High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis
15. Oktober 2019
Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.
Das zentrale Ziel für die Entwicklung der csBN-MS-Technik war der umfassende Zugang zur Organisation und Montage von Proteinkomplexen, die der Signaltransduktion an und über die Plasmamembran verschiedener Gewebe- und Organtypen zugrunde liegen. csBN-MS bietet derzeit die höchste Auflösungsvielfalt für die Analyse des nativen Proteinkomplexes und deren Zusammensetzung, insbesondere in Bezug auf Membranproteine. Obwohl die csBN-MS-Technik entwickelt wurde, um komplexe Mischungen von Membranprotein-Baugruppen im Nagetierhirn zu analysieren, kann sie leicht an die Analyse jeder Art von biologischer Probe angepasst werden.
Einer der wichtigsten Schritte unserer Methode ist die Einbettung des Gelstücks und seine korrekte Ausrichtung auf die Schnittebene vor dem Schneiden. Achten Sie darauf, das Gel nicht zu zerreißen oder zu komprimieren und sicher zu sein, dass es nicht auf die Schnittebene geneigt ist, da dies die Auflösung der Analyse reduzieren würde. Unsere csBN-MS-Technik verfügt über mehrere praktische Schritte, die für gute Ergebnisse entscheidend sind.
Es ist einfacher zu zeigen, wie diese Schritte im Detail ausgeführt werden, als sie einfach zu beschreiben. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen rührenden Zweikammer-Gradientenmischer, der von einer Pumpe angetrieben wird, um ein lineares oder ein hyperbolisches Porengradientengel zu gießen. Bereiten Sie Lösungen für die vordere Mischkammer und Reservoirkammer vor, wie im Textprotokoll beschrieben.
Starten Sie den Rührer und fügen Sie 30 Mikroliter APS und 2,5 Mikroliter TEMED in die Lösung in der vorderen Kammer hinzu. Starten Sie dann die Pumpe und öffnen Sie das Vorderventil. Nach etwa einer Minute 90 Mikroliter APS und fünf Mikroliter TEMED in die Reservoirkammer geben und den Kammeranschluss öffnen.
Lassen Sie das Gel mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur langsam und gründlich polymerisieren, um einen homogenen Porengrößengradienten zu erzeugen. Bei Feuchtgehalten kann das polymerisierte Gel bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius aufrecht gelagert werden. Als nächstes bereiten Sie die Ladeschlitze vor, indem Sie die entsprechenden Leerzeichen zwischen den Glasplatten einlegen, um zwischen 0,5 und 2,0 Milligramm Protein zu trennen.
Die Schlitze sollten mindestens drei Zentimeter breit sein. Für laufende Puffer einen stehenden Kathodenpuffer vorbereiten, der aus 50 Millimolar-Tricin, 50 Millimolar-Bis-Tris und 0,01%Coomassie G-250 besteht. Bereiten Sie einen Standard-Anodenpuffer vor, der aus 50 Millimolaren Bis-Tris besteht.
Solubilisieren Sie ca. 2,5 Milligramm Membran und zwei Milliliter Löslichkeitspuffer, der 1%nicht-denaturierendes Reinigungsmittel auf Eis für 30 Minuten enthält. Dann Ultrazentrifugieren bei 130. 000 mal G für 11 Minuten. Konzentrieren Sie das Solubilisate auf einen kurzen 50%20%Sucrose-Schrittgradienten durch Ultrazentrifugation bei 400. 000 mal G für eine Stunde.
Danach ernten Sie den Saccharosegradienten von der Unterseite des Rohres, fügen Sie 0,05%Coomassie G-250 zum Solubilisate hinzu und laden Sie die Probe auf das Gel. Führen Sie einen präparativen BN-PAGE bei 10 Grad Celsius über Nacht mit einem dreistufigen Spannungsprotokoll aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem das Gel ausgeführt wurde, scannen Sie die Gele zu Dokumentationszwecken und halten Sie es zwischen den Glasplatten.
