Name: Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Lernen Sie die Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Einblicke in neurodegenerative Erkrankungen und biotechnologische Anwendungen.

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Die Autoren danken der Schweizerischen Nationalstiftung für Wissenschaft (SNF) für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer P2ELP2_162116 und P300P2_171219), dem Darwin College, Erasmus+ Programm für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) und Forschung, die zu diesen Ergebnissen führt, wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (RP7/2007-2013) über das ERC-Stipendium PhysProt (Vereinbarung nr. 337969), die Newman Foundation (T.P.J.K.) und The The Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. und T.P.J.K.).

1. Aggregations-Assays auf Fluoreszenzplattenlesern
HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel dafür, wie die Aggregation von Proteinen oder Peptiden durch chemische Kinetik untersucht werden kann. Insbesondere beschreibt es ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung der Aggregation des Peptids A-42, das am Beginn und fortschreitender Alzheimer-Krankheit beteiligt ist58,59. Ein ähnliches Protokoll kann angepasst und angenommen werden, um die Aggregation von Proteinen oder Peptiden zu untersuchen.
<ol><li>Erhalten Sie eine hochreine monomerische Lösung von A-42 durch Ionenaustausch- und Größenausschluss-Chromatographie-Techniken, um Proteinfraktionen zu unterscheiden, die A42 enthalten, und um die monomere Fraktion von anderen aggregierten Formen von A-42 zu isolieren58 , 59.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Peptid A-42 in 20 mM Natriumphosphatpuffer, 200 m EDTA bei pH 8,058 auf eine gewünschte Endkonzentration zwischen 1 und 5 m, in 1,5 ml bindungsarmen Röhrchen. Proben, die für AFM-Messungen gesammelt wurden, sollten nicht den fluoreszierenden Farbstoff enthalten, der im Aggregationstest verwendet wird (Thioflavin T, ThT), da es Artefakte während der Probenabscheidung für die AFM-Analyse einführen könnte. So bereiten Sie Triplicate von zwei identischen Lösungen vor: i) die erste, die monomeric A-42 enthält, um den Prozess der Aggregation durch AFM zu verfolgen; ii) die zweite, die die A-42-Monomeric-Datei mit einer Zugabe von 20 M ThT als Tracer zur Überwachung der Kinetik der Aggregation enthält. HINWEIS: Es ist wichtig, die Schritte 1.1 und 1.2 auf Eis durchzuführen. Mit diesem Verfahren soll sichergestellt werden, dass sich die monomere Lösung A-42 erst aggregiert, wenn sie im Plattenleser initiiert wird. Bei der Handhabung von Proben ist eine sorgfältige Pipettierung unerlässlich, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden, die die Proteinprobe beeinflussen können.</li>
	<li>Pipette 80 l jeder Probe in jeder Bohrung einer 96-Well-Halbflächenplatte aus schwarzem Polystyrol mit klaren Boden- und unverbindlichen Oberflächen.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Platte mit einer Folie, um die Verdunstung der Probe im Verlauf der Aggregation zu minimieren.</li>
	<li>Die Temperatur des Plattenlesers auf 37 °C ausdemieren.</li>
	<li>Richten Sie das Aggregationsprotokoll ein, um Fluoreszenzmessungen in festen Zeitpunktintervallen bei einer Anregungswellenlänge von 440 nm und einer Emissionswellenlänge von 480 nm zu lesen. Die Aggregation sollte unter stillen Bedingungen initiiert werden.</li>
	<li>Setzen Sie die Platte in den Plattenleser ein. HINWEIS: Es ist wichtig, beim Umgang mit der Platte vorsichtig zu sein, um sicherzustellen, dass die Aggregation nicht ausgelöst wird, bevor der Plattenleser gestartet wird. Verwenden Sie die Gain-Einstellungseinstellungen, um die optimale Auslesung der Fluoreszenz jeder Probe sicherzustellen.</li>
	<li>Starten Sie die Messung. ANMERKUNG: Das Aggregationsexperiment wird abgeschlossen, wenn die ThT-Fluoreszenz-Sigmoidalkurve ein Plateau58erreicht.</li>
</ol>2. Probenvorbereitung für AFM- und Nano-IR-Messungen
<ol><li>Kleben Sie die hochwertigste V1 Glimmerscheibe auf hochwertige magnetische Edelstahlscheibe mit Klebelaschen oder doppelseitigem Klebeband.</li>
	<li>Ätzen Sie Glimmer, indem Sie ein Stück Klebeband auf die Glimmeroberfläche legen und die obere Schicht des Glimmers abziehen. Dieses Verfahren erzeugt eine saubere, atomar flache Oberfläche, die für die Probenabscheidung geeignet ist. HINWEIS: Die geätzte Oberfläche muss gleichmäßig und glatt sein. VORSICHT: Berühren oder atmen Sie nicht direkt über frisch geätztem Glimmer, da dies Artefakte einführt.</li>
	<li>Halten/stoppen Sie die Plattenlesermessung, um den Zeitpunkt des Interesses während des Aggregationsprozesses des Proteins zu erfassen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dichtfolie und sammeln Sie 10 L Aliquot der Proben ohne ThT aus dem Brunnen in ein 1,5 ml tief bindendes Rohr.</li>
	<li>Legen Sie die 10 l der Probe auf den frisch geätzten Glimmer ab. Für AFM-IR-Messungen müssen Proben auf frisch abgestreiftem Goldsubstrat abgelagert werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Lösung auf der Glimmer für 1 min, um eine Physisorbtion zu ermöglichen. HINWEIS: Eine längere Inkubationszeit würde eine bessere Absorption auf der Oberfläche ermöglichen, kann aber eine künstliche Selbstorganisation und Selbstmontage induzieren25. Um diese Effekte zu vermeiden, kann die Sprühabscheidung25ausgenutzt werden.</li>
	<li>Spülen Sie dreimal mit 1 ml Reinstwasser.</li>
	<li>Trocknen Sie unter einem sanften Stickstofffluss, um die Probe in der Luftumgebung zu messen.</li>
</ol>3. AFM-Bildgebung der Morphologie von Proteinaggregaten
HINWEIS: Morphologiemessungen können sowohl im Kontakt- als auch im dynamischen Modus durchgeführt werden, in den folgenden Schritten wird letzteres beschrieben, da es die seitlichen Kräfte reduziert, um die 3D-Morphologie der Probe mit hoher Auflösung zu messen. AFM-IR-Messungen werden im Kontaktmodus durchgeführt, um das AFM-IR-Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
<ol><li>Schalten Sie das AFM-System mindestens 30 min vor den Messungen ein, damit das System eine thermische Stabilität erreicht. Klicken Sie auf Setup, dann auf Probe. Klicken Sie im Fenster Probewechsel auf Weiter, um Z vorzubereiten, Fokusstufe.</li>
