Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

Methoden auf Basis der Atomkraftmikroskopie ermöglichen es, biomolekulare Prozesse im Nanomaßstab mit morphologischer chemischer oder struktureller Auflösung zu charakterisieren und schließlich ein neues Frontfenster zur Beobachtung der Biologie zu öffnen. Einzelmolekülmethoden ermöglichen die Untersuchung hochheterogener Systeme, ein Merkmal, das für das Verständnis der Proteinaggregation besonders relevant ist. Durch die Kombination einzelner Moleküle mit Rückenansätzen können wir grundlegende Informationen über das Verhalten von Proteinen, ihre Verbindungen mit menschlichen Krankheiten und das Design pharmakologischer Interventionen erhalten, die erfolgreich sein können.

Darüber hinaus kann diese Methode erfolgreich angewendet werden, um die chemischen und strukturellen Eigenschaften von Biomaterialien für die Arzneimittelabgabe, Anwendungen und andere biotechnologische Zwecke zu untersuchen. Es kann zunächst eine Herausforderung sein, die richtigen AFM-Parameter für eine hohe Auflösung einzustellen, und es ist einfach, Ihren AFM einzurichten, während Sie Ihre Fibrillaraggregate messen. 30 Minuten vor der AFM-Bildgebung schalten Sie das AFM-System ein und klicken Sie auf Einrichten und Sonden.

Klicken Sie im Fenster "Prüfpunktwechsel" auf next, um die Z-Fokusstufe vorzubereiten. Schalten Sie den AFM-Strahlschalter aus, wenn er eingeschaltet ist, und entsperren Sie die Schwalbenschwanzschlösser. Trennen Sie den Kopf vom System, und klicken Sie im Fenster zum Sondenwechsel auf Weiter.

Montieren Sie den AFM-Ausleger am Sondenhalter. Schließen Sie den Kopf an das System an und verriegeln Sie die Schwalbenschwanzschlösser. Schalten Sie den AFM-Laserstrahlschalter ein und klicken Sie im Sondenwechselfenster auf Weiter.

Klicken Sie im Pop-up-Fenster auf "Nein", wenn sich der Freischwingertyp nicht geändert hat, und passen Sie die optischen Ausrichtungsknöpfe an, um den Ausleger zu finden. Passen Sie den Fokus auf den Ausleger an, und klicken Sie auf weiter. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Ja, wenn der Fokus auf dem Ausleger liegt.

Verwenden Sie die Erkennungslaserstrahlknöpfe, um den Laserstrahl am Ende des Auslegers zu positionieren. Verwenden Sie die umgelenkten Laserstrahlknöpfe, um das Gesamtsignal der vier Quadranten-Fotodiode auf mindestens einen Volt zu maximieren. Klicken Sie im Fenster "Prüfpunktändern" auf Weiter und schließen Sie.

Nachdem Sie 15 Minuten gewartet haben, bis der Ausleger thermische Stabilität erreicht hat, stellen Sie bei Bedarf die Position des abgelenkten Laserstrahls auf der positionsempfindlichen Fotodiode nach. Klicken Sie auf NCM Sweep, wählen Sie die gewünschte Amplitude der Schwingung, klicken Sie auf Phase verwenden und klicken Sie auf Auto. Stimmen Sie den Ausleger nahe an das Maximum seiner ersten freien Schwingungsresonanz auf ca. 300 Kilohertz für einen Ausleger mit einer Federkonstante von 40 Newton pro Meter.

Legen Sie die Probe auf den Probenhalter. Klicken Sie auf Scanbereich, und legen Sie die Auflösung auf 256 x 256 und 1024 x 1024 Pixel fest, und legen Sie dann die Scangröße und die Pixelzahl fest. Legen Sie die Scanrate für eine Scanfläche von einem mal eins bis fünf mal fünf Mikrometer quadratisch auf 0,3 auf einen Hertz fest.

