minuten in PBS zweimal mit sanfter Rührung waschen, wie gezeigt, bevor Sie die unspezifische Bindung mit einer gefilterten Lösung von 1%rinderserumalbumen, 5%Pferdeserum und 0,2% nicht-ionischem Tensid in PBS für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren. Als nächstes inkubieren Sie die Dias mit dem HHF4-alpha-Antikörper, der über Nacht bei vier Grad Celsius in einer feuchten, lichtgeschützten Färbekammer im Sperrpuffer verdünnt wird. Am nächsten Morgen die Dias viermal in PBS mit sanfter Rührung vor der Inkubation mit einem geeigneten fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper waschen und Hoechst in gefiltertem 1%rinderserumalbumen und 0,2% nicht-ionischem Tensid in PBS für zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer feuchten, lichtgeschützten Färbekammer verdünnt.

Am Ende der Inkubation die Dias viermal waschen, wie gezeigt, gefolgt von zwei dreiminütigen Wäschen in doppelt destilliertem Wasser mit sanfter Rührung. Nach der letzten Wäsche die Proben mit zwei Tropfen Fluoreszenz-Montagemedium auf einem Deckelschlupf montieren und bei Bedarf sanften Druck ausüben, um Blasen zu beseitigen. Überprüfen Sie dann die Dias mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop, um eine gute Fixierung und Immunkennzeichnung zu gewährleisten.

Legen Sie für die Fluoreszenzbildaufnahme die Parameter auf einer Bildgebungsplattform mit hohem Inhalt fest, um Fluoreszenzbilder unter Verwendung der geeigneten Anregung für die verwendeten Fluorophore zu erfassen. Scannen Sie dann Proben, um genügend Bilder zu erhalten, um eine vollständige Abdeckung des Gewebeabschnitts zu erhalten. Passen Sie am Ende des Scans die nuklearen Segmentierungsparameter der Software an, um sicherzustellen, dass die Kerne optimal getrennt sind, und ändern Sie die Schwellenintensität, um eine optimale Gating der HNF4-alpha-positiven Hepatozyten und HNF4-alpha-negativen nicht-parenchymalen Zellen zu gewährleisten.

Für die nukleare Quantifizierung, setzen Sie den Kernbereich in quadratische Mikrometer basierend auf der Hoechst Färbung, die wichtigste nukleare Hoechst-Intensität, den nuklearen Dehnungsfaktor, den mittleren nuklearen Rundungsindex, den HNF4-alpha-Status und die nuklearen X- Y-Koordinaten basierend auf dem Schwerpunkt. Um eine Hepatozyten-Kernploidie-Analyse durchzuführen, laden Sie zuerst das Ploidy-Quantifizierungsanalyseprogramm herunter und installieren Sie es. Navigieren Sie in MATLAB zur Registerkarte App des Toolstrips, und klicken Sie auf App installieren.

Öffnen Sie das Ploidy Application ML App Install-Programm. Es wird eine Meldung angezeigt, um die erfolgreiche Installation zu bestätigen. Fügen Sie in jede Datenanalysedatei ein Blatt mit dem Namen "Zellmessungen" ein, das alle für die Ploidy-Analyse erforderlichen Daten enthält, die in den angegebenen Spalten angegeben sind.

Stellen Sie für jede Versuchsbedingung einen Kontrolldatensatz bereit, der zur Berechnung der internen Steuerung für die Kalibrierung der Kernploidie von zwei bis vier N verwendet wird. Speichern Sie bei biologischen Replikationen jede Kalkulationstabelle in einem eigenen Ordner, indem Sie die Ordnerpräfixe inkrementell benennen. Als Nächstes starten Sie die Ploidy-Anwendung.

Die grafische Benutzeroberfläche der Anwendung Ploidy wird angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Pfad zum Steuern von Daten, um zu dem Ordner zu navigieren, in dem sich die Steuerelementdaten replizieren. Dieser Datenpfad wird dann in der Schnittstelle angezeigt.

Geben Sie im Ordnerpräfix den Namen ein, der den Ausgabedateien gegeben werden soll. Klicken Sie auf die Schaltfläche Pfad zu anderen Daten, und navigieren Sie zu dem Ordner, in dem sich die Vergleichsdaten replizieren. Dieser Datenpfad wird dann in der Schnittstelle angezeigt.

Klicken Sie dann auf Ausführen. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, liest die Statusleiste Analysis Complete. Nach der Immunkennzeichnung ist es wichtig, alle Dias durch herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie zu überprüfen, um zu bestätigen, dass eine gute Qualität der Fixierung und Färbung erhalten wurde.

Das Abwischen oder Verwischen des Hoechst-Farbstoffs kann auf eine unzureichende Fixierung oder Probendegradation vor der Fixierung hindeuten. Die nukleare Segregation und die HNF4-alpha-Schwellenwertparameter sollten vor der automatischen Bildanalyse sorgfältig optimiert werden, um das visuelle Muster der Immunfärbung, das durch die Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wird, weitgehend widerzuspiegeln. Nach der Bildanalyse sollten die Daten die steigende Anzahl nicht-parenchymaler Zellen und die kleine, aber signifikante Verringerung der HNF4-alpha-positiven Kernkerne in der Leber mit DDC-Verletzung widerspiegeln.

In gesunden Kontrolllebern weisen ca. 63% der HNF4-alpha-positiven Kerne eine einfache kreisförmige Morphometrie auf. Der Vergleich der relativen Kernploidie zwischen Kontroll- und DDC-behandelten Gruppen sollte einen signifikanten Verlust von 2C- und 4C-Hepatozytenkernen mit Verletzungen sowie eine erhöhte Anzahl von mehr als 8C-Zellen widerspiegeln. Die relativen Positionsinformationen für jede Ploidy-Untergruppe können durch Abrufen der 2D-Position bestimmter Hepatozyten-Teilmengen innerhalb der Bildanalysesoftware mit hohem Inhalt abgefragt werden.

Die Immunkennzeichnung mit zusätzlichen Antikörpern, wie Ki-67, kann durchgeführt werden, um die Zellreplikation zu bewerten, und die Daten der Hepatozyten-Kernmorphometrie können weiter abgefragt werden, um die Ploidie-Analyse zu ergänzen. Das durch diese Methode erzeugte gewebeweite Ploidy-Profil beschreibt den minimalen DNA-Gehalt für alle kreisförmigen Hepatozytenkerne, unterscheidet aber nicht zwischen mononukleären Zellen und binukleären Hepatozyten. Die Methode kann potenziell an Parameter wie Zellperimeter angepasst werden, um die Identifizierung binuklearer Zellen zu erleichtern und eine zusätzliche Auslesung der zellulären Ploidie bereitzustellen.