Name: Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Lernen Sie die Immunhistochemie zur sensitiven und spezifischen Detektion von Lyssavirus-Antigenen in formalinfixiertem Hirngewebe. Diese Methode ermöglicht die präzise Lokalisation von Antigenen im morphologischen Kontext.

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Wir danken den Arbeitern, Epidemiologen und Verbundenen der Gesundheitsbehörden für die Probeneinreichungen an die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Position der Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention dar. Die Verwendung von Handelsnamen und kommerziellen Quellen ist nur zur Identifizierung und impliziert keine Billigung durch die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention.

Während das IHC-Protokoll an formalinfixierten Geweben durchgeführt wurde, die RABV inaktivieren, falls vorhanden, sollten geeignete Biosicherheitsprotokolle ordnungsgemäß befolgt werden. Alle Biosicherheitsverfahren sind in der Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) beschrieben, einschließlich des Tragens geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) und der Impfpflicht wie beschrieben12. Darüber hinaus sollte die ordnungsgemäße Eindämmung und Handhabung gefährlicher Chemikalien (wie Formalin, AEC und Xylol) (z. B. Abzüge) befolgt werden.
1. Formalinfixierung von Geweben
<ol><li>3-5 mm Hirngewebe, das nach der Nekropsie13 gesammelt wurde, werden für 24-72 h in 10% phosphatgepufferte Formalinlösung (1:20 bis 1:50 Gewebe/Formalin-Verhältnis) gebracht. ACHTUNG: Formalin ist ein toxisches Fixiermittel.</li>
	<li>Zeichnen Sie das ungefähre Gewebegewicht (Größe), den Gewebetyp (Hirnareale) und das Volumen von Formalin auf. Für Labore ist es wichtig, Aufzeichnungen über Fixationszeiten zu dokumentieren und zu führen.</li>
	<li>Für eine längere Gewebelagerung nach der Formalinfixierung und vor der Verarbeitung legen Sie das Gewebe in 70% Ethanol.</li>
</ol>2. Gewebeverarbeitung
<ol><li>Sezieren Sie nach der Probenfixierung das Gewebe, um die wichtigen Hirnareale einzubeziehen, z. B. Querschnitte des Hirnstamms, des Kleinhirns (3 Lappen) oder des Hippocampus (beide Hippocampi), die jeweils 3 bis 5 mm dick geschnitten und in Verarbeitungskassetten gelegt werden.</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Gewebekassetten für die Paraffinwachsinfiltration, eingebettet in Paraffinblöcke und schnitten (3 bis 6 μm) auf einem Mikrotom.</li>
</ol>3. Zubereitung von Materialien / Färbeschalen
<ol><li>Richten Sie die Färbeschale14 (Materialtabelle) wie in Abbildung 1 dargestellt ein. Füllen Sie jede Schüssel mit 250 ml der Lösung.</li>
	<li>Herstellung der 3-Amino-9-ethylcarbizol (AEC) Substrat-Stammlösung<ol>
<li>Eine 20 mg Tablette 3-Amino 9-ethylcarbazol (AEC) wird mit einer Glaspipette in 5 ml N,N,Dimethylformamid gelöst. ACHTUNG: AEC ist ein Karzinogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung der Protease (z.B. Pronase) Stammlösung für die Antigengewinnung<ol>
<li>7 mg der Protease in 200 ml PBS auflösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung des Spülpuffers PBS-T<ol>
<li>Fügen Sie 10 ml Tween 80 bis 990 ml PBS hinzu. Mischen Sie es gut, um eine homogene Lösung zu bilden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Entparaffinisierung und Geweberehydratation
<ol><li>Machen Sie 5 μm Paraffinschnitt mit einem Mikrotom, schwimmen Sie es auf einem Wasserbad bei 38 °C und sammeln Sie es auf Glasobjektträgern. Beschriften Sie die Dias mit einem reagenzienfesten Stift/Marker.</li>