	<li>Schalten Sie den AFM-Strahlschalter aus (falls er eingeschaltet ist). Entsperren Sie die Schwalbenschwanzschlösser, trennen Sie den Kopf vom System und klicken Sie im Fenster Probewechsel auf Weiter.</li>
	<li>Montieren Sie den AFM-Ausleger am Sondenhalter. Schließen Sie den Kopf an das System an und verriegeln Sie die Schwalbenschwanzschlösser. HINWEIS: Optimale Ausleger zur Untersuchung biologischer Proben im dynamischen Modus AFM haben eine Federkonstante zwischen 2 x 40 N m-1 und eine Spitzenradien zwischen 2 8 nm14.</li>
	<li>Schalten Sie den AFM-Laserstrahlschalter ein und klicken Sie im Fenster Probewechsel auf Weiter.</li>
	<li>Klicken Sie im Popup-Fenster auf Nein, wenn sich der Freischwingertyp nicht geändert hat. Passen Sie die optischen Ausrichtungsknöpfe an, um den Ausleger zu finden. Passen Sie den Fokus auf den Ausleger an und klicken Sie auf Weiter.</li>
	<li>Klicken Sie im Popup-Fenster auf Ja, wenn der Fokus auf dem Ausleger liegt.</li>
	<li>Positionieren Sie den Laserstrahl am Ende des Auslegers mit den Knöpfen, die die Position des Detektionslasers steuern. Maximieren Sie das von der Vier-Quadranten-Photodiode gemessene Gesamtsignal auf mindestens >1 V mit den Knöpfen, die die Position des abgelenkten Laserstrahls auf der positionsempfindlichen Photodiode (PSPD) steuern. Klicken Sie im Fenster Probeänderung auf Weiter und dann auf Schließen.</li>
	<li>Warten Sie 15 min, bis der Ausleger thermische Stabilität erreicht. Stellen Sie bei Bedarf die Position des abgelenkten Laserstrahls auf dem PSPD nach.</li>
	<li>Klicken Sie auf NCM SWEEP, wählen Sie die gewünschte Amplitude der Schwingung, klicken Sie auf Phase verwenden, klicken Sie auf Auto und stimmen Sie den Ausleger in der Nähe des Maximums seiner ersten freien Resonanz der Schwingung, die von ca. 300 kHz für eine Ausleger mit einer Federkonstante von 40 N m-1. HINWEIS: Das Ausstellen des Auslegers aus dem Maximum seiner freien Resonanz gewährleistet eine höhere Stabilität der Messungen14.</li>
	<li>Legen Sie die Probe auf den Probenhalter. Wählen Sie geeignete Bildparameter aus. Die typische Scanrate liegt bei 0,3 bis 1,0 Hz für eine Scanfläche von 1 x 1 m2 bis 5 x 5 m2. Die typische Auflösung liegt zwischen 256 x 256 und 1024 x 1024 Pixeln. Klicken Sie auf Scanbereich, um die Scangröße und die Pixelzahl auszuwählen.</li>
	<li>Konzentrieren Sie die optische Ansicht auf die Probe. Klicken Sie auf Ansatz, um sich der Probenoberfläche zu nähern. Sobald der Anflug abgeschlossen ist, klicken Sie auf Lift 100 'm, um die AFM-Spitze 100 'm über die Oberfläche der Probe zu erheben. Klicken Sie auf das optische Bild des Samples erweitern. Klicken Sie auf die Fokusstufenleiste, um die Ansicht auf die Oberfläche des Beispiels zu fokussieren.</li>
	<li>Verwenden Sie die Pfeile, um sich im Bereich der Interessenprobe zu bewegen. Betreiben Sie die Oberfläche, indem Sie die Anflugtaste drücken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Linienscan, und überprüfen Sie, ob die Spitze der Oberfläche gut folgt, passen Sie ggf. den Sollwert an.</li>
	<li>Starten Sie die Bildgebung der Probenoberfläche durch Drücken der Scan-Taste. Während der Bildgebung, um große bildgebende Kraft zu vermeiden und die Konsistenz innerhalb unabhängiger Proben zu halten, halten Sie ein konstantes Regime der Phasenänderung nicht mehr als 20 °42.</li>
	<li>Geben Sie den Dateinamen ein, und wählen Sie das Basisverzeichnis aus, in dem das erworbene Bild gespeichert werden soll.</li>
</ol>4. Infrarot-Nanospektroskopie-Messungen von Proteinaggregaten
<ol><li>Schalten Sie das AFM-IR-System und den Infrarot-Laser (IR)60 30 bis 60 min vor Messungen zur thermischen Stabilisierung ein. Typische Laser für AFM-IR-Instrumente sind optische Parameteroszillatoren (OPO) und Quantenkaskadenlaser (QCL).</li>
	<li>Öffnen Sie die integrierte Software, um das Gerät zu steuern. Klicken Sie auf Datei und dann auf neu, um eine neue nanoIR-Datei zu öffnen. Drücken Sie die Taste initialisieren, um das AFM-IR-System zu starten.</li>
	<li>Öffnen Sie die Instrumentenabdeckung und montieren Sie am AFM-IR-System eine siliziumgoldbeschichtete Sonde mit einem Nennradius von 30 nm und einer Federkonstante von 0,2 N/m, um die Probe im Kontaktmodus zu messen.</li>
	<li>Klicken Sie im Abschnitt AFM-Sonde auf Laden und dann weiter. Klicken Sie im Fokus auf den Sondenabschnitt auf die Pfeile, um die Kamera auf den Ausleger zu fokussieren. Verwenden Sie im Abschnitt SbXY-Bewegungdie Pfeile, um die Querluft am Ende des Auslegers zu platzieren.</li>
	<li>Drehen Sie die Knöpfe, die die Position des Erkennungslasers steuern, um den Laser am Ende des Auslegers zu positionieren. Drehen Sie die Laserknöpfe, um die von der Vier-Quadranten-Photodiode gemessene Summe auf einen Wert >3 V zu erkennen und zu maximieren. Drehen Sie den Umlenkknopf, um die Auslegerablenkung auf -1 V einzustellen, und klicken Sie dann auf weiter. Schließen Sie die Abdeckung des Instruments.</li>
	<li>Verwenden Sie im Abschnitt Fokus auf Beispiel die Pfeile, um die Kamera auf das Beispiel zu fokussieren. Dann, in der Abschnittsbeispiel XY Bewegung verwenden Sie die Pfeile in den Bereich des Interesses der Probe zu bewegen und klicken Sie auf Ansatz und engagieren.</li>
	<li>Wählen Sie im Mikroskopfenster als Eingänge die Kanäle aus, die von Interesse sind, um die biophysikalischen Eigenschaften der Probe abzubilden. Wählen Sie insbesondere Die Höhe für die Morphologie, Amplitude 2 für IR-Absorption und PLL-Frequenz, um die Kontaktresonanz der Spitze und der Probe zu kartieren.</li>
	<li>Verwenden Sie im AFM-Scanbereich des Steuerelementfensters ähnliche Parameter wie in Abschnitt 3 (d. h. Scanrate 0,1 x 1,0 Hz, zwischen 256 x 256 und 1024 x 1024 Pixel). Wählen Sie als Wert der Gewinne nach Stichprobenrauheit: Integral I = 1x10 und proportional P = 10-30. Klicken Sie dann auf Scannen, um eine Morphologiekarte zu erhalten. HINWEIS: Die Morphologie kann im dynamischen Abstichmodus ähnlich gemessen werden, aber AFM-IR-Messungen werden hier im Kontaktmodus durchgeführt, um höhere Signal-Rausch-Verhältnisse zu haben.</li>