Prüfen Sie die Qualität der Geltrennung. Als nächstes, dissemble die Platten und Verbrauch die Spur Abschnitte von Interesse. Fixieren Sie die Bahnen zweimal mit 30% Ethanol und 15% Essigsäure für mindestens 30 Minuten.
Übertragen Sie die Probe des Einbettmediums und lassen Sie sie mindestens zwei Stunden einweichen und aushalten, während die Gelplatte in Zeitlupe auf einem Orbital-Shaker gehalten wird. Schneiden Sie dann die festen Gelspuren in Abschnitte genau parallel zur Proteinmigrationsfront oder dem Bandmuster. Platzieren Sie jeden Abschnitt auf einer Kunststofffolienstütze mit gleichen Abmessungen für eine einfachere Handhabung.
Übertragen Sie die Fahrspuren in ein offenes Rohr mit Stopfen, die unten geschlossen und oben zentral perforiert sind, beide präzise am oberen und unteren Ende des Gelabschnitts ausgerichtet. Tauchen Sie den Zylinder kurz in den flüssigen Stickstoff, um die Erstarrung schnell einzuleiten. Das transparente Einbettmedium verfestigt sich innerhalb von Sekunden und wird weiß in der Farbe.
Füllen Sie den Hohlraum mit einbettendem Medium, tauchen Sie den Zylinder kurz in flüssigen Stickstoff und lassen Sie ihn dann bei minus 20 Grad Celsius mehrere Stunden gründlich einfrieren. Nach der Demontage die Kunststofffolie entfernen und den Block mit dem eingebetteten Gelabschnitt in einen gekühlten Metallzylinder übertragen. Der Zylinder ist größer im Durchmesser und außen mit Einbettmedium abgedichtet.
Es wird auf einem flachen Träger platziert. Füllen Sie den Zylinder mit einbettendem Medium und frieren Sie gründlich ein, wie bereits erwähnt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der anderen Seite des Zylinders, um einen festen Block mit einer koplanaren Bodenfläche zu erhalten.
Entfernen Sie dann den Block aus dem Zylinder und verwenden Sie ein einbettendes Medium, um ihn an einen vorgekühlten Metallhalter zu kleben. Stecken Sie den Metallhalter in die Kryomaschine. Der Halter muss sorgfältig auf die Schnittebene ausgerichtet werden.
Lassen Sie den Block auf die optimale Temperatur für den Schneidprozess ausdemivieren. Nach dieser Ernte schneidet das Gel nacheinander mit einer endgültigen gewünschten Dicke von 0,25 Millimetern Schrittgröße und überträgt sie einzeln in Reaktionsröhrchen mit geringen Proteinbindungseigenschaften. Anschließend werden die Scheiben einer tryptischen Verdauung und massenspektrometrischen Analyse unterzogen.
Dieses Protokoll erweitert die Anwendung von hochauflösendem Complexome-Profiling auf nicht-mitochondriale Membranen, die wenig reichliche Proteine exdrücken. Komplexe Trennung zeigt stark gefärbte Proteinbänder mit sehr wenig Migrationsartefakten. Abweichungen von Peptidsignalen in Masse und Retentionszeit deuten auf eine sehr niedrige Rate bei falsch positiver Spitzenvolumenzuweisung hin.
Run-to-Run-Variationen werden durch neu skalieren der Spitzenvolumen-Datensätze leicht eliminiert. Die resultierenden Peptidintensitätsinformationen werden dann verwendet, um 2545 Proteinprofile relativer Häufigkeit zu rekonstruieren. Die Relevanz der Größe der Gel-Probenahme-Schrittgröße für die Auflösung von Proteinkomplexen wurde durch Das Verbinden von Datensätzen benachbarter Slices bewertet.
Mit 0,25 Millimetern stimmt die Größentrennung der TPC1-assoziierten komplexen Populationen gut mit den Ergebnissen der Western Blot-Analyse überein. Durch die Verbindung von mehr als zwei Scheiben wird die Diskriminierung komplexer TPC1-Teilpopulationen abgeschafft. Schließlich liefert die Analyse Informationen über gut charakterisierte Komplexe und zeigt die Existenz neuartiger Untereinheiten und komplexer Baugruppen.