	<li>Die Dias auf ein Tablett legen und in einem 55-60 °C Backofen für 1 h schmelzen. Erhöhen Sie die Temperatur nicht über 60 °C, da dies das virale Antigen zerstören kann.</li>
	<li>Dias aus dem Ofen nehmen und sofort in 3 aufeinanderfolgenden Xylolspülungen von je 5 min in den Geschirren 1, 2 und 3 entparaffinisieren.</li>
	<li>Rehydrieren Sie die Abschnitte auf dem Objektträger durch sequenzielles Eintauchen in abnehmende Verdünnung von Ethanol zu entionisiertem Wasser: (4 bis 11 ist eine Tauchspülung) Schüssel 4: Xylol / 100% Ethanol (1: 1); Gericht 5: 100% Ethanol; Gericht 6: 100% Ethanol; Gericht 7: 95% Ethanol; Gericht 8: 95% Ethanol; Gericht 9: 80% Ethanol; Gericht 10: 70% Ethanol; Schale 11: entionisiertes Wasser (Abbildung 1. Dish Setup). ACHTUNG: Xylol ist eine gefährliche Chemikalie und die Arbeit sollte in einem Abzug durchgeführt werden.</li>
</ol>5. Proteolytische Antigengewinnung
<ol><li>Behandeln Sie Objektträger mit der Protease (2,5 μg/ ml PBS) für 30 minuten zur proteolytischen Antigenentnahme in Schüssel 12.</li>
	<li>Dann in PBS-T für 10 min abspülen (Schüssel 13).</li>
	<li>Mit 3% Wasserstoffperoxid für 10 min behandeln (Schale 14).</li>
	<li>Wieder mit PBS-T für 10 min waschen (Schale 15).</li>
</ol>6. Färbeverfahren
<ol><li>Behandeln Sie die Folien nacheinander, wobei die verbleibenden Folien im Puffer versunken bleiben (entfernen Sie nicht den gesamten Folienhalter - halten Sie die Folien nass). Entfernen Sie einen Objektträger und flecken Sie überschüssigen Puffer (mit einem Papiertuch) aus dem Gewebeabschnitt ab, wobei Sie darauf achten, den Gewebeabschnitt nicht zu stören. Inkubieren Sie Dias in einer Feuchtigkeitskammer, die durch Legen von angefeuchteten Papiertüchern hergestellt werden, auf die Laborbank Top14 bei Raumtemperatur mit normalem Ziegenserum (Blockierung) für 15 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit dem optimalen vorbestimmten primären Verdünnungsanti-Tollwut-Antikörper (1:250 Verdünnung des Maus-Tollwut-Serums, unveröffentlicht) (Positivkontrolle) und negativen Kontrollantikörpern bei Raumtemperatur wie oben (Schritt 6.1.) für 60 min ohne Waschungen dazwischen.</li>
	<li>Nach 60 min mit PBS-T 10 min waschen (Schale 16).</li>
	<li>Mit dem biotinylierten Antikörper (speziesspezifisch) in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren (Handhabung wie bei Schritt 6.1.).</li>
	<li>Mit PBS-T 10 min waschen (Schale 16).</li>
	<li>Mit Streptavidin-HRP-Komplex in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren (Handhabung wie 6.1.).</li>
	<li>Mit PBS-T 10 min waschen (Schale 16).</li>
	<li>Mit Peroxidasesubstrat, Amino-Ethylcarbazol (AEC), in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren. Machen Sie AEC kurz vor dem Gebrauch. Fügen Sie dazu 1 ml AEC-Stammlösung zu 14 ml 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,2, hinzu. 0,15 ml 3%H2O2hinzufügen. Filtern Sie die Mischung kurz vor Gebrauch (0,45 μm Filter). HINWEIS: Die Arbeitslösung von AEC ist nur für 2-3 h stabil. Die AEC-Lagerlösung kann länger im Kühlschrank aufbewahrt werden.</li>
	<li>In entionisiertem Wasser 10 min waschen (Schale 17)</li>
	<li>Gegenbefleckt mit Gill's Hämatoxylin 1:2 mit entionisiertem Wasser für 2 min verdünnt (Gericht 18).</li>
	<li>Überschüssiges Hämatoxylin mit entionisiertem Wasser abspülen (Schale 19 und 20).</li>
	<li>Spülen Sie in Scott's Leitungswasser 30 s (Bluing-Lösung) Schüssel 21.</li>
	<li>In entionisiertem Wasser 10 min waschen (Schale 22)</li>
	<li>Entfernen Sie die Schlitten nacheinander - montieren Sie sie mit wasserlöslichem Montagemedium.</li>
	<li>Lesen Sie Dias auf einem Lichtmikroskop.</li>
</ol>