	<li>Nachdem die Kartierung der Morphologie abgeschlossen ist, klicken Sie im Mikroskopfenster auf die Höhenkarte, um die Sonde oben auf einem Aggregat zu positionieren. Klicken Sie dann im Bereich nanoIR des Steuerungsfensters auf IR starten, um die Probe mit dem IR-Laser zu beleuchten.</li>
	<li>Um den Infrarotlaser auf den Ausleger zu fokussieren, klicken Sie auf Optimierung. Schreiben Sie in diesem Fenster eine Wellenzahl, bei der die Probe eine hohe Absorption simiert hat, und klicken Sie auf Hinzufügen. Für Protein ist ein typischer Wert 1655 cm-1. Klicken Sie auf Scannen, um die IR-Laserposition zu finden, und klicken Sie auf Update, um ihre Position am Ausleger auszurichten. Schließen Sie das Fenster.</li>
	<li>Schreiben Sie im Abschnitt Allgemein der nanoIR-Einstellung eine Wellenzahl, bei der eine hohe Absorption im relativen Feld erwartet wird. Deaktivieren Sie dann die Option Bandpassfilter und schauen Sie sich den Zählerstand und die schnelle Fourier-Transformation (FFT) der Auslegerantwort an. Bewegen Sie im FFT-Fenster den grünen Cursor, um die Resonanzfrequenz des Auslegers zu lesen. Ein typischer Wert der FFT der Resonanz der Ausleger liegt bei etwa 300 kHz. Schreiben Sie diesen Resonanzfrequenzwert in den allgemeinen Abschnitt im Freq.-Mittelfeld und verwenden Sie ein Freq.-Fenster von 50 kHz. HINWEIS: Wählen Sie eine Laserleistung aus, die niedrig genug ist, um den Zählerstand nicht zu sättigen und eine Verzerrung in der Auslegerantwort zu haben und die Probe nicht zu überhitzen.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Laserpuls-Tuning-Fenster, um den Resonanz-verbesserten Modus zu verwenden. Wählen Sie einen Frequenzbereich von 300 kHz, einen Stimmbereich von 50 kHz und einen Einschaltzyklus des Lasers von 5%. Klicken Sie auf erwerben, um die Pulsfrequenz des Lasers zu fegen. Stimmen Sie den Laserpuls mithilfe des Cursors im Diagramm auf die Frequenz der mechanischen Reaktion der thermischen Ausdehnung der Probe ab, die das IR-Licht absorbiert. Wählen Sie dann die Option PLL aus, um die Kontaktresonanz zwischen der Probe und der Spitze zu überwachen. Drücken Sie die Nulltaste im PLL-Fenster und aktivieren Sie die Taste, um die Kontaktresonanz der Sample-Spitze zu verfolgen. Wählen Sie eine integrale Verstärkung I = 0,5 und proportionale Verstärkung P = 10. Schließen Sie das Fenster.</li>
	<li>Öffnen Sie erneut das Optimierungsfenster und finden Sie die Position des IR-Lasers für mindestens 3 Wellenzahlen, die den großen Absorptionsbändern der Probe (Amidband I-II-III) entsprechen, und für mindestens eine Wellenzahl für jeden Chip des Lasers.</li>
	<li>Klicken Sie auf Extras | IR-Hintergrundkalibrierung | Neu. Wählen Sie im Fenster den spektroskopischen Bereich aus, der von Interesse ist (1800 x 1200 cm-1, um Proteinproben zu untersuchen); die gleiche Pulsrate wie in Schritt 4.12 und einem Betriebszyklus von 5% zu wählen; Klicken Sie auf schnelle Erfassung und wählen Sie die Lasergeschwindigkeit, typische Reichweite für einen Quantenkaskadenlaser liegt zwischen 20 x 500 cm-1. Klicken Sie auf Acquire, um den IR-Laserhintergrund zu messen. Dieses Hintergrundspektrum wird zur Normalisierung der gemessenen nanoskaligen lokalisierten Spektren verwendet. Schließen Sie das Fenster. HINWEIS: Wenn ein schneller Laser- und Resonanz-verbesserter Modus nicht verfügbar ist, überspringen Sie Schritt 4.12 und wählen Sie gestufte Spektren anstelle von schnell im Hintergrund- und IR-Spektrenerfassungsfenster aus. Eine einzige Aggregatempfindlichkeit wird jedoch nicht erreicht.</li>
	<li>Wählen Sie in den IR-Spektreneinstellungen eine IR-Spektrumauflösung zwischen 1 x 4 cm-1 und einer Anzahl von Co-Durchschnitten von mindestens 64x. Klicken Sie auf Erwerben, um ein nanoskaliges lokalisiertes IR-Spektrum im Proteinbereich zu messen (1800 x 1200 cm-1).</li>
	<li>Um eine nanoskalige gelöste chemische Karte zu erhalten, wählen Sie die IR-Bildgebungsoption, wählen Sie eine Wellenzahl von Interesse (z. B. 1655 cm-1 für Amidband I) und klicken Sie im AFM-Scanfenster auf Scan.</li>
	<li>Sobald die Zuordnung abgeschlossen ist, gehen Sie zu Datei und speichern Sie die Messungen. Um die erworbenen Karten der Morphologie, Kontaktresonanz und Chemie sowie der nanoskaligen lokalisierten Spektren zu analysieren, verwenden Sie die integrierte AFM-Bildverarbeitungssoftware. Spectra und Images können als .csv- oder .axz-Dateien für eine weitere detaillierte Analyse mit kommerzieller Software gespeichert werden.</li>
</ol>5. Bildverarbeitung und Analyse von Querschnittsabmessungen
<ol><li>Flatten Rohbilder14,17,19,41,42,59 mit eingebauter AFM Bildverarbeitungssoftware oder kommerzieller Software. HINWEIS: Die Aggregate sollten aus der Berechnung verdeckt werden, um Artefakte der Analyse und Unterschätzung ihrer gemessenen Höhe zu vermeiden.</li>
	<li>Flachen Sie das Bild um 0 Order-Ebene passen Subtraktion.</li>
	<li>Das Bild nach Ebene und dann Zeile für Zeile in einer1. Regressionsreihenfolge abflachen, wird der zweite Schritt wiederholt, bis die flache Grundlinie im Linienprofil des Bildes erreicht ist.</li>
	<li>Wenn die Probe sehr überfüllt ist, außergewöhnlich hohe Aggregate enthält oder Scanner-Bogen-Artefakt vorhanden ist, flachten Sie das Bild mit 2nd Regressionsreihenfolge fit.</li>
	<li>Messen Sie die Aggregathöhe und -breite von einem Linienprofil, das senkrecht zur Fibrillenachse14,17,19,41,42,59genommen wird.</li>
	<li>Messen Sie die Fibrillenlänge parallel zur Fibrillenachse14,17,19,41,42,59.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der erste kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Herstellung monomerer Proteine, wie im Fall der in den Schritten 1.1 und 1.2 beschriebenen Lösung A-42. Es ist wichtig, den Aggregationsprozess aus einer hochreinen, monomeren Lösung zu initiieren, da das Vorhandensein von oligomeren oder aggregierten Arten zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Aggregationskinetik führen kann58, und Artefakte im AFM induzieren kann. (z. B. fibrillare Arten werden in den Anfangsstadien der Aggregation sic...