Für Ferritin deuten die um ihre relative Häufigkeit bereinigten Untereinheitsprofile auf die Existenz von mindestens drei komplexen Isoformen mit ausgeprägten schweren/leichten Kettenstoichiometrien hin. Nicalin-Nomo1-Komplexe, der Gamma-Sekretase-Kernkomplex und die GPI-Transamidase-Maschinen weisen dagegen feste Häufigkeitsverhältnisse ihrer Kernuntereinheiten über den gesamten Größenbereich auf und sind unabhängig von der Assoziation mit zusätzlichen Proteinen. Der Schlüsselparameter der csBN-MS-Analyse ist die effektive Auflösung von Komplexen, die durch Probenbiochemie, BN-Gelqualität, richtige Ausrichtung beim Einbetten und Schneiden und Qualität der erfassten MS-Daten bestimmt wird.
Das Kombinieren von csBN-MS mit der Isotopenkennzeichnung von Proteinen und Proben ermöglicht einen direkten Vergleich von Komplexstoffen in verschiedenen pathophysiologischen, biologischen oder Entwicklungszuständen. csBN-MS, das an Membranen des Nagetierhirns durchgeführt wurde, zeigte die enorme Vielfalt von Rezeptoren, Ionenkanälen und Transportern in Bezug auf ihre Zusammensetzung der Untereinheit und ihre Funktion, und es wird für die Analyse der 3D-Struktur in nativen Präparaten von entscheidender Bedeutung sein.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein vielseitiges Kryoschneide-BN-MS-Protokoll unter Verwendung eines Mikrotoms für die hochauflösende Komplexomanalyse vor. Die Methode ermöglicht eine detaillierte Analyse von Protein-Komplexen, die an der Signaltransduktion in verschiedenen biologischen Proben beteiligt sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biokemie
- Proteomik
Hintergrund
- Die csBN-MS-Technik ermöglicht eine hochauflösende Analyse nativer Protein-Komplexe.
- Ursprünglich für das Nagetiergehirn entwickelt, kann sie an andere biologische Proben angepasst werden.
- Sie konzentriert sich auf Membranproteine und deren Assemblierung in Geweben.
- Sie erfordert eine sorgfältige Vorbereitung und Handhabung von Gelelektrophoreseproben für optimale Ergebnisse.
Zweck der Studie
- Verbesserung des Verständnisses der Organisation und Assemblierung von Proteinkomplexen.
- Vorstellung eines detaillierten Protokolls zur Analyse von Membranprotein-Assemblierungen.
- Erweiterung der hochauflösenden Komplexomanalyse auf Proteine mit geringer Abundanz.
Verwendete Methoden
- Herstellung von linearen oder hyperbolischen Porengradientengelen.
- Ultrazentrifugation zur Solubilisierung und Konzentrierung von Membranproteinen.
- BN-PAGE zur Proteintrennung, gefolgt von der Schnittentnahme aus dem Gel.
- Massenspektrometrische Analyse von tryptischen Verdauungsproben aus Gelschnitten.
Hauptergebnisse
- Hochauflösende Trennung von Protein-Komplexen mit minimalen Artefakten.
- Präzise Rekonstruktion von Proteinprofilen basierend auf Peptid-Intensität.
- Beurteilung des Einflusses der Schrittgröße bei der Gelextraktion auf die Auflösung von Komplexen.
- Erfolgreiche Anpassung der Methode für verschiedene biologische Proben.
Schlussfolgerungen
- Das csBN-MS-Protokoll verbessert die Komplexomanalyse erheblich.
- Es ermöglicht eine detaillierte Analyse von Membranproteinen in verschiedenen Geweben.
