Name: High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Erfahren Sie die hochauflösende Komplexom-Profiling-Methode csBN-MS zur Analyse nativer Protein-Komplexe und Membranproteine. Dieses Protokoll ermöglicht detaillierte Einblicke in Signaltransduktionsprozesse in verschiedenen Geweben.

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Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) – Projekt-ID 403222702 – SFB 1381 und im Rahmen der Exzellenzstrategie CIBSS - EXC-2189 - Projekt-ID 390939984 unterstützt. Wir danken Katja Zappe für die technische Unterstützung.

1. Präparative BN-PAGE
<ol><li>Gelzubereitung<ol>
<li>Verwenden Sie ein mittelgroßes vertikales Gelelektrophoresesystem (>10 cm Geltrennabstand; 14 cm x 11 cm, 1,5 mm Abstandsabstand) mit effektiver Kühlung auf 10 °C.</li>
		<li>Gegossenes lineares oder hyperbolisches Porengradientengel (1,5-3,0 mm Abstandshalter) mit einem rührenden Zweikammer-Gradientenmischer, der von einer Pumpe angetrieben wird (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien). Im vorgestellten Beispiel (lineares Gradientengel 1%-13%):<ol>
<li>Bereiten Sie eine 13 ml Lösung für die vordere (Misch-)Kammer vor, die aus: 13% Acrylamid (aus 30% Stammlösung, 37,5:1,0 Acrylamid:Bisacrylamid), 0,75 M Aminocaproinsäure, 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0) und 10% Glycerin besteht.</li>
			<li>Bereiten Sie eine 10 ml Lösung für die Reservoirkammer vor, die aus: 1% Acrylamid (aus 30% Stammlösung, 37,5:1,0 Acrylamid:Bisacrylamid), 0,75 M Aminocaproinsäure, 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0) und 0,2% CL-47-Waschmittel besteht.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Starten Sie den Rührer und fügen Sie 30 Mikroliter APS (Ammoniumperoxodisulfat, 10% Stammlösung) und 2,5 l TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) und 2,5 Mikroliter TEMED in die Lösung in der vorderen Kammer hinzu. Starten Sie die Pumpe und öffnen Sie das Vorderventil (der Durchfluss sollte in 10 min auf den kompletten Guss eingestellt werden). Nach 1 min fügen Sie der Lösung in der Reservoirkammer 90 l APS und 5 l TEMED hinzu und öffnen Sie den Kammeranschluss.</li>
		<li>Lassen Sie das Gel langsam, aber gründlich für mindestens 24 h bei Raumtemperatur (RT) polymerisieren, um einen homogenen Porengrößengradienten zu erzeugen. Bei Feuchtgehalten kann das polymerisierte Gel bis zu 1 Woche lang bei 4 °C aufrecht gelagert werden. HINWEIS: Absichtlich wird die Oberseite des Gels eine weiche/schleimige Konsistenz haben. Dies wird später entfernt, ermöglicht aber einen reibungslosen Eintritt von Proteinen in das Gel, mit minimalem Risiko von Proteinfällungen, die andernfalls zu Migrationsartefakten (d. h. Streifen oder Proteinfällungen) führen könnten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Probenvorbereitung und -beladung<ol>
<li>Vorbereiten von Ladeschlitzen durch Einsetzen geeigneter Abstandshalter (z. B. Siliziumrohre) zwischen die Glasplatten zum Trennen von 0,5-2,0 mg Protein. Die Schlitze sollten mindestens 3 cm breit (oder besser, 5-6 cm breit) sein.</li>
		<li>Löslichkeits-2,5 mg Membran (Mausnieren-Endosome-angereichertes Präparat) in 2 ml Löslichkeitspuffer mit 1% (w/v) nicht-denaturing Waschmittel (ComplexioLyt CL-47) für 30 min auf Eis. Ultrazentrifugate (Sedimentationsabschaltung = 200 S oder weniger; 130.000 x g/11 min wird hier verwendet).</li>
		<li>Konzentrieren Sie das Solubilisate auf einen kurzen 50%/20% (w/v, je 0,3 ml) Saccharoseschrittgradient durch Ultrazentrifugation für 1 h bei 400.000 x g. Die endgültige Proteinausbeute sollte mindestens 1 mg betragen.</li>
		<li>Fügen Sie 0,05% (w/v) Coomassie G-250 zum Solubilisate hinzu und laden Sie die Probe auf das Gel. Beschränken Sie die Proteinbelastung auf einen 2-G-Gel-Spurquerschnitt von 10-15 g/mm, um eine hohe Auflösung zu erzielen und Artefakte zu vermeiden, die durch Proteinfällungen entstehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BN-PAGE Laufbedingungen<ol>
<li>Für laufende Puffer einen Standardkathodenpuffer aus 50 mM Tricin, 15 mM Bis-Tris und 0,01% Coomassie G-250 vorbereiten. Bereiten Sie einen Standard-Anodenpuffer vor, der aus 50 mM Bis-Tris (pH = 7.0) besteht.</li>
		<li>Führen Sie eine präparative BN-PAGE bei 10 °C über Nacht mit einem dreistufigen Spannungsprotokoll13 aus: einer Ausgleichsphase für 30 min bei 100 V, dann einer langsamen (3 h) Rampe bis zur maximalen Spannung (40-50 V/cm Gellänge), die schließlich für mindestens 6 h für Endpunktfokussierung von Proteinen. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Elektrophorese zu unterbrechen, wenn die Migrationsfront die Mitte des Gels erreicht hat, und den Kathodenpuffer ohne Coomassie G250 gegen einen frischen Puffer auszutauschen. Dies hilft, Niederschlagsartefakte im Gel zu vermeiden, die durch den lokalen Zusammenbruch der Matrixporenstruktur entstehen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gelprobenahme und -verdauung
<ol><li>Exzision von Gelspuren<ol>
<li>Scannen Sie die Gele nach dem Lauf zu Dokumentationszwecken, während Sie sie zwischen den Glasplatten aufbewahren.</li>
		<li>Zerlegen Sie die Platten und verbrauchen Sie die Fahrspurabschnitte von Interesse.</li>
		<li>Nehmen Sie einen Probenstreifen der Spur zur Analyse durch 2D BN/SDS-PAGE und Proteinfärbung oder Western Blotting (siehe Abbildung 1B), um Interessenbereiche, effektive komplexe Größenauflösung und Proteinreichtum zu bestimmen.</li>
		<li>Fix ausgewählte Gelspuren zweimal für mindestens 30 min mit 30% (v/v) Ethanol und 15% (v/v) Essigsäure.</li>