Mehr als 40 Millionen Menschen weltweit sind derzeit von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer (AD)1 und Parkinson (PD)2 Krankheiten betroffen. Allgemeiner gesagt, sind mehr als fünfzig Pathologien auf molekularer Ebene mit Proteinfehlfaltung und -aggregation assoziiert, ein Prozess, der zur Proliferation von unlöslichen fibrillaren Proteinaggregaten führt, die als Amyloidablagerungen3 bekannt sind. 4. Die molekularen Ursprünge der Neurodegeneration und ihre Verbindungen mit Proteinkonformationsveränderungen von Proteinen, die zur Amyloidbildung führen, bleiben jedoch weitgehend unklar, was zum großen Teil auf das hohe Maß an Heterogenität, transikulären Natur und nanoskalige Abmessungen der pathologischen Aggregate4,5.
Sehr erfolgreiche Untersuchungen von Proteinstrukturen in den letzten Jahrzehnten basierten weitgehend auf dem Einsatz von Massenmethoden, einschließlich Röntgenkristallographie, Kryo-Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie5, 6 , 7 , 8 , 9. Innerhalb dieser Klasse von Techniken hat sich die Infrarotspektroskopie (IR) als ein sensibles Analysewerkzeug herausgebildet, um die chemischen Eigenschaften biologischer Systeme wie Proteine8zu entwirren. IR-Methoden ermöglichen die Quantifizierung von sekundären und quartären Strukturveränderungen des Proteins während ihrer Fehlfaltung und Aggregation. Um auf mikroskopischer Ebene die mechanistischen Details, die in den komplexen freien Energielandschaften von Proteinen während ihrer Aggregation involviert sind, weiter zu entschlüsseln, war ein großer Fortschritt die Entwicklung chemischer Kinetik-Werkzeuge, die sich auf komplexe Selbstmontagewege einschließlich AmyloidfibrillenBildung5,6,7,10,11,12. Massenspektroskopische Methoden liefern jedoch nur durchschnittliche Informationen über das heterogene Artenensemble, das in Lösung oder in bestimmten mikroskopischen Schritten vorhanden ist, wodurch die Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierte Arten, die auf der Nanoskala anspruchsvoll sind13,14.
In den letzten Jahrzehnten sind mehrere Mikroskopietechniken mit der Fähigkeit entstanden, auf Skalen zu arbeiten, die kleiner als die Beugungsgrenze des Lichts sind. Diese Methodenklasse umfasst Elektronenmikroskopie (EM) und Atomkraftmikroskopie (AFM). Während Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zweidimensionale (2D) Bilder einer Probe liefern, hat sich AFM in den letzten Jahrzehnten als eine leistungsfähige und vielseitige Technik zur Untersuchung dreidimensionaler (3D) Morphologien sowie die nanomechanischen Eigenschaften einer Probe mit Sub-Nanometer-Auflösung13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Der Grund für die Untersuchung der Proteinaggregation über AFM ist, dass dieser Ansatz die Untersuchung der Morphologie einzelner Arten in Lösung13,14,16ermöglicht. 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Insbesondere durch die Überwachung der Probe als Funktion der Zeit, AFM ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung der Morphologie der Art innerhalb der Probe, die es ermöglicht, zu folgen und visualisieren die Wege der Amyloidbildung23, 25,38,39,40,41,42. Darüber hinaus ermöglicht AFM die Quantifizierung von Strukturparametern wie Querschnittshöhen und -längen der einzelnen Arten in Lösung13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Die Untersuchung einer einzigen biophysikalischen Eigenschaft, wie z. B. der Morphologie, reicht jedoch bei der Untersuchung heterogener und komplexer biologischer Systeme oft nicht aus. AFM-, SEM- oder TEM-Bildgebungsverfahren allein zeigen nicht ohne weiteres die chemischen Eigenschaften heterogener Arten von Amyloid-Aggregaten im Nanomaßstab.
Ein großer Fortschritt für die Analyse heterogener biologischer Proben in diesem Maßstab wurde in jüngster Zeit mit der Entwicklung und Anwendung auf dem Gebiet der Proteinaggregation der Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Diese innovative Methode nutzt die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM (1,10 nm) mit der chemischen Analyseleistung von IR. Die AFM-IR-Technik basiert auf der Messung des photothermischen induzierten Resonanzeffekts, der von einem IR-Laser angetrieben wird, und auf der Messung der thermischen Ausdehnung der Probe, die von der AFM-Spitze untersucht wird. Die Probe kann mit dem IR-Laser direkt von oben oder von unten in der gesamten inneren Reflexion beleuchtet werden, ähnlich wie bei der herkömmlichen Infrarotspektroskopie24,42,52,53 . Der IR-Laser kann mit typischen Frequenzen in der Größenordnung von Hunderten von Kilohertz (1x1000 kHz) gepulst und über einen weiten Spektralbereich abgestimmt werden, typischerweise zwischen 1000 und 3300 cm-1. Obwohl die Laserquelle eine Fläche von 30 m Durchmesser abdeckt, wird die räumliche Auflösung der AFM-IR-Technik nominell durch den AFM-Spitzendurchmesser bestimmt, der die lokale Wärmeausdehnung des Systems erkennt. AFM-IR eignet sich gut für die Untersuchung biologischer Proben, da das IR-Signal proportional zu ihrer Dicke bis zu 1,5 m ist und die resultierenden IR-Spektren im Allgemeinen mit den entsprechenden FTIR-Übertragungsspektren13,54 übereinstimmen. ,55. Aus diesem Grund können etablierte Analysemethoden in der Spektroskopie problemlos angewendet werden, wie z. B. die Untersuchung chemischer Verschiebungen, Bandformänderung und De-Konvolution durch zweite Derivateanalyse52. Insgesamt ermöglicht AFM-IR durch die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM mit der chemischen Erkennungskraft der IR-Spektroskopie die gleichzeitige Erfassung einer vielzahl morphologischer, mechanischer und chemischer Eigenschaften einer Probe im Nanomaßstab.
Hier illustrieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung des Prozesses der Proteinaggregation, das die Kombination von In-vitro-Fluoreszenz-Assays, hochauflösender AFM-Bildgebung und nanoskaliger AFM-IR nutzt. Dieser kombinierte Ansatz hat sich bereits durch detaillierte Ergebnisse bei der Untersuchung der chemischen und strukturellen Eigenschaften einzelner Mikrotröpfchen, die durch Proteinaggregate gebildet werden, bei der Untersuchung der Flüssigkeits-Flüssig-Proteinphasentrennung und in Untersuchung der Heterogenität und der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierter Arten im Nanomaßstab23,26,38,45,50,53, 56,57.