- Die Methodik kann effektiv zur Untersuchung schwach abgereicherter Proteine angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das hochauflösende Komplexom-Profilen schließt die entscheidende Lücke im Verständnis der Organisation von Membranproteinkomplexen, die für die Zielvalidierung in Signaltransduktionswegen unerlässlich ist. Indem die Methode eine unvoreingenommene Detektion seltener Membranproteine und ihrer Assemblierungszustände ermöglicht, unterstützt sie die mechanistische Entschärfung von Risiken in der frühen Entdeckungsphase. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit bei Portfolioentscheidungen, die membranassoziierte Zielstrukturen wie Ionenkanäle und Transporter betreffen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Aufklärung der Zusammensetzung und Stöchiometrie nativer Protein-Komplexe.
- Operationaler Wert: Bietet funktionelle Zielvalidierung durch Nachweis einheitlicher, selten vorkommender Membranproteine wie intrazellulärer Ionenkanäle.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch Aufdeckung von Komplexbildungsmustern und Glykosylierungs-Isoformen, die Aufschluss über die Arzneimittelwirksamkeit des Targets geben.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem quantitative Proteinprofile aus komplexen Trennungen bereitgestellt werden.
- Reproduzierbarkeit: Gewährleistet die Standardisierung des Assays durch Korrektur von Lauf-zu-Lauf-Variationen mittels Neuskalierung der Peak-Volumendaten.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform in verschiedenen biologischen Systemen aufgrund der Anpassungsfähigkeit von csBN-MS an jeden Probentyp.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem neuartige Untereinheiten und komplexe Zusammensetzungen identifiziert werden, die mit unabhängigen biochemischen Analysen übereinstimmen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungsprozesse, indem feste Mengenverhältnisse in den zentralen Untereinheiten von Komplexen wie der Gamma-Sekretase nachgewiesen werden, was auf stabile Zielstrukturen hinweist.
- Mechanistische Risikominderung: Konzentriert sich auf den Vorhersagewert, indem isoformspezifische Stöchiometrien in Komplexen wie Ferritin aufgezeigt werden, wodurch Unsicherheiten im Verhalten der Zielstrukturen verringert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Validierung, insbesondere für Membranproteine als Zielstrukturen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Auflösung von Protein-(Super)komplexen und ihrer Untereinheitenzusammensetzung in nativen Zuständen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch hochauflösende Trennung mit minimalen Migrationsartefakten und genauer Rekonstruktion der Peptidintensitäten.
- Analytik: Liefert quantitative Messungen und statistische Auswertungen, die den Vergleich komplexer Populationen unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem krankheitsrelevante Komplettmuster in endosomenangereicherten Fraktionen nachgewiesen werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Methode zur Komplexom-Profilierung über verschiedene Gewebe und pathophysiologische Zustände hinweg, wenn sie mit Isotopenmarkierung kombiniert wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch umfassende und unvoreingenommene Identifizierung von Protein-Komplexen und Untereinheitenzusammensetzung.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch kontrolliertes Gel-Ausschneiden und Neuskalierung der MS-Daten.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unklarheiten bei der Validierung von Membranproteintargets.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung basierend auf Dynamik der Komplexbildung und isoformspezifischer Abundanz.
Durchführungsüberlegungen
- Es sind Fachkenntnisse in nativer PAGE, Kryoschneiden und Massenspektrometrie erforderlich, um eine optimale Auflösung der Komplexe zu erreichen.
- Zur Ausrüstung gehören Gradientenmischer, Ultrazentrifugen, BN-PAGE-Systeme, Kryoschneidmikrotome und hochauflösende Massenspektrometer.
- Die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hängt von einer konsistenten Gelelektrophorese, exakter Einbettungsausrichtung und Kalibrierung der Schneidebene ab.
- Die Anpassungsfähigkeit auf verschiedene Modellsysteme ergibt sich aus der Anwendbarkeit der Methode auf jede biologische Probenart.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die sorgfältige Handhabung der Gele, um Einrisse oder Kippungen zu vermeiden, die die Auflösung beeinträchtigen würden.