Konzentrieren Sie die optische Ansicht auf die Probe, und klicken Sie auf den Ansatz, um sich der Probenoberfläche zu nähern. Klicken Sie als Nächstes auf 100 Mikrometer, um die AFM-Spitze 100 Mikrometer über die Oberfläche der Probe zu heben, und klicken Sie auf erweitern auf das optische Bild der Probe. Klicken Sie auf die Fokusstufenleiste, um die Ansicht auf die Oberfläche des Beispiels zu fokussieren, und verwenden Sie die Pfeile, um sich im Bereich der betreffenden Probe zu bewegen.

Klicken Sie auf Ansatz, um die Oberfläche einzubinden, und klicken Sie auf Linienscan, um zu überprüfen, ob die Spitze der Oberfläche gut folgt. Passen Sie den Sollwert nach Bedarf an. Klicken Sie dann auf Scannen, um mit der Bildgebung der Probenoberfläche zu beginnen, wobei ein konstantes Regime von Phasenänderungen beibehalten wird, das Delta 20 während der Bildgebung nicht überschreitet, um eine große Bildkraft zu vermeiden und die Konsistenz zwischen unabhängigen Proben aufrechtzuerhalten.

Für die IR-Nanospektroskopie-Bildgebung, 30 bis 60 Minuten vor der Analyse, schalten Sie das AFM IR-System und den IR-Laser ein. Öffnen Sie die eingebaute Software, um das Instrument zu steuern und klicken Sie auf Datei und neu, um eine neue Nano-IR-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf Initialisieren, um das AFM IR-System zu starten und die Instrumentenabdeckung zu öffnen.

Montieren Sie eine silikongoldbeschichtete Sonde mit einem Nennradius von 30 Nanometern und einer Federkonstante von 0,2 Newton pro Meter auf das AFM IR-System, um die Probe im Kontaktmodus zu messen. Klicken Sie im AFM-Prüfpunkt und als nächstes auf Laden. Verwenden Sie den Fokus auf Sondenpfeile, um die Kamera auf den Ausleger zu fokussieren, und verwenden Sie die Spitze, um das Fadenkreuz am Ende des Auslegers zu platzieren.

Drehen Sie die Knöpfe, die die Position des Erkennungslasers steuern, um den Laser am Ende des Auslegers zu positionieren. Drehen Sie die Laserknöpfe, um die von der vier Quadranten-Fotodiode gemessene Summe auf einen Wert größer als drei Volt zu erkennen und zu maximieren. Drehen Sie den Umlenkknopf, um die Auslegerablenkung auf minus einen Volt einzustellen, und klicken Sie auf weiter.

Schließen Sie dann die Abdeckung des Instruments. Verwenden Sie den Fokus auf Dieonpfeile, um die Kamera auf das Beispiel zu fokussieren, und kippen Sie die Pfeile des Fadenkreuzs, um sich im Bereich des Interesses der Probe zu bewegen. Klicken Sie als nächstes und engagieren Sie sich.

Wählen Sie im Mikroskopfenster die Höhe für die Morphologie, die Amplitude zwei für die IR-Absorption und die PLL-Frequenz aus, um die Spitze für die Probenresonanz abzubilden. Legen Sie im AFM-Scan-Bereich die Parameter fest, wie für die AFM-Bildgebung gezeigt, und klicken Sie auf Scannen, um eine Morphologiekarte zu erhalten. Wenn die Morphologie-Zuordnung abgeschlossen ist, klicken Sie im Mikroskopfenster auf die Höhenkarte, um die Sonde oben auf einem Aggregat zu positionieren.

Klicken Sie im Bereich Nano IR auf IR starten, um die Probe mit dem IR-Laser zu beleuchten. Um den Infrarotlaser auf den Ausleger zu fokussieren, klicken Sie auf Optimieren und geben Sie 1655 Zentimeter für die Wellenzahl ein. Klicken Sie auf Hinzufügen und Scannen, um die IR-Laserposition zu bestimmen, und klicken Sie auf Aktualisieren und okay, um seine Position am Ausleger auszurichten.

Geben Sie im allgemeinen Abschnitt eine Wellenzahl ein, für die eine hohe Absorption im relativen Feld erwartet wird, und deaktivieren Sie die Bandpassfilteroption. Klicken Sie auf IR starten und überprüfen Sie dann den Zählerstand und die FFT der Auslegerantwort. Bewegen Sie im FFT-Fenster den grünen Cursor, um die Resonanzfrequenz des Auslegers zu lesen.