<table><tbody><tr><td>AFM-IR-System</td><td>Anasys Instruments</td><td>nanoIR 2 oder 3</td><td>Systeme zur Messung der Wärmeausdehnung im Kontakt- und Resonanzmodus</td></tr><tr><td>Corning 96-Well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrol NBS Microplate</td><td>Corning</td><td>3881</td><td></td></tr><tr><td>Corning Microplate Aluminium-Dichtband</td><td>Corning</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitige Klebescheiben</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGG3347N</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>415-101</td><td>Plattenleser</td></tr><tr><td>Glimmer Disc 10mm V1</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGF7013</td><td></td></tr><tr><td>Park NX10 AFM-System</td><td>Park Systems</td><td>N/A</td><td>Rasterkraftmikroskop</td></tr><tr><td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td><td>Platypus Technologies</td><td>AU.1000.SWTSG</td><td></td></tr><tr><td>PPP-NCHR-10 Ausleger</td><td>Park Systems</td><td>PPP-NCHR-10</td><td></td></tr><tr><td>Protein LowBind Röhrchen, 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>Silizium goldbeschichtete Cantilevers</td><td>Anasys Instruments</td><td>PR-EX-nIR2</td><td></td></tr><tr><td>SPM Probenscheiben 12 mm</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGF7001</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung einzelner proteinaggregate durch infrarot-nanospektroskopie und atomkraftmikroskopie