		<li>Übertragen Sie die Probe auf das Einbettmedium und lassen Sie sie mindestens 2 h bei 4 °C einweichen und aushalten, während die Gelplatte in Zeitlupe auf einem Orbital-Shaker gehalten wird. HINWEIS: Die Geltrennung sollte sorgfältig auf die Gesamttrennqualität und Migrationsartefakte überprüft werden. Gelbänder, die dominante Proteine darstellen, sollten verzerrungsfrei und homogen in der Intensität sein. Lokale Artefakte auf dem Gel sollten ausgeschnitten oder aus der Analyse herausgelassen werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Einbettung und Kryomikrotome Schneiden HINWEIS: Dies ist eine verbesserte Version des zuvor beschriebenen und fotodokumentierten Einbettungsverfahrens, das das Einbetten und Schneiden breiterer Gelspuren von bis zu 8 cm11ermöglicht.<ol>
<li>Schneiden Sie zunächst feste Gelspuren in Abschnitte (hier 3 cm) genau parallel zum Proteinmigrationsfront-/Bandmuster. Zur einfacheren Handhabung legen Sie jeden Abschnitt auf eine Kunststofffolienstütze mit gleichen Abmessungen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Fahrspuren in ein offenes Rohr mit Stopfen (auf der Unterseite geschlossen, zentral perforiert auf der Oberseite, beide präzise mit dem oberen und unteren Ende des Gelabschnitts ausgerichtet).</li>
		<li>Tauchen Sie den Zylinder kurz in flüssigen Stickstoff, um die Erstarrung schnell zu initiieren. Das transparente Einbettmedium verfestigt sich innerhalb von Sekunden und wird weiß in der Farbe.</li>
		<li>Füllen Sie den Hohlraum mit einbettendem Medium, tauchen Sie ihn kurz in flüssigen Stickstoff und frieren Sie den Zylinder mehrere Stunden bei -20 °C ein. HINWEIS: Eine schnelle Kühlung des Zylinders durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff hilft, eine Verschiebung der Gelplatte innerhalb des Rohres zu vermeiden. Verzerrungen sollten vermieden werden, um eine hohe Auflösung in der folgenden MS-Analyse zu gewährleisten.</li>
		<li>Nach der Demontage die Kunststofffolie entfernen und den Block mit dem eingebetteten Gelabschnitt auf einen gekühlten, größeren Durchmesser übertragen, Metallzylinder auf einem flachen Träger (d.h. Petrischale) platziert und mit Einbettmedium an der Außenseite des Zylinders versiegelt. Füllen Sie den Zylinder mit einbettendem Medium und einfrieren Sie gründlich.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der anderen Seite des Zylinders, um einen festen Block mit koplanaren Flächen zu erhalten.</li>
		<li>Entfernen Sie den Block aus dem Zylinder, kleben Sie ihn mit einbettendem Medium auf einen vorgekühlten Metallhalter und stecken Sie den Halter in die Kryoilicing-Maschine (Kryotome). Die Oberfläche des Blocks muss sorgfältig in Bezug auf die Schnittebene ausgerichtet werden. Lassen Sie es bei der optimalen Temperatur für den Schneidprozess ausdemivieren (hier -15 °C). HINWEIS: Verwenden Sie einen langsam fortschreitenden manuellen Schneidzyklus von 0,1 mm Schrittgröße, bis Sie die Oberfläche des eingebetteten Gelabschnitts treffen, um eine korrekte Positionierung zu gewährleisten.</li>
		<li>Die Gelscheiben nacheinander mit einer endgültigen gewünschten Dicke von 0,25 mm Schrittgröße ernten und einzeln in Reaktionsröhrchen mit geringen Proteinbindungseigenschaften übertragen. HINWEIS: Bei diesem Aufbau können gleichmäßige Gelscheiben leicht bis zu 0,1 mm und bis zu 0,5 mm dicke Gelscheiben erhalten werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Tryptische Verdauung<ol>
<li>Führen Sie die tryptische Verdauung in-Gel nach dem ausgiebigen Waschen der Gelscheiben (mindestens drei zusätzliche Waschrunden werden empfohlen, um polymere Komponenten des Einbettmediums zu entfernen) nach einem Standardverfahren11vor.</li>
		<li>Vakuumtrocken eluierte Peptide und lösen sich in 0,5% (v/v) Trifluoressigsäure durch Schütteln bei 37 °C (10 min) auf, gefolgt von Badbeschallung (5 min) und kurzer Zentrifugation.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Massenspektrometrie
<ol><li>nanoHPLC und MS-Einrichtung<ol>
<li>Last verdaute Proben auf eine C18-Vorspalte (Partikelgröße = 5 m; Durchmesser = 300 m) mit 0,05% (v/v) Trifluoressigsäure mit einem (split-free) Nano-HPLC gekoppelt an ein Massenspektrometer mit hoher Auflösung.</li>
		<li>Elute erfasste Peptide mit wässrig-organischem Gradient (Eluent A): 5 min 3% B, 120 min von 3% B bis 30% B, 20 min von 30% B bis 99% B, 5 min 99% B, 5 min von 99% B bis 3% B, 15 min 3% B (Durchflussrate = 300 nL/min). HINWEIS: csBN-MS-Gelscheiben führen in der Regel zu Proben mit geringer bis mittlerer Peptidfülle und einem begrenzten Grad an Komplexität. NanoLC-MS/MS-Analysen sollten daher mit einer Einrichtung durchgeführt werden, die eine angemessene Empfindlichkeit und Sequenzierungsgeschwindigkeit, hohe Massenauflösung (>100.000) und maximalen Dynamikbereich (effektiv 3-4 Größenordnungen) bietet. Es sind jedoch keine langen Säulenabmessungen oder Elutionsgradienten erforderlich, die über 3 h hinaus verlängert werden.</li>
		<li>Getrennte eluierte Peptide in einem Emitter (d.h. 75 m; Spitze = 8 m) manuell verpackt ca. 20 cm mit C18-Material (Partikelgröße = 3 m). Elektrospray die Proben bei 2,3 kV (positiver Ionenmodus) in die beheizte Transferkapillare (250 °C) des Massenspektrometers.</li>