Ein typischer Wert der FFT der Resonanz der Ausleger beträgt rund 200 Kilohertz. Geben Sie den erzeugten Resonanzfrequenzwert im allgemeinen Abschnitt im Frequenzbereichsfeld ein und verwenden Sie ein Frequenzfenster von 50 Kilohertz. Klicken Sie auf das Fenster laserpulstune, um den Resonanz-verbesserten Modus auszuwählen und eine Pulsrate von 222 Kilohertz, einen Melodiebereich von 50 Kilohertz und einen Laser-Duty-Zyklus von 5%Klicken Sie erfassen, um die Pulsfrequenz des Lasers zu fegen.

Verwenden Sie den Cursor, um den Laserpuls auf die Frequenz der mechanischen Reaktion der thermischen Ausdehnung der Probe einzustellen, die das IR-Licht absorbiert. Wählen Sie dann eine Phasenschleife aus, um die Kontaktresonanz zwischen der Probe und der Spitze zu überwachen, und klicken Sie auf Null. Verfolgen Sie bei anderen chemischen Eigenschaften im Nanomaßstab die Kontaktresonanz während der Spektrenerfassung, um sicherzustellen, dass das Probenspektrum nicht durch Überhitzung und Erweichung beeinflusst wird.

Wählen Sie aktivieren, um die Probe zu verfolgen, um die Kontaktresonanz zu kippen, und wählen Sie eine integrale Verstärkung von 0,5 und eine proportionale Verstärkung von 10 aus, und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie im Optimierungsfenster auf die Wellenlänge und scannen Sie, um den IR-Laser für mindestens drei Wellenzahlen zu lokalisieren, die den großen Absorptionsbändern der Probe entsprechen, und für mindestens eine Wellenzahl für jeden Chip des Lasers. Klicken Sie auf Werkzeuge, IR-Hintergrundkalibrierung und neu, und stellen Sie die Wellenzahlen auf 1200 bis 1800 Zentimeter ein. Legen Sie die Hintergründe auf durchschnittlich auf eins, den Tastzyklus von 5 % und die Sweep-Geschwindigkeit auf 100 Zentimeter im Quadrat fest.

Klicken Sie auf Acquire, um den IR-Laserhintergrund für die Normalisierung der gemessenen nanoskaligen lokalisierten Spektren zu messen, die Datei zu speichern und das Fenster zu schließen. Wählen Sie in den IR-Spektreneinstellungen eine IR-Spektrumauflösung zwischen einem und vier Zentimetern und eine Anzahl von Co-Durchschnitten von mindestens 64 Mal aus. Klicken Sie dann auf Acquire, um ein nanoskaliges lokalisiertes IR-Spektrum im Proteinbereich zu messen.

Um eine im Nanomaßstab aufgelöste chemische Karte zu erhalten, wählen Sie 1655 Zentimeter und IR-Bildgebung aus und klicken Sie im AFM-Scanfenster auf Scannen. Wenn die Zuordnung abgeschlossen ist, speichern Sie die Messungen. Verwenden Sie dann die eingebaute AFM-Bildverarbeitungssoftware, um die erworbenen Karten der Morphologie, Kontaktresonanz und Chemie sowie lokalisierte Spektren im Nanomaßstab zu analysieren.

Es ist ein kritischer Schritt, um eine hochreine monomere Lösung zu erhalten, da das Vorhandensein von aggregierten Arten zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Kinetik führen und Artefakte in Ihre Messungen einführen kann. Ein wesentlicher Faktor für die erfolgreiche Untersuchung biologischer Proben mit hoher Heterogenität ist die korrekte Position fester Substrate. Die mikrofluidische Sprühabscheidung kann anstelle einer manuellen verwendet werden, um die Probenarchitektur und Heterogenität zu erhalten.

Diese Methoden ebnen den Weg für die Entschlüsselung der chemischen Struktur und Eigenschaften einzelner Biomoleküle und ihrer Wechselwirkungen in physiologischer und nativer flüssiger Umgebung.