<ol><li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+rabies%3A+current+conundrums%2C+concerns%2C+contradictions+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184(2017).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li>
<li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus%3A+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consulation+on+Rabies%2C+Third+Report%5BTitle%5D)+AND+%22WHO+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).</li>
<li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li>
<li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+direct%2C+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li>
<li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li>
<li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+five+year+%281985-1989%29+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Pathology%22%5BJournal%5D)">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Zentralblatt+fur+Veterinarmedizin+Reihe+B%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li>
<li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies+prevention--United+States%2C+2008%3A+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Reports+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. 1, 5th ed, 67-72 (2018).</li>
<li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diagnostic+procedures+for+antigen+detection%22">Diagnostic procedures for antigen detection</a>. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).</li>
<li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Aufgrund der hohen Sterblichkeitsrate der Tollwut nach Symptombeginn ist die Diagnose verdächtiger Tiere für eine RABV-Infektion äußerst kritisch für eine angemessene prophylaktische Behandlung nach der Exposition. Die Tollwutdiagnose hängt in erster Linie von DFA-, DRIT- und PCR-basierten Techniken mit frischem oder gefrorenem Gewebe ab. Für die Untersuchung von formalinfixiertem Gewebe bietet der IHC-Test eine alternative Methode zum sensitiven und spezifischen Nachweis von RABV-Antigen. Während die in Formalin fixiert...

Tollwut ist eine akute progressive Enzephalitis, die durch die RNA-Viren des negativen Sinnes der Gattung Lyssavirus1verursacht wird. Fast 99% aller todesfälle beim Menschen, die durch die Infektion mit dem Tollwutvirus (RABV), dem Typmitglied der Gattung, verursacht werden, werden von Hunden übertragen2. Die Tollwutdiagnose verdächtiger Tiere beruht auf dem Nachweis von Antigen (hauptsächlich viral kodiertes Nukleoprotein, N-Protein) im Komplex mit genomischer RNA (Ribonukleoproteinkomplex, RNP) im Hirngewebe3. Der Antigennachweis durch den direkt fluoreszierenden Antikörpertest (DFA) gilt als Goldstandard für die Tollwutdiagnose4. Das Verfahren verwendet frisches oder frisches gefrorenes Hirnmaterial, einen Berührungsabdruck auf einem Objektträger, Fixierung in Aceton, Färbung mit handelsüblichen fluoreszierenden Isothiocyanat (FITC) markierten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern (mAbs/pAbs) und wird von der Fluoreszenzmikroskopieabgelesen 5. Der DFA-Test ist schnell, empfindlich und spezifisch für den Nachweis von Tollwutantigen in frischem Hirngewebe. Vor kurzem wurde gezeigt, dass ein direkter immunhistochemischer Schnelltest (DRIT), eine modifizierte immunhistochemische (IHC) -Technik, eine ähnliche Empfindlichkeit wie DFA aufweist, aber den Vorteil der Lichtmikroskopie für die Visualisierung bietet6. Während die im DRIT verwendete Nachweismethode der IHC ähnelt, verwendet der erste Schritt frisches oder gefrorenes Gewebe, um Berührungsabdrücke der Probe zu erzeugen, gefolgt von einer Fixierung in Formalin.