		<li>Durchführen von Analysen mit den folgenden Instrumenteneinstellungen11: maximale MS/MS-Injektionszeit = 400 ms; Ausschlussdauer = 60 s; Mindestsignalschwelle = 5.000 Zählungen, Top-10-Vorläufer fragmentiert; Isolationsbreite = 1,0 m/z). ANMERKUNG: Um die Kalibrierung von Masse, Retentionszeit und Zuweisung von Peptidsignalen in einer großen Anzahl von Datensätzen oder Messungen zu erleichtern, wird empfohlen, die entsprechenden MS-Messreihen ohne Unterbrechungen oder Änderungen von Parametern und Hardware durchzuführen ( d. h. auf derselben C18-Säule/Emitter).</li>
	</ol></li>
	<li>Proteinidentifikation (MS-Daten, wie zuvor beschrieben11)<ol>
<li>Extrahieren Sie Spitzenlisten aus Fragmentionenspektren mit dem Werkzeug "msconvert.exe" (Teil von ProteoWizard).</li>
		<li>Verschieben Sie alle Vorläufer-m/z-Werte für jedes Dataset durch den medianen m/z-Offset aller Peptide, die Proteinen in einer vorläufigen Datenbanksuche mit 50 ppm Peptidmassentoleranz zugeordnet sind.</li>
		<li>Suchen Sie die korrigierten Spitzenlisten mit einer geeigneten Suchmaschine (hier Maskottchen 2.6.2) mit allen Mauseinträgen der UniProtKB/Swiss-Prot Datenbank (Release 2018_11).</li>
		<li>Wählen Sie "Acetyl (Protein N-term)", "Carbamidomethyl (C)", "Gln | pyro-Glu (N-Term Q), Glu | pyro-Glu (N-Term E)", "Oxidation (M)" und "Propionamid (C)" als variable Modifikationen.</li>
		<li>Stellen Sie die Peptid- und Fragmentmassentoleranz auf 5 ppm bzw. 0,8 Da fest, und lassen Sie eine verpasste tryptische Spaltung zu. Legen Sie den Erwartungswert-Cut-off für die Peptididentifikation auf 0,5 oder weniger fest. Verwenden Sie eine Decoy-Datenbanksuche, um die falsch positive Ermittlungsrate (FDR) zu ermitteln. Legen Sie die FDR auf 1 % fest oder wenden Sie zusätzliche Qualitätskriterien an, um eine zuverlässige Identifizierung zu gewährleisten. HINWEIS: Das vorgestellte Experiment identifizierte mehr als 3.500 Proteine mit einer durchschnittlichen Peptid-FDR von 4,4 x 0,77 % (n = 101 Scheibenproben) oder 3.000 Proteinen, wenn Peptid FDR auf 1 % eingestellt wurde. Wichtig ist, dass strengere Kriterien für die Auswahl von profilierten Proteinen verwendet wurden (2.568). Es umfasste alle Proteine, die mit mindestens zwei Peptiden identifiziert wurden, von denen mindestens eines proteinspezifisch ist, in mindestens einer der 101-Slice-Proben.</li>
	</ol></li>
	<li>Proteinquantifizierung<ol>
<li>Verwenden Sie Peptidsignalintensitäten (Spitzenvolumen [PVs]) für die Proteinquantifizierung, die aus FT-Vollscans gewonnen und mit entsprechender Software auf Retentionszeit und Massenverschiebungen korrigiert werden (hier MaxQuant v1.6.3).</li>
		<li>Richten Sie MS-Datasets nacheinander aus, um die Peptid-Elutionszeiten (Gesamtdurchschnitt) mithilfe der LOESS-Regression zu referenzieren. Weisen Sie PVs Peptiden entweder direkt (MS/MS-basierte Identifikation) oder indirekt (d. h. basierend auf ihrer übereinstimmenden m/z- und Elutionszeit innerhalb sehr enger Toleranzen) zu. HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet interne Software für die Zuweisung der "eingefügten" sogenannten Peptide. Eingestellte Parameter führen zu effektiven m/z- und Elutionszeit-Matching-Toleranzen von 2 ppm bzw. 1 min (siehe Abbildung 2A,B).</li>
		<li>Korrekt für systematische Run-to-Run-Variationen der Peptidlast und Ionisationseffizienz durch Peptidintensitätsneuskalierung, berechnet aus den medianen Unterschieden der relativen Peptidintensitäten zwischen benachbarten Slice-Proben (Abbildung 2C).</li>
		<li>Filtern Sie PV-Daten nach Ausreißern und verbleibenden falsch positiven Zuordnungen, die durch interne PV-Konsistenzanalysen identifiziert wurden.</li>
		<li>Normalisieren Sie PVs jedes Peptids auf ihre maximalen Werte über alle Slice-Datasets, die relative Peptid-Flussprofile ergeben.</li>
		<li>Schließlich berechnen Sie relative Proteinhäufigkeitsprofile als Durchschnittswerte von mindestens zwei (und bis zu sechs oder 50 %, welcher Wert höher ist) der am besten korrelierenden Peptidprofile über ein Fenster von drei aufeinanderfolgenden Scheiben. Dies ermöglicht die Überbrückung fehlender PV-Werte und die Reduzierung von Geräuschen. HINWEIS: Dies führte schließlich zu 2.545 (von 2.568 vorgewählten) Proteinprofilen (Abbildung 2D).</li>
	</ol></li>
	<li>Charakterisierung von Proteinkomplexen<ol>
<li>Analysieren Sie Proteinprofile, indem Sie zuerst die Spitzenerkennung mit der lokalen Maxima-Methode durchführen, und passen Sie nacheinander Normalverteilungen an diese Spitzen an, wodurch die Position (d. h. Slice-Index oder scheinbar komplexe Größe) ihrer Maxima und FWHM (volle Breite bei Halbmaximale Intensität) (Einset von Abbildung 4). HINWEIS: Im Dataset werden Profile automatisch mithilfe benutzerdefinierter Skripts analysiert. Die kleinsten FWHM-Werte sind bezeichnend für die effektive Größenauflösung des Ansatzes (hier 6 x 0,25 = 1,5 mm).</li>
		<li>Verwenden Sie Referenzproteinkomplexspitzen mit definierter Molekularmasse (wie in der UniProtKB/Swiss-Prot-Datenbank berichtet) für die lineare Regressionsanalyse der log10(vorhergesagte Molekularmasse)-Werte, um Slice-Zahlenindizes in scheinbare molekulare Größen (d. h. scheinbare komplexe Größe in kDa). ANMERKUNG: In dieser Studie wurden 23 Markerkomplexe in der Stichprobe ausgewählt (Abbildung 4), basierend auf (i) monodispersen Formen von Profilspitzen, (ii) experimenteller Unterstützung von Molekulargewichten und (iii) Verteilungen entlang der untersuchten BN-PAGE-Gelabschnitte.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).</li>
</ol>

Der Autor Uwe Schulte ist Mitarbeiter und Gesellschafter der Logopharm GmbH, die in dieser Studie verwendete ComplexioLyte 47 herstellt. Das Unternehmen stellt komplexe Reagenzien für akademische Einrichtungen auf gemeinnütziger Basis zur Verfügung.

Die vorgestellte Studie basiert auf der csBN-MS-Technik, die zuvor mit einer mitochondrialen Zubereitung11 bewertet wurde, und beinhaltete Verbesserungen bei der Probenvorbereitung, Gelverarbeitung und MS-Datenauswertung. Die fokussierte Analyse eines Abschnitts des großflächigen Separations-BN-PAGE-Gels lieferte einen umfassenden Satz von Daten, die Qualitätskennzahlen aufzeigten, die mit der Studie mit mitochondrialen Membranen vergleichbar sind. Massen- und Retentionszeitfehler sowie Lauf-zu-Lauf-Variationen wurden sehr gering gehalten und lieferten die Grundlage für die Bestimmung zuverlässiger Proteinhäufigkeitsprofile. Die Größenauflösung schien gut zu sein, mit halbmaximalen Spitzenbreiten von nur sechs Scheiben (entsprechend 1,5 mm, Abbildung 4) und relativen Größenunterschieden von weniger als 10 % gelöst (Abbildung 3, Abbildung 5A). Diese Werte entsprachen nicht vollständig der Größenauflösungsqualität der vorherigen csBN-MS-Analyse von Mitochondrien (trotz der ausgewählten kleineren Gel-Sampling-Schrittgröße), aber sie sind deutlich besser als die Leistung herkömmlicher BN-MS- oder Größenausschluss-MS nähert sich 20, die in letzter Zeit populär geworden sind.
Die Bedeutung einer hohen effektiven komplexen Größenauflösung wird durch das Simulationsexperiment in Abbildung 3 (mit DenPc1-assoziierten Komplexen) unterstrichen, das durch die 2D-BN/SDS-PAGE Western Blot-Analyse kaum aufgelöst werden kann (Abbildung 1B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das 0,25 mm-Schneiden in diesem Fall zu einigen Überstichproben geführt hat, aber es erwies sich dennoch als nützlich für die Beseitigung von "Quantifizierungsgeräuschen", ohne die effektive Größenauflösung zu beeinträchtigen. Daher ist im Einklang mit den bisherigen Ergebnissen11generell eine Stichprobenstufengröße von 0,3 mm zu empfehlen.
Insbesondere die Diskriminierung von TPC1-assoziierten Komplexen geht mit 1 mm Gelprobenahme vollständig verloren, was die kleinste Schrittgröße ist, die durch manuelles Schneiden in herkömmlichen BN-MS5,6bereitgestellt wird. Dies könnte die Tatsache erklären, dass trotz der Bereitstellung leistungsfähiger MS-Technologien nur sehr wenige Proteinkomplexe und Untereinheiten de novo durch Complexome-Profiling identifiziert wurden. Neben seiner guten Auflösungsleistung bietet csBN-MS eine hohe Vielseitigkeit. Membrangebundene Komplexe und lösliche Proteinkomplexe von 50 kDa bis zu mehreren MDa können in einem einzigen Experiment mit minimaler Vorspannung effektiv gelöst werden11. Dies steht im Gegensatz zu alternativen Trenntechniken, die für komplexe Profilierungen wie Größenausschluss oder Ionenaustauschchromatographie verwendet werden, die mit Teilmengen löslicher Proteine mit bestimmten Größenbereichen oder Ladungseigenschaften arbeiten. Auf der anderen Seite ist csBN-MS weniger skalierbar (maximale Belastung von 3 mg Protein pro Gel), kann technisch anspruchsvoll sein und kann nicht automatisiert werden.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass csBN-MS-basiertes Complexome-Profiling erfolgreich auf nicht-mitochondriale Ziele angewendet werden kann, aber auch einige damit verbundene Herausforderungen aufzeigen. Daher erfordern eine effiziente Extraktion und biochemische Stabilität von Proteinkomplexen mehr Optimierung und Reinigungsschritte und können dennoch begrenzt sein. Innerhalb des untersuchten Größenfensters war die Anzahl der gut fokussierten, monodispersen Proteinkomplexe im Vergleich zu einer mitochondrialen Probe in der Tat deutlich geringer (Daten nicht dargestellt). Es wird auch empfohlen, die BN-PAGE-Probenlasten zu senken, um eine akzeptable Geltrennung zu erhalten. Höhere Belastungen erfordern möglicherweise breitere Gelspuren, die für das Schneiden schwieriger zu verarbeiten sind (siehe begleitendes Video). Darüber hinaus war die Proteinkomplexität der Proben höher (etwa zweifach) als die mitochondrienabgeleiteten Scheibenverdauten, was zu mehr fehlenden PV-Werten und einem reduzierten Dynamikbereich führte. Tatsächlich fehlten einige kleine Proteine, die zu den in Abbildung 5 dargestellten Komplexen gehören sollten, in den Analysen. Diese Probleme können in Zukunft durch den Einsatz schnellerer und sensiblerer MS-Instrumente oder datenunabhängiger Erfassungsmodi gelöst werden.
Die Probenvorbereitung ist sehr wichtig für die Protein-Komplex-Retrieval-, Stabilitäts- und Geltrennungsqualität. Parameter und Verfahren sollten für jedes Quellgewebe, Zelllysat, Membran (Fraktion) und Proteinkomplex von Interesse optimiert werden. Es werden die folgenden allgemeinen Empfehlungen bereitgestellt, die zur Erweiterung von Anwendungen von csBN-MS beitragen können:
i) Die Vorbereitung von Proben frisch und die Vermeidung von Erwärmung/Einfrieren, starke Verdünnungen, Änderungen der Pufferbedingungen und unnötige Verzögerungen;
ii) Verwendung von Puffern, die im Wesentlichen salzfrei sind (ersetzen durch 500-750 mM Betain oder Aminocaproinsäure), etwa einen neutralen pH-Wert und einen Gehalt an bis zu 1 % (w/v) nicht abbauendem Reinigungsmittel (Protein:Waschmittel-Verhältnis zwischen 1:4-1:10 für die Löslichkeit der Membran Proteinkomplexe, kein Reinigungsmittel für lösliche Proteinkomplexe erforderlich);
iii) Sorgfältige Prüfung und Anpassung der Waschmittelbedingungen durch analytische BN-PAGE, da diese die Effizienz komplexer Löslichkeit, Darstellung von Membranproteinkomplexen in der Probe, Stabilität und Homogenität der Protein-Waschmittel-Mizellen. Letztere sind Voraussetzungen dafür, dass Proteine sich als unterschiedliche Bänder/komplexe Populationen auf BN-PAGE-Gele konzentrieren. Frühere Literatur bietet eine breite Palette von neutralen Waschmitteln. DDM (n-dodecyl -d-maltoside)1,2,4,5,6 und digitonin3,5,7,8, 9,10,13,18 waren bisher die beliebtesten Wahlmöglichkeiten für BN-MS-Analysen. Es muss betont werden, dass jeder Waschmittelzustand notwendigerweise einen Kompromiss zwischen der Löslichkeitseffizienz und der Erhaltung von Proteinwechselwirkungen darstellt und möglicherweise nicht für alle Arten von Zielprotein und Ausgangsmaterial gleichermaßen geeignet ist;
iv) Entfernen geladener Polymere wie Fibrillen, Filamente, Polylysin, DNA und reichlich niedermolekulare Bestandteile (d. h. Metaboliten, Lipide oder Peptide). Dies kann durch Ultrazentrifugation, Gelfiltration oder Dialyse erreicht werden. Dies ist besonders wichtig für Gesamtzell- oder Gewebelysate;
v) Zugabe von Coomassie G-250 (Endkonzentration 0,05%-0,1%) und Saccharose (zur Erhöhung der Beladungsdichte, Endkonzentration 10%-20% [w/v]) zur Probe kurz vor dem Laden, um durch kurze Ultrazentrifugation zu löschen, die Probe ohne Störung zu beladen und den Lauf unmittelbar danach zu starten.
Als Zukunftsperspektive bietet csBN-MS-basiertes Complexome-Profiling Optionen für Multiplexing, um Protein-Komplexe Dynamiken oder Veränderungen im Zusammenhang mit spezifischen biologischen Bedingungen zu untersuchen. Die kombinierte Trennung von metabolisch gekennzeichneten Proben, wie sie für die größenausschlussbasierte Profilierung21 vorgeschlagen wird, erscheint einfach, kann jedoch durch einen spontanen Austausch von Untereinheiten in Komplexen behindert werden, die unabhängig von der verwendeten Trennung auftreten. system. Alternativ können markierte Proben in benachbarten Gelspuren gelöst werden, die dann für die Differentialanalyse mit hoher Empfindlichkeit und Robustheit mitgeschnitten oder kombiniert werden können.

Die BN-PAGE-Trennung wurde zunächst direkt an die LC-MS-Analyse (BN-MS) durch die Forschungsgruppen Majeran1 und Wessels2 gekoppelt, indem BN-PAGE-Gelspuren manuell getrennt wurden. Ihre Analysen identifizierten eine Reihe von reichlich vorhandenen Membranproteinkomplexen mit bekannter Untereinheitszusammensetzung aus Pflanzlichen Plasmiden bzw. HEK-Zellmitochondrien. Diese Analysen waren jedoch alles andere als umfassend und ließen keine unvoreingenommene Identifizierung neuartiger Versammlungen zu. Die Leistung von Massenspektrometern und etikettenfreien Quantifizierungsmethoden hat sich seitdem deutlich verbessert, was umfassende BN-MS-Analysen ermöglicht hat. Dies hat den Begriff "complexome profiling" geprägt. So analysierten Heide und Kollegen rattenherzige Mitochondrien, die 464 mitochondriale Proteine identifizierten und gruppierten, wodurch viele bekannte Baugruppen bestätigt wurden. Darüber hinaus fanden sie TMEM126B als eine neuartige und entscheidende Untereinheit eines spezifischen Montagekomplexes3. Vergleichbare Ergebnisse (mit 437 mitochondrialen Proteinprofilen) wurden in einer parallelen Studie mit HEK-Zellmitochondrien4erzielt.
Trotz dieser Verbesserungen sind mehrere Probleme geblieben, die das volle Potenzial von BN-MS für complexome Profiling einschränken. Eine wesentliche Einschränkung ist die effektive Größenauflösung von Komplexen, die durch zwei Faktoren bestimmt wird: die (i) Qualität der BN-PAGE-Trennung, die von der Homogenität des Gelmatrix-Porengradienten sowie der Stabilität/Löslichkeit der Probenkomplexe abhängt, und (ii) Schrittgröße der Gelprobenahme, die bestenfalls 1 mm beträgt, wenn herkömmlichemanuelles Schneiden5,6verwendet wird. Eine schlechte Größenauflösung verfehlt nicht nur subtile komplexe Isoformen und Heterogenitäten, sondern wirkt sich auch negativ auf den Dynamikumfang und das Vertrauen von unvoreingenommener, de novo Subunit-Zuweisung und Quantifizierung aus.
Weitere Herausforderungen sind die Präzision der Proteinquantifizierung und die Abdeckung des tatsächlichen Dynamikbereichs von Proteinüberfluss in der Probe durch massenspektrometrische Analyse. Daher ist die Anwendung von BN-MS-Komplexprofiling weitgehend auf biologische Proben mit geringerer Komplexität, hoher Expression von Zielkomplexen und günstigen Löslichkeitseigenschaften (d. h. Plastiden, Mitochondrien und Mikroorganismen)6,7,8,9,10.
Kürzlich haben wir kryomikrotome-slicing-assisted BN-MS (csBN-MS) eingeführt, die präzise Submillimeter-Probenahme von BN-PAGE-Gelspuren mit umfassender MS-Analyse und aufwendiger MS-Datenverarbeitung zur Bestimmung von Proteinprofilen mit hohem Vertrauen11. Die Anwendung auf eine mitochondriale Membranpräparation von Rattengehirnen zeigte bisher eine unerfüllte effektive komplexe Größenauflösung und maximale Abdeckung von oxidativen Atemkettenkomplexen (OXPHOS) (d. h. 90 von 90 MS-zugänglichen). In diesem Beispiel wurden auch eine Reihe neuartiger Proteinassemblys identifiziert.
Beschrieben werden hier optimierte Verfahren für die präparative BN-PAGE-Trennung von Proteinkomplexen (nicht auf eine bestimmte biologische Quelle beschränkt), das Gießen großer präparativer BN-PAGE-Gele, das Kryomikrotom-Schneiden breiter Gelspuren und MS-Daten. verarbeitung. Die Leistungsfähigkeit der hochauflösenden Profilierung wird für ein proteinkomplexes Präparat aus mit Mausnieren endosomeangereicherten Membranen demonstriert. Schließlich werden die Vorteile einer zunehmenden Auflösung und Präzision der massenspektrometrischen Quantifizierung diskutiert.

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610158</td><td>Empfohlen für Acrylamid-Gradientengellösungen bis zu 13%</td></tr><tr><td>30% Acrylamid/Bis-Lösung, 19:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610154</td><td>Empfohlen für Acrylamid-Gradientengellösungen >13%</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td><td>Bio Rad</td><td>#1703127</td><td>Gesamtproteinfärbung auf Blot-Membranen; empfindlich und kompatibel mit Immundetektion</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Serva</td><td>Nr. 35050</td><td>Zentrifugen-Stammlösungen vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>ComplexioLyte 47</td><td>Logopharm</td><td>CL-47-01</td><td>Gebrauchsfertiger Detergenspuffer (1%) zur milden Solubilisierung von Membranproteinen</td></tr><tr><td>Einbettmedium / Gewebegefriermedium</td><td>Leica Biosystems</td><td>14020108926</td><td>Einbettmedium für Gelschnitte, die mit einem Kryomikrotom</td></tr> <tr><td>geschnitten werden sollenImmobilon-P Membran, PVDF, 0,45 &Mikro; m</td><td>Merck</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffspritze mit Gummistopfen, 20-30 ml</td> n.a.n.a.beliebiger <td></td><td></td><td>Lieferant, wichtig für die Herstellung von Gelabschnitten Einbettwerkzeug</td></tr><tr><td>breite Rasierklinge</td><td>n.a.n.a.beliebiger</td><td></td> <td>Lieferant, für BN-PAGE Geltrimmen / Exzision von Bahnen</td></tr><tr><td>Metallrohr / Zylinder, ca. 4 cm lange</td><td>N.A.N.A</td><td>.</td><td>-Form zum Einbetten und Einfrieren von Gelproben</td></tr><tr><td>Protein LoBind Röhrchen, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Nr. 0030108116</td><td>dringend empfohlen zur Minimierung des Protein-/Peptidverlusts durch</td></tr><tr><td>Absorptionssequenzierung modifiziertes Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>C18 PepMap100 Vorsäule, Partikelgröße 5 & Mikro; m</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>P/N 160454 PicoTip-Strahler</td><td></td></tr><tr><td>(i.d. 75 & micro; m; Tipp 8 &Mikro; m)</td><td>Neues Objektiv</td><td>FS360-75-8</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 & micro; m)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.93.</td><td>Manuell gepackte Spalten</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-TPC1-Antikörper</td><td>Gramsch Laboratories</td><td>kundenspezifische Produktion</td><td>, beschrieben in Castonguay, et al., 2017 (Referenz 12)</td></tr><tr><td>Cy3-biotinylierte Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>CY-1300</td>, <td>beschrieben in Castonguay, et al., 2017 (Referenz 12)</td></tr><tr><td>biotinyliertes Lotus tetragonolobus Lektin, FITC-konjugierte</td><td>Vector Laboratories</td><td>#B1325</td><td>beschrieben in Castonguay, et al., 2017 ( Referenz 12)</td></tr><tr><td>Kryo-Mikrotom Leica CM1950</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743905</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean II Cell mit Wetblot-Einheit</td><td>Bio Rad</td><td>n.a.für</td> <td>SDS-PAGE und Westernblot (nicht mehr verkauft)</td></tr><tr><td>Penguin Midi Gel-Elektrophorese-System</td><td>PeqLab</td><td>n.a.für</td> <td>BN-PAGE (nicht mehr verkauft)</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 M Mikroskop + Photometrics Coolsnap 2 Digitalkamera</td><td>Zeiss / Photometrics</td><td>n.a.peristaltische</td><td></td></tr> <tr><td>Pumpe (IP hochpräziser Mehrkanal)</td><td>Ismatec</td><td>ISM940</td><td>zum Gießen von Gradienten-Polyacrylamid-Gelen Gradientenmischer</td></tr><tr><td>mit Rühren (zwei Kammern)</td><td>selbst hergestellt, alternativ Bio Rad</td><td>1652000 oder 1652001</td><td>zum Gießen von Gradienten-Polyacrylamid-Gelen, Handbuch liefert Anweisungen zum Gießen von linearen oder hyperbolischen Gradientengelen (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Sorvall M120 mit S80 AT3 Rotor</td><td>Sorvall / Thermo Scientific</td><td>n.a.für</td> <td>die Probenvorbereitung (wird nicht mehr verkauft)</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite Massenspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution complexome profiling by cryoslicing bn-ms analysis

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteine üben in der Regel biologische Funktionen durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen aus, entweder in dynamischen Proteinbaugruppen oder als Teil stabil geformter Komplexe. Letzteres lässt sich mit nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) elegant nach molekularer Größe auflösen. Die Kopplung solcher Trennungen an die empfindliche Massenspektrometrie (BN-MS) ist gut etabliert und ermöglicht theoretisch eine erschöpfende Beurteilung des ausziehbaren Complexoms in biologischen Proben. Dieser Ansatz ist jedoch ziemlich mühsam und bietet eine begrenzte Auflösung und Empfindlichkeit in komplexer Größe. Auch, seine Anwendung ist auf reichlich mitochondriale und plastid Proteine beschränkt geblieben. So fehlen für die meisten Proteine noch Informationen über die Integration in stabile Proteinkomplexe. Präsentiert wird hier ein optimierter Ansatz für die komplexe Profilierung von Komplexen, die eine präparative BN-PAGE-Trennung, eine Submillimeter-Probenahme breiter Gelspuren durch Kryomikrotom-Schneiden und eine massenspektrometrische Analyse mit etikettenfreier Proteinquantifizierung umfassen. Die Verfahren und Tools für kritische Schritte werden ausführlich beschrieben. Als Anwendung beschreibt der Bericht komplexe Analyse einer solubilisierten endosome-angereicherten Membranfraktion aus Mausnieren, wobei insgesamt 2.545 Proteine profiliert werden. Die Ergebnisse zeigen die Identifizierung einheitlicher, überflussarmer Membranproteine wie intrazellulärer Ionenkanäle sowie hochauflösender, komplexer Protein-Montagemuster, einschließlich Glykosylierungs-Isoformen. Die Ergebnisse stehen im Einvernehmen mit unabhängigen biochemischen Analysen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode eine umfassende und unvoreingenommene Identifizierung von Protein-(Super-)Komplexen und deren Zusammensetzung der Untereinheit ermöglicht und eine Grundlage für die Untersuchung der Stoichiometrie, -montage und -interaktionsdynamik von Proteinkomplexen in biologisches System.

Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Das zentrale Ziel für die Entwicklung der csBN-MS-Technik war der umfassende Zugang zur Organisation und Montage von Proteinkomplexen, die der Signaltransduktion an und über die Plasmamembran verschiedener Gewebe- und Organtypen zugrunde liegen. csBN-MS bietet derzeit die höchste Auflösungsvielfalt für die Analyse des nativen Proteinkomplexes und deren Zusammensetzung, insbesondere in Bezug auf Membranproteine. Obwohl die csBN-MS-Technik entwickelt wurde, um komplexe Mischungen von Membranprotein-Baugruppen im Nagetierhirn zu analysieren, kann sie leicht an die Analyse jeder Art von biologischer Probe angepasst werden.Einer der wichtigsten Schritte unserer Methode ist die Einbettung des Gelstücks und seine korrekte Ausrichtung auf die Schnittebene vor dem Schneiden. Achten Sie darauf, das Gel nicht zu zerreißen oder zu komprimieren und sicher zu sein, dass es nicht auf die Schnittebene geneigt ist, da dies die Auflösung der Analyse reduzieren würde. Unsere csBN-MS-Technik verfügt über mehrere praktische Schritte, die für gute Ergebnisse entscheidend sind.Es ist einfacher zu zeigen, wie diese Schritte im Detail ausgeführt werden, als sie einfach zu beschreiben. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen rührenden Zweikammer-Gradientenmischer, der von einer Pumpe angetrieben wird, um ein lineares oder ein hyperbolisches Porengradientengel zu gießen. Bereiten Sie Lösungen für die vordere Mischkammer und Reservoirkammer vor, wie im Textprotokoll beschrieben.Starten Sie den Rührer und fügen Sie 30 Mikroliter APS und 2,5 Mikroliter TEMED in die Lösung in der vorderen Kammer hinzu. Starten Sie dann die Pumpe und öffnen Sie das Vorderventil. Nach etwa einer Minute 90 Mikroliter APS und fünf Mikroliter TEMED in die Reservoirkammer geben und den Kammeranschluss öffnen.Lassen Sie das Gel mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur langsam und gründlich polymerisieren, um einen homogenen Porengrößengradienten zu erzeugen. Bei Feuchtgehalten kann das polymerisierte Gel bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius aufrecht gelagert werden. Als nächstes bereiten Sie die Ladeschlitze vor, indem Sie die entsprechenden Leerzeichen zwischen den Glasplatten einlegen, um zwischen 0,5 und 2,0 Milligramm Protein zu trennen.Die Schlitze sollten mindestens drei Zentimeter breit sein. Für laufende Puffer einen stehenden Kathodenpuffer vorbereiten, der aus 50 Millimolar-Tricin, 50 Millimolar-Bis-Tris und 0,01%Coomassie G-250 besteht. Bereiten Sie einen Standard-Anodenpuffer vor, der aus 50 Millimolaren Bis-Tris besteht.Solubilisieren Sie ca. 2,5 Milligramm Membran und zwei Milliliter Löslichkeitspuffer, der 1%nicht-denaturierendes Reinigungsmittel auf Eis für 30 Minuten enthält. Dann Ultrazentrifugieren bei 130. 000 mal G für 11 Minuten. Konzentrieren Sie das Solubilisate auf einen kurzen 50%20%Sucrose-Schrittgradienten durch Ultrazentrifugation bei 400. 000 mal G für eine Stunde.Danach ernten Sie den Saccharosegradienten von der Unterseite des Rohres, fügen Sie 0,05%Coomassie G-250 zum Solubilisate hinzu und laden Sie die Probe auf das Gel. Führen Sie einen präparativen BN-PAGE bei 10 Grad Celsius über Nacht mit einem dreistufigen Spannungsprotokoll aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem das Gel ausgeführt wurde, scannen Sie die Gele zu Dokumentationszwecken und halten Sie es zwischen den Glasplatten.Prüfen Sie die Qualität der Geltrennung. Als nächstes, dissemble die Platten und Verbrauch die Spur Abschnitte von Interesse. Fixieren Sie die Bahnen zweimal mit 30% Ethanol und 15% Essigsäure für mindestens 30 Minuten.Übertragen Sie die Probe des Einbettmediums und lassen Sie sie mindestens zwei Stunden einweichen und aushalten, während die Gelplatte in Zeitlupe auf einem Orbital-Shaker gehalten wird. Schneiden Sie dann die festen Gelspuren in Abschnitte genau parallel zur Proteinmigrationsfront oder dem Bandmuster. Platzieren Sie jeden Abschnitt auf einer Kunststofffolienstütze mit gleichen Abmessungen für eine einfachere Handhabung.Übertragen Sie die Fahrspuren in ein offenes Rohr mit Stopfen, die unten geschlossen und oben zentral perforiert sind, beide präzise am oberen und unteren Ende des Gelabschnitts ausgerichtet. Tauchen Sie den Zylinder kurz in den flüssigen Stickstoff, um die Erstarrung schnell einzuleiten. Das transparente Einbettmedium verfestigt sich innerhalb von Sekunden und wird weiß in der Farbe.Füllen Sie den Hohlraum mit einbettendem Medium, tauchen Sie den Zylinder kurz in flüssigen Stickstoff und lassen Sie ihn dann bei minus 20 Grad Celsius mehrere Stunden gründlich einfrieren. Nach der Demontage die Kunststofffolie entfernen und den Block mit dem eingebetteten Gelabschnitt in einen gekühlten Metallzylinder übertragen. Der Zylinder ist größer im Durchmesser und außen mit Einbettmedium abgedichtet.Es wird auf einem flachen Träger platziert. Füllen Sie den Zylinder mit einbettendem Medium und frieren Sie gründlich ein, wie bereits erwähnt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der anderen Seite des Zylinders, um einen festen Block mit einer koplanaren Bodenfläche zu erhalten.Entfernen Sie dann den Block aus dem Zylinder und verwenden Sie ein einbettendes Medium, um ihn an einen vorgekühlten Metallhalter zu kleben. Stecken Sie den Metallhalter in die Kryomaschine. Der Halter muss sorgfältig auf die Schnittebene ausgerichtet werden.Lassen Sie den Block auf die optimale Temperatur für den Schneidprozess ausdemivieren. Nach dieser Ernte schneidet das Gel nacheinander mit einer endgültigen gewünschten Dicke von 0,25 Millimetern Schrittgröße und überträgt sie einzeln in Reaktionsröhrchen mit geringen Proteinbindungseigenschaften. Anschließend werden die Scheiben einer tryptischen Verdauung und massenspektrometrischen Analyse unterzogen.Dieses Protokoll erweitert die Anwendung von hochauflösendem Complexome-Profiling auf nicht-mitochondriale Membranen, die wenig reichliche Proteine exdrücken. Komplexe Trennung zeigt stark gefärbte Proteinbänder mit sehr wenig Migrationsartefakten. Abweichungen von Peptidsignalen in Masse und Retentionszeit deuten auf eine sehr niedrige Rate bei falsch positiver Spitzenvolumenzuweisung hin.Run-to-Run-Variationen werden durch neu skalieren der Spitzenvolumen-Datensätze leicht eliminiert. Die resultierenden Peptidintensitätsinformationen werden dann verwendet, um 2545 Proteinprofile relativer Häufigkeit zu rekonstruieren. Die Relevanz der Größe der Gel-Probenahme-Schrittgröße für die Auflösung von Proteinkomplexen wurde durch Das Verbinden von Datensätzen benachbarter Slices bewertet.Mit 0,25 Millimetern stimmt die Größentrennung der TPC1-assoziierten komplexen Populationen gut mit den Ergebnissen der Western Blot-Analyse überein. Durch die Verbindung von mehr als zwei Scheiben wird die Diskriminierung komplexer TPC1-Teilpopulationen abgeschafft. Schließlich liefert die Analyse Informationen über gut charakterisierte Komplexe und zeigt die Existenz neuartiger Untereinheiten und komplexer Baugruppen.Für Ferritin deuten die um ihre relative Häufigkeit bereinigten Untereinheitsprofile auf die Existenz von mindestens drei komplexen Isoformen mit ausgeprägten schweren/leichten Kettenstoichiometrien hin. Nicalin-Nomo1-Komplexe, der Gamma-Sekretase-Kernkomplex und die GPI-Transamidase-Maschinen weisen dagegen feste Häufigkeitsverhältnisse ihrer Kernuntereinheiten über den gesamten Größenbereich auf und sind unabhängig von der Assoziation mit zusätzlichen Proteinen. Der Schlüsselparameter der csBN-MS-Analyse ist die effektive Auflösung von Komplexen, die durch Probenbiochemie, BN-Gelqualität, richtige Ausrichtung beim Einbetten und Schneiden und Qualität der erfassten MS-Daten bestimmt wird.Das Kombinieren von csBN-MS mit der Isotopenkennzeichnung von Proteinen und Proben ermöglicht einen direkten Vergleich von Komplexstoffen in verschiedenen pathophysiologischen, biologischen oder Entwicklungszuständen. csBN-MS, das an Membranen des Nagetierhirns durchgeführt wurde, zeigte die enorme Vielfalt von Rezeptoren, Ionenkanälen und Transportern in Bezug auf ihre Zusammensetzung der Untereinheit und ihre Funktion, und es wird für die Analyse der 3D-Struktur in nativen Präparaten von entscheidender Bedeutung sein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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