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Das Phänomen der Proteinfehlfaltung und -aggregation führt zur Bildung hochheterogener Proteinaggregate, die mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht werden. Insbesondere niedermolekulare Aggregate, Amyloid-Oligomere, haben nachweislich generische zytotoxische Eigenschaften und sind als Neurotoxine in vielen Formen von Demenz involviert. Wir veranschaulichen den Einsatz von Methoden auf Basis der Atomkraftmikroskopie (AFM), um die anspruchsvolle Aufgabe der Charakterisierung der morphologischen, strukturellen und chemischen Eigenschaften dieser Aggregate anzugehen, die mit konventionellen strukturellen biophysikalische Methoden aufgrund ihrer Heterogenität und Vergänglichkeit. Scan-Sondenmikroskopie-Ansätze sind nun in der Lage, die Morphologie von Amyloid-Aggregaten mit Sub-Nanometer-Auflösung zu untersuchen. Wir zeigen hier, dass die Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR), die gleichzeitig die hohe Auflösung von AFM und die chemische Erkennungskraft der IR-Spektroskopie ausnutzt, weiter gehen und die Charakterisierung der strukturellen Eigenschaften einzelner Proteinaggregate und bieten so Einblicke in die Aggregationsmechanismen. Da der von uns beschriebene Ansatz auch auf die Untersuchungen der Wechselwirkungen von Proteinassemblys mit kleinen Molekülen und Antikörpern angewendet werden kann, kann er grundlegende Informationen liefern, um neue therapeutische Verbindungen zur Diagnose oder Behandlung zu entwickeln. neurodegenerative Störungen.

Abbildung 1zeigt einen repräsentativen Zeitverlauf der A-42-Aggregation, gemessen anhand des ThT-Fluoreszenz-Assays. Der Aggregationsprozess ist häufig durch eine sigmoidale Kurve gekennzeichnet, bei der zunächst eine Verzögerungsphase beobachtet wird, gefolgt von einer steilen Wachstumsphase, bevor die Kurve ein Plateau erreicht, wenn ein Gleichgewichts-Stabilitätszustand erreicht wird6,7 , 58. Es ...

Wir beschreiben die Anwendung von Infrarot-Nanospektroskopie und hochauflösender Atomkraftmikroskopie, um den Prozess der Protein-Selbstmontage in oligomere Aggregate und Amyloidfibrillen zu visualisieren, die eng mit dem Beginn und der Entwicklung verbunden sind. einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen.

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Methoden auf Basis der Atomkraftmikroskopie ermöglichen es, biomolekulare Prozesse im Nanomaßstab mit morphologischer chemischer oder struktureller Auflösung zu charakterisieren und schließlich ein neues Frontfenster zur Beobachtung der Biologie zu öffnen. Einzelmolekülmethoden ermöglichen die Untersuchung hochheterogener Systeme, ein Merkmal, das für das Verständnis der Proteinaggregation besonders relevant ist. Durch die Kombination einzelner Moleküle mit Rückenansätzen können wir grundlegende Informationen über das Verhalten von Proteinen, ihre Verbindungen mit menschlichen Krankheiten und das Design pharmakologischer Interventionen erhalten, die erfolgreich sein können.Darüber hinaus kann diese Methode erfolgreich angewendet werden, um die chemischen und strukturellen Eigenschaften von Biomaterialien für die Arzneimittelabgabe, Anwendungen und andere biotechnologische Zwecke zu untersuchen. Es kann zunächst eine Herausforderung sein, die richtigen AFM-Parameter für eine hohe Auflösung einzustellen, und es ist einfach, Ihren AFM einzurichten, während Sie Ihre Fibrillaraggregate messen. 30 Minuten vor der AFM-Bildgebung schalten Sie das AFM-System ein und klicken Sie auf Einrichten und Sonden.Klicken Sie im Fenster "Prüfpunktwechsel" auf next, um die Z-Fokusstufe vorzubereiten. Schalten Sie den AFM-Strahlschalter aus, wenn er eingeschaltet ist, und entsperren Sie die Schwalbenschwanzschlösser. Trennen Sie den Kopf vom System, und klicken Sie im Fenster zum Sondenwechsel auf Weiter.Montieren Sie den AFM-Ausleger am Sondenhalter. Schließen Sie den Kopf an das System an und verriegeln Sie die Schwalbenschwanzschlösser. Schalten Sie den AFM-Laserstrahlschalter ein und klicken Sie im Sondenwechselfenster auf Weiter.Klicken Sie im Pop-up-Fenster auf "Nein", wenn sich der Freischwingertyp nicht geändert hat, und passen Sie die optischen Ausrichtungsknöpfe an, um den Ausleger zu finden. Passen Sie den Fokus auf den Ausleger an, und klicken Sie auf weiter. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Ja, wenn der Fokus auf dem Ausleger liegt.Verwenden Sie die Erkennungslaserstrahlknöpfe, um den Laserstrahl am Ende des Auslegers zu positionieren. Verwenden Sie die umgelenkten Laserstrahlknöpfe, um das Gesamtsignal der vier Quadranten-Fotodiode auf mindestens einen Volt zu maximieren. Klicken Sie im Fenster "Prüfpunktändern" auf Weiter und schließen Sie.Nachdem Sie 15 Minuten gewartet haben, bis der Ausleger thermische Stabilität erreicht hat, stellen Sie bei Bedarf die Position des abgelenkten Laserstrahls auf der positionsempfindlichen Fotodiode nach. Klicken Sie auf NCM Sweep, wählen Sie die gewünschte Amplitude der Schwingung, klicken Sie auf Phase verwenden und klicken Sie auf Auto. Stimmen Sie den Ausleger nahe an das Maximum seiner ersten freien Schwingungsresonanz auf ca. 300 Kilohertz für einen Ausleger mit einer Federkonstante von 40 Newton pro Meter.Legen Sie die Probe auf den Probenhalter. Klicken Sie auf Scanbereich, und legen Sie die Auflösung auf 256 x 256 und 1024 x 1024 Pixel fest, und legen Sie dann die Scangröße und die Pixelzahl fest. Legen Sie die Scanrate für eine Scanfläche von einem mal eins bis fünf mal fünf Mikrometer quadratisch auf 0,3 auf einen Hertz fest.Konzentrieren Sie die optische Ansicht auf die Probe, und klicken Sie auf den Ansatz, um sich der Probenoberfläche zu nähern. Klicken Sie als Nächstes auf 100 Mikrometer, um die AFM-Spitze 100 Mikrometer über die Oberfläche der Probe zu heben, und klicken Sie auf erweitern auf das optische Bild der Probe. Klicken Sie auf die Fokusstufenleiste, um die Ansicht auf die Oberfläche des Beispiels zu fokussieren, und verwenden Sie die Pfeile, um sich im Bereich der betreffenden Probe zu bewegen.Klicken Sie auf Ansatz, um die Oberfläche einzubinden, und klicken Sie auf Linienscan, um zu überprüfen, ob die Spitze der Oberfläche gut folgt. Passen Sie den Sollwert nach Bedarf an. Klicken Sie dann auf Scannen, um mit der Bildgebung der Probenoberfläche zu beginnen, wobei ein konstantes Regime von Phasenänderungen beibehalten wird, das Delta 20 während der Bildgebung nicht überschreitet, um eine große Bildkraft zu vermeiden und die Konsistenz zwischen unabhängigen Proben aufrechtzuerhalten.Für die IR-Nanospektroskopie-Bildgebung, 30 bis 60 Minuten vor der Analyse, schalten Sie das AFM IR-System und den IR-Laser ein. Öffnen Sie die eingebaute Software, um das Instrument zu steuern und klicken Sie auf Datei und neu, um eine neue Nano-IR-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf Initialisieren, um das AFM IR-System zu starten und die Instrumentenabdeckung zu öffnen.Montieren Sie eine silikongoldbeschichtete Sonde mit einem Nennradius von 30 Nanometern und einer Federkonstante von 0,2 Newton pro Meter auf das AFM IR-System, um die Probe im Kontaktmodus zu messen. Klicken Sie im AFM-Prüfpunkt und als nächstes auf Laden. Verwenden Sie den Fokus auf Sondenpfeile, um die Kamera auf den Ausleger zu fokussieren, und verwenden Sie die Spitze, um das Fadenkreuz am Ende des Auslegers zu platzieren.Drehen Sie die Knöpfe, die die Position des Erkennungslasers steuern, um den Laser am Ende des Auslegers zu positionieren. Drehen Sie die Laserknöpfe, um die von der vier Quadranten-Fotodiode gemessene Summe auf einen Wert größer als drei Volt zu erkennen und zu maximieren. Drehen Sie den Umlenkknopf, um die Auslegerablenkung auf minus einen Volt einzustellen, und klicken Sie auf weiter.Schließen Sie dann die Abdeckung des Instruments. Verwenden Sie den Fokus auf Dieonpfeile, um die Kamera auf das Beispiel zu fokussieren, und kippen Sie die Pfeile des Fadenkreuzs, um sich im Bereich des Interesses der Probe zu bewegen. Klicken Sie als nächstes und engagieren Sie sich.Wählen Sie im Mikroskopfenster die Höhe für die Morphologie, die Amplitude zwei für die IR-Absorption und die PLL-Frequenz aus, um die Spitze für die Probenresonanz abzubilden. Legen Sie im AFM-Scan-Bereich die Parameter fest, wie für die AFM-Bildgebung gezeigt, und klicken Sie auf Scannen, um eine Morphologiekarte zu erhalten. Wenn die Morphologie-Zuordnung abgeschlossen ist, klicken Sie im Mikroskopfenster auf die Höhenkarte, um die Sonde oben auf einem Aggregat zu positionieren.Klicken Sie im Bereich Nano IR auf IR starten, um die Probe mit dem IR-Laser zu beleuchten. Um den Infrarotlaser auf den Ausleger zu fokussieren, klicken Sie auf Optimieren und geben Sie 1655 Zentimeter für die Wellenzahl ein. Klicken Sie auf Hinzufügen und Scannen, um die IR-Laserposition zu bestimmen, und klicken Sie auf Aktualisieren und okay, um seine Position am Ausleger auszurichten.Geben Sie im allgemeinen Abschnitt eine Wellenzahl ein, für die eine hohe Absorption im relativen Feld erwartet wird, und deaktivieren Sie die Bandpassfilteroption. Klicken Sie auf IR starten und überprüfen Sie dann den Zählerstand und die FFT der Auslegerantwort. Bewegen Sie im FFT-Fenster den grünen Cursor, um die Resonanzfrequenz des Auslegers zu lesen.Ein typischer Wert der FFT der Resonanz der Ausleger beträgt rund 200 Kilohertz. Geben Sie den erzeugten Resonanzfrequenzwert im allgemeinen Abschnitt im Frequenzbereichsfeld ein und verwenden Sie ein Frequenzfenster von 50 Kilohertz. Klicken Sie auf das Fenster laserpulstune, um den Resonanz-verbesserten Modus auszuwählen und eine Pulsrate von 222 Kilohertz, einen Melodiebereich von 50 Kilohertz und einen Laser-Duty-Zyklus von 5%Klicken Sie erfassen, um die Pulsfrequenz des Lasers zu fegen.Verwenden Sie den Cursor, um den Laserpuls auf die Frequenz der mechanischen Reaktion der thermischen Ausdehnung der Probe einzustellen, die das IR-Licht absorbiert. Wählen Sie dann eine Phasenschleife aus, um die Kontaktresonanz zwischen der Probe und der Spitze zu überwachen, und klicken Sie auf Null. Verfolgen Sie bei anderen chemischen Eigenschaften im Nanomaßstab die Kontaktresonanz während der Spektrenerfassung, um sicherzustellen, dass das Probenspektrum nicht durch Überhitzung und Erweichung beeinflusst wird.Wählen Sie aktivieren, um die Probe zu verfolgen, um die Kontaktresonanz zu kippen, und wählen Sie eine integrale Verstärkung von 0,5 und eine proportionale Verstärkung von 10 aus, und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie im Optimierungsfenster auf die Wellenlänge und scannen Sie, um den IR-Laser für mindestens drei Wellenzahlen zu lokalisieren, die den großen Absorptionsbändern der Probe entsprechen, und für mindestens eine Wellenzahl für jeden Chip des Lasers. Klicken Sie auf Werkzeuge, IR-Hintergrundkalibrierung und neu, und stellen Sie die Wellenzahlen auf 1200 bis 1800 Zentimeter ein. Legen Sie die Hintergründe auf durchschnittlich auf eins, den Tastzyklus von 5 % und die Sweep-Geschwindigkeit auf 100 Zentimeter im Quadrat fest.Klicken Sie auf Acquire, um den IR-Laserhintergrund für die Normalisierung der gemessenen nanoskaligen lokalisierten Spektren zu messen, die Datei zu speichern und das Fenster zu schließen. Wählen Sie in den IR-Spektreneinstellungen eine IR-Spektrumauflösung zwischen einem und vier Zentimetern und eine Anzahl von Co-Durchschnitten von mindestens 64 Mal aus. Klicken Sie dann auf Acquire, um ein nanoskaliges lokalisiertes IR-Spektrum im Proteinbereich zu messen.Um eine im Nanomaßstab aufgelöste chemische Karte zu erhalten, wählen Sie 1655 Zentimeter und IR-Bildgebung aus und klicken Sie im AFM-Scanfenster auf Scannen. Wenn die Zuordnung abgeschlossen ist, speichern Sie die Messungen. Verwenden Sie dann die eingebaute AFM-Bildverarbeitungssoftware, um die erworbenen Karten der Morphologie, Kontaktresonanz und Chemie sowie lokalisierte Spektren im Nanomaßstab zu analysieren.Es ist ein kritischer Schritt, um eine hochreine monomere Lösung zu erhalten, da das Vorhandensein von aggregierten Arten zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Kinetik führen und Artefakte in Ihre Messungen einführen kann. Ein wesentlicher Faktor für die erfolgreiche Untersuchung biologischer Proben mit hoher Heterogenität ist die korrekte Position fester Substrate. Die mikrofluidische Sprühabscheidung kann anstelle einer manuellen verwendet werden, um die Probenarchitektur und Heterogenität zu erhalten.Diese Methoden ebnen den Weg für die Entschlüsselung der chemischen Struktur und Eigenschaften einzelner Biomoleküle und ihrer Wechselwirkungen in physiologischer und nativer flüssiger Umgebung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Montage eines Nahfeld-Infrarot-Mikroskop für die Bildgebung Proteinaggregaten beschrieben.

Montage, Tuning und Verwenden eines aperturlosen Near Field Infrared Mikroskop für Protein Imaging

A-Tapping-Modus Rasterkraftmikroskop (AFM)-Methode zur Visualisierung von Plasmid-DNA, cytoplasmatische Proteine ​​und DNA-Protein-Komplexen beschrieben. Das Verfahren umfasst das alternative Ansätze zur Vorbereitung der Proben für AFM folgenden biochemischen Manipulation. DNA mit spezifischen Protein interagiert Regionen sind in der Nähe-physiologischen Puffer Bedingungen beobachtet.

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Eine Methode zur Untersuchung der Struktur eines Protein-Photorezeptors mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) wird in diesem Artikel beschrieben. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) zeigt intakte Proteindimere auf einer Glimmeroberfläche.

Atomic Force Microscopy von Red-Light Photorezeptoren Mit Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung

Wir beschreiben die detaillierte Verfahren und Strategien zur Messung der mechanischen Eigenschaften und mechanische entfaltenden Wege der einzelnen Protein-Moleküle mit einem Rasterkraftmikroskop. Wir zeigen auch repräsentative Ergebnisse als Referenz für die Auswahl und Begründung der gute einzelne Protein-Molekül-Aufnahmen.

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

Dieses Protokoll beschreibt die kovalente Immobilisierung von Proteinen mit einer Heterobifunctional Silan Haftvermittler auf Siliziumoxid Oberflächen für die atomic Force Mikroskopie basierend Einzelmolekül Kraft Spektroskopie entwickelt die am Beispiel der Interaktion von RrgA (Pilus-1 Tipp adhäsin des Streptococcus Pneumoniae) mit Fibronektin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Rasterkraftmikroskopie-Infrarotspektroskopie (AFM-IR) bietet eine leistungsstarke Plattform für Bakterienstudien, die es ermöglicht, eine nanoskalige Auflösung zu erreichen. Sowohl die Abbildung subzellulärer Veränderungen (z. B. bei Zellteilung) als auch vergleichende Untersuchungen der chemischen Zusammensetzung (z. B. durch Arzneimittelresistenz) können auf Einzelzellebene in Bakterien durchgeführt werden.

Rasterkraftmikroskopie kombiniert mit Infrarotspektroskopie als Werkzeug zur Untersuchung der Chemie einzelner Bakterien

Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Rasterkraftmikroskopie und der nanoskaligen Infrarotspektroskopie zur Bewertung der Leistungsfähigkeit der photothermischen nanoskaligen Infrarotspektroskopie bei der Charakterisierung dreidimensionaler multipolymerer Proben.

Fortschritte in der nanoskaligen Infrarotspektroskopie zur Erforschung mehrphasiger Polymersysteme

Lernen Sie die Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Einblicke in neurodegenerative Erkrankungen und biotechnologische Anwendungen.

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

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