IHC ist eine weit verbreitete Technik zur Bestimmung histologischer Veränderungen und zum Nachweis von Proteinen mit spezifischen Antikörpern in formalinfixierten Geweben, die in Paraffinblöcke eingebettet sind. IHC ist ein etablierter alternativer Test für den Tollwutantigennachweis in den Gewebeabschnitten7. IHC wurde insbesondere für die Diagnose von retrospektiven Fällen eingesetzt, die neurologische Erkrankungen aufwiesen, um die Belastung durch Tollwut zu bestimmen8. Paraffin-eingebettete formalinfixierte Gewebe bewahren die Proteine für den Nachweis auch nach mehreren Jahren, wenn sie bei Umgebungstemperatur9 gelagertwerden. Die Formalin-Behandlung modifiziert Proteine durch Vernetzung und Veränderung der Aminosäure-Seitenketten, wodurch die Epitope möglicherweise nicht mehr gegen Antikörper reaktiv sind10. Während der IHC-Test für den Nachweis von Tollwutantigen entweder mAbs oder pAbs umfasst, ist letzteres vorteilhaft, da mehrere Epitope und divergente Lyssaviren nachgewiesen werden können11.
Die Standardschritte bei IHC sind die Formalinfixierung von Geweben, die Einbettung in Paraffinblöcke, die Sektionierung von Geweben, die Deparaffinisierung und Hydratation, die Epitoprückgewinnung, die Reaktivität gegen primäre und sekundäre Antikörper und die Entwicklung mit chromogenen Substraten. Dieses Manuskript beschreibt einen detaillierten Bericht über das Protokoll zur Tollwutdiagnose. Für den Nachweis von Tollwutantigenen wird Mausserum, das mit RABV (pAbs) immunisiert ist, das an den US-amerikanischen Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, in Kombination mit biotinylierten sekundären Anti-Maus-Antikörpern erzeugt wurde, verwendet. Biotinylierte Abs werden durch Zugabe von Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP) -Komplex nachgewiesen, gefolgt von der Farbentwicklung mit Amino-Ethylcarbazol-Substrat.

<table><tbody><tr><td>3 % Wasserstoffperoxid</td><td>Pharamacy-Marken</td><td></td><td>von der Stange 3 % H2O2</td></tr><tr><td>3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>Acetat-Puffer pH 5,2</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>Gepuffertes Formalin 10% Phosphat gepuffert</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>zertifizierte</td></tr><tr><td>Deckgläser Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-471</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>Ethanol 190 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hämatoxylin-Formulierung #2</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td><td>Seracare</td><td>71-00-18</td><td>Maus Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>ImmunoHistoMount</td><td>Millipore Sigma</td><td>i1161</td><td>Eindeckmedien</td></tr><tr><td>N,N, Dimethylformamid GR</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>HyClone</td><td>RR14440.01</td><td>01M, pH 7,2 (pH 7,2-7,6)</td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMAT 40X/0,95 Objektiv</td><td>Mehrere Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0,75 Objektiv</td><td>Mehrere Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>53702</td><td>Protease, Streptomyces griseusScott's</td></tr> <tr><td>Leitungswasser</td><td>Poly Scientific F& Technik D Corp.</td><td>s1887</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Objektträger-Färbeset</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-80&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Histological Grade</td></tr><tr><td>Zeiss Axioplan 2 Bildgebung - Mikroskop</td><td>Mehrere Anbieter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunhistochemischer test für den lyssavirus-antigennachweis aus formalinfixierten geweben

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Eine der primären diagnostischen Modalitäten für Tollwut ist der Nachweis des viralen Ribonukleoprotein (RNP) -Komplexes (Antigen) in den infizierten Gewebeproben. Während der direkte fluoreszierende Antikörpertest (DFA) oder der direkte immunhistochemische Schnelltest (DRIT) am häufigsten für den Antigennachweis verwendet werden, benötigen beide Tests frisches und / oder gefrorenes Gewebe für Abdrücke auf Objektträgern vor dem Antigennachweis mit Antikörpern. Wenn Proben gesammelt und in Formalin fixiert werden, ist keiner der Tests optimal für den Antigennachweis, jedoch können Tests durch konventionelle Immunhistochemie (IHC) nach Einbettung in Paraffinblöcke und Schnitte durchgeführt werden. Bei dieser IHC-Methode werden Gewebe mit Anti-Tollwut-Antikörpern gefärbt, Abschnitte deparaffiniert, Antigene durch partielle Proteolyse oder andere Methoden entnommen und mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Antigene werden mit Meerrettichperoxidase / Aminoethylcarboxazol gefärbt und mit Hämatoxylin für die Visualisierung mit einem Lichtmikroskop gegengefärbt. Neben dem spezifischen Antigennachweis bietet die Formalinfixierung weitere Vorteile wie die Bestimmung histologischer Veränderungen, entspannte Bedingungen für die Lagerung und den Transport von Proben (unter Umgebungstemperaturen), die Möglichkeit, retrospektive Fälle zu testen und die biologische Sicherheit durch die Inaktivierung von Infektionserregern zu verbessern.

Abbildung 2 zeigt repräsentative IHC-Färbeergebnisse von Positiv- und Negativkontrollproben in verschiedenen getesteten Hirngeweben. Abbildung 2A,D,G stellen positive Proben mit 200x dar, während Abbildung 2B,E,H jeweils einer 400-fachen Vergrößerung entsprechen. Abbildung 2A-C entsprechen dem Hirnstamm; <strong class="x...

Hier stellen wir ein immunhistochemisches Testprotokoll zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigen als alternativen diagnostischen Test für formalinfixierte Gewebe vor.

Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Gewebe, die für die Immunhistochemie und für die diagnostische Histopathologie verwendet werden, werden routinemäßig in 10% Phosphatpufferformin fixiert. Der Nachweis von Tollwutvirus-Antigen im Gehirngewebe, das in Formalin fixiert wurde, stellt eine einzigartige Herausforderung dar, und der IHC-Test hat sich als empfindliche und spezifische Methode zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen erwiesen. Der Hauptvorteil der Biopsie oder anderer Nachweismethoden besteht darin, dass Antigene in Bezug auf Gewebe und Zellmorphologie nachgewiesen werden können.Mit IHC liefert die Lokalisation des Tollwutigens in Gehirn- und Nicht-Hirngeweben zusätzliche Informationen, die durch routinemäßige Hämatoxylin- und Eosin-Fleckenabschnitte nicht erhalten werden konnten. Tollwutdiagnostische Tests sind wichtig für die Einleitung der Postexpositionsprophylaxe bei Menschen, die dem Tollwutvirus ausgesetzt sind. IHC ist einer der am häufigsten durchgeführten Assays an formalinfixierten Geweben.Mit spezifischen Antikörpern kann es zum Nachweis entsprechender Krankheitserreger eingesetzt werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie drei bis fünf Millimeter Hirngewebe, die nach der Nekropsie gesammelt wurden, für 24 bis 72 Stunden in eine 10% ige gepufferte Formalinlösung. Notieren Sie das ungefähre Gewebegewicht, den Gewebetyp und das Volumen von Formalin.Legen Sie das Gewebe in 70% Ethanol für eine längere Gewebelagerung nach der Formalinfixierung und vor der Verarbeitung. Sezieren Sie nach der Probenfixierung das Gewebe, um die wichtigen Hirnareale wie Querschnitte des Hirnstamms, des Kleinhirns oder des Hippocampus einzubeziehen. Jeweils auf eine Dicke zwischen drei und fünf Millimetern zugeschnitten.Legen Sie das Gewebe in Verarbeitungskassetten. Verarbeiten Sie die Gewebekassetten für die Paraffinwachsinfiltration. Betten Sie sie in Paraffinblöcke ein und teilen Sie sie auf einem Mikrotom auf.Richten Sie zunächst die Färbeschale wie in Abbildung 1 des Textprotokolls beschrieben ein. Füllen Sie jedes Gericht mit 250 Millilitern der vorbereiteten Lösung. Um die AEC-Substrat-Stammlösung vorzubereiten, verwenden Sie eine Glaspipette, um eine 20-Milligramm-Tablette AEC in 5 Milliliter N, N-Dimethylformamid aufzulösen.Um die Protease-Stammlösung vorzubereiten, lösen Sie 7 Milligramm der Protease in 200 Milliliter PBS. Um den Spülpuffer vorzubereiten, fügen Sie 100 Milliliter Tween 80 bis 990 Milliliter PBS hinzu und mischen Sie gut, um eine homogene Lösung von PBT-T zu bilden. Machen Sie mit einem Mikrotom einen Paraffinschnitt von fünf Mikrometern.Laden Sie den Abschnitt bei 38 Grad Celsius auf ein Wasserbad und sammeln Sie ihn auf Glasobjektträgern. Beschriften Sie die Objektträger mit einem reagenzienfesten Stift. Die Dias auf ein Tablett legen und in einem Ofen bei 55 bis 60 Grad Celsius eine Stunde lang schmelzen.Dann entfernen Sie die Dias aus dem Ofen und entparaffinisieren Sie sie sofort mit 3 aufeinanderfolgenden Xylolspülungen von jeweils 5 Minuten. Danach rehydrieren Sie die Abschnitte auf dem Objektträger durch sequenzielles Eintauchen in abnehmende Verdünnungen von Ethanol zu entionisiertem Wasser, wie im Textprotokoll beschrieben. Behandeln Sie die Objektträger 30 Minuten lang mit der Protease für die proteolytische Antigenentnahme, spülen Sie die Objektträger dann 10 Minuten lang in PBS-T aus und behandeln Sie sie 10 Minuten lang mit 3% Wasserstoffperoxid.Danach waschen Sie die Dias erneut mit PBS-T für 10 Minuten. Entfernen Sie zunächst einen Schieber aus dem Puffer, stellen Sie sicher, dass Sie nur einen Objektträger gleichzeitig handhaben, während die anderen untergetaucht bleiben, und verwenden Sie ein Papiertuch, um überschüssigen Puffer aus dem Gewebeabschnitt abzutellen. Legen Sie die Dias in eine Feuchtigkeitskammer und inkubieren Sie sie mit normalem Ziegenserum bei Raumtemperatur für 15 Minuten.Als nächstes inkubieren Sie die Objektträger in der Feuchtigkeitskammer mit dem optimalen vorbestimmten primären Anti-Tollwut-Antikörper und negativen Kontrollantikörpern bei Raumtemperatur für 60 Minuten ohne Wäsche dazwischen. Danach die Objektträger 10 Minuten mit PBS-T waschen und 15 Minuten in einer Feuchtigkeitskammer mit dem biotinylierten Antikörper bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Dias erneut mit PBS-T für 10 Minuten.Inkubieren Sie die Dias und die Feuchtigkeitskammer mit Streifenteilung und HRB-Komplex bei Raumtemperatur für 15 Minuten und waschen Sie die PBS-T für 10 Minuten. Dann mit AEC in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren. Waschen Sie die Dias 10 Minuten lang in entionisiertem Wasser und halten Sie sie mit Gill's Hematoxilyn fest, das zwei Minuten lang ein bis zwei minuten lang mit entionisiertem Wasser verdünnt wird.Danach spülen Sie das überschüssige Hämatoxylin ab, indem Sie die Objektträger in entionisiertes Wasser tauchen. Spülen Sie die Rutschen 30 Sekunden lang in Scott's Tap Water ab und waschen Sie sie 10 Minuten lang in entionisiertem Wasser. Entfernen Sie die Dias nacheinander und montieren Sie sie mit wasserlöslichem Montagemedium.Verwenden Sie dann ein Lichtmikroskop, um die Dias zu lesen. In dieser Studie wird ein immunzytärer Chemietest zum Nachweis von Tollwutvirusantigen als alternativer diagnostischer Test für formalinfixierte Gewebe nachgewiesen. Ein repräsentatives immunzytäres chemisches Färbeergebnis von positiven und negativen Kontrollproben in verschiedenen Hirngeweben, einschließlich des Hirnstamms, der Kleinhirn- und Purkinje-Zellen sowie des Hippocampus, wird hier gezeigt.Die magentarote Färbung, die die Farbentwicklung durch Verwendung von AEC-Substrat vor dem blauen gegengefärbten Hintergrund anzeigt, ist auf die Reaktivität von Antikörpern gegen das Tollwutidemