Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben

Gewebe, die für die Immunhistochemie und für die diagnostische Histopathologie verwendet werden, werden routinemäßig in 10% Phosphatpufferformin fixiert. Der Nachweis von Tollwutvirus-Antigen im Gehirngewebe, das in Formalin fixiert wurde, stellt eine einzigartige Herausforderung dar, und der IHC-Test hat sich als empfindliche und spezifische Methode zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen erwiesen. Der Hauptvorteil der Biopsie oder anderer Nachweismethoden besteht darin, dass Antigene in Bezug auf Gewebe und Zellmorphologie nachgewiesen werden können.

Mit IHC liefert die Lokalisation des Tollwutigens in Gehirn- und Nicht-Hirngeweben zusätzliche Informationen, die durch routinemäßige Hämatoxylin- und Eosin-Fleckenabschnitte nicht erhalten werden konnten. Tollwutdiagnostische Tests sind wichtig für die Einleitung der Postexpositionsprophylaxe bei Menschen, die dem Tollwutvirus ausgesetzt sind. IHC ist einer der am häufigsten durchgeführten Assays an formalinfixierten Geweben.

Mit spezifischen Antikörpern kann es zum Nachweis entsprechender Krankheitserreger eingesetzt werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie drei bis fünf Millimeter Hirngewebe, die nach der Nekropsie gesammelt wurden, für 24 bis 72 Stunden in eine 10% ige gepufferte Formalinlösung. Notieren Sie das ungefähre Gewebegewicht, den Gewebetyp und das Volumen von Formalin.

Legen Sie das Gewebe in 70% Ethanol für eine längere Gewebelagerung nach der Formalinfixierung und vor der Verarbeitung. Sezieren Sie nach der Probenfixierung das Gewebe, um die wichtigen Hirnareale wie Querschnitte des Hirnstamms, des Kleinhirns oder des Hippocampus einzubeziehen. Jeweils auf eine Dicke zwischen drei und fünf Millimetern zugeschnitten.

Legen Sie das Gewebe in Verarbeitungskassetten. Verarbeiten Sie die Gewebekassetten für die Paraffinwachsinfiltration. Betten Sie sie in Paraffinblöcke ein und teilen Sie sie auf einem Mikrotom auf.

Richten Sie zunächst die Färbeschale wie in Abbildung 1 des Textprotokolls beschrieben ein. Füllen Sie jedes Gericht mit 250 Millilitern der vorbereiteten Lösung. Um die AEC-Substrat-Stammlösung vorzubereiten, verwenden Sie eine Glaspipette, um eine 20-Milligramm-Tablette AEC in 5 Milliliter N, N-Dimethylformamid aufzulösen.

Um die Protease-Stammlösung vorzubereiten, lösen Sie 7 Milligramm der Protease in 200 Milliliter PBS. Um den Spülpuffer vorzubereiten, fügen Sie 100 Milliliter Tween 80 bis 990 Milliliter PBS hinzu und mischen Sie gut, um eine homogene Lösung von PBT-T zu bilden. Machen Sie mit einem Mikrotom einen Paraffinschnitt von fünf Mikrometern.

Laden Sie den Abschnitt bei 38 Grad Celsius auf ein Wasserbad und sammeln Sie ihn auf Glasobjektträgern. Beschriften Sie die Objektträger mit einem reagenzienfesten Stift. Die Dias auf ein Tablett legen und in einem Ofen bei 55 bis 60 Grad Celsius eine Stunde lang schmelzen.

Dann entfernen Sie die Dias aus dem Ofen und entparaffinisieren Sie sie sofort mit 3 aufeinanderfolgenden Xylolspülungen von jeweils 5 Minuten. Danach rehydrieren Sie die Abschnitte auf dem Objektträger durch sequenzielles Eintauchen in abnehmende Verdünnungen von Ethanol zu entionisiertem Wasser, wie im Textprotokoll beschrieben. Behandeln Sie die Objektträger 30 Minuten lang mit der Protease für die proteolytische Antigenentnahme, spülen Sie die Objektträger dann 10 Minuten lang in PBS-T aus und behandeln Sie sie 10 Minuten lang mit 3% Wasserstoffperoxid.

Danach waschen Sie die Dias erneut mit PBS-T für 10 Minuten. Entfernen Sie zunächst einen Schieber aus dem Puffer, stellen Sie sicher, dass Sie nur einen Objektträger gleichzeitig handhaben, während die anderen untergetaucht bleiben, und verwenden Sie ein Papiertuch, um überschüssigen Puffer aus dem Gewebeabschnitt abzutellen. Legen Sie die Dias in eine Feuchtigkeitskammer und inkubieren Sie sie mit normalem Ziegenserum bei Raumtemperatur für 15 Minuten.

Als nächstes inkubieren Sie die Objektträger in der Feuchtigkeitskammer mit dem optimalen vorbestimmten primären Anti-Tollwut-Antikörper und negativen Kontrollantikörpern bei Raumtemperatur für 60 Minuten ohne Wäsche dazwischen. Danach die Objektträger 10 Minuten mit PBS-T waschen und 15 Minuten in einer Feuchtigkeitskammer mit dem biotinylierten Antikörper bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Dias erneut mit PBS-T für 10 Minuten.

Inkubieren Sie die Dias und die Feuchtigkeitskammer mit Streifenteilung und HRB-Komplex bei Raumtemperatur für 15 Minuten und waschen Sie die PBS-T für 10 Minuten. Dann mit AEC in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren. Waschen Sie die Dias 10 Minuten lang in entionisiertem Wasser und halten Sie sie mit Gill's Hematoxilyn fest, das zwei Minuten lang ein bis zwei minuten lang mit entionisiertem Wasser verdünnt wird.

Danach spülen Sie das überschüssige Hämatoxylin ab, indem Sie die Objektträger in entionisiertes Wasser tauchen. Spülen Sie die Rutschen 30 Sekunden lang in Scott's Tap Water ab und waschen Sie sie 10 Minuten lang in entionisiertem Wasser. Entfernen Sie die Dias nacheinander und montieren Sie sie mit wasserlöslichem Montagemedium.

Verwenden Sie dann ein Lichtmikroskop, um die Dias zu lesen. In dieser Studie wird ein immunzytärer Chemietest zum Nachweis von Tollwutvirusantigen als alternativer diagnostischer Test für formalinfixierte Gewebe nachgewiesen. Ein repräsentatives immunzytäres chemisches Färbeergebnis von positiven und negativen Kontrollproben in verschiedenen Hirngeweben, einschließlich des Hirnstamms, der Kleinhirn- und Purkinje-Zellen sowie des Hippocampus, wird hier gezeigt.

Die magentarote Färbung, die die Farbentwicklung durch Verwendung von AEC-Substrat vor dem blauen gegengefärbten Hintergrund anzeigt, ist auf die Reaktivität von Antikörpern gegen das Tollwutidemigen zurückzuführen. Ein positives Ergebnis in der Immunhistochemie entspricht der magentaroten Färbung in den Gewebeschnitten. Die Färbung von zytoplasmatischen Einschlüssen und körnigen Einschlüssen unterschiedlicher Größe weist auf Proben hin, die positiv auf RABV-Infektionen sind.

Proben gelten als negativ, wenn keine spezifische rote Färbung oder nur der blaue Hintergrund aufgrund von Hämatoxylin beobachtet wurde. Zusätzlich zur positiven Färbung könnte die Verteilung der Einschlüsse eine indirekte Quantifizierung der Konzentrationen des Tollwutiquantigens in der Probe ermöglichen, die der Viruslast der Gewebeprobe entsprechen könnte. Unabhängig von den Verteilungsgraden wird jede spezifische Färbung die Probe als positiv für den RABV-Antigennachweis klassifizieren.

Gewebe sollten ausreichend in Formalin fixiert werden und vermeiden, das Gewebe während dieses Prozesses einzufrieren. Tollwutantigen wird von IHC nachgewiesen, dann können molekulare Techniken an Paraffinabschnitten durchgeführt werden, um die Lyssavirus-Variante basierend auf RNA-Sequenzinformationen zu bestimmen. Reagenzien wie Xylol und Formalin sollten in Abzug behandelt werden.

Beim Umgang mit AEC ist Vorsicht geboten, da es krebserregend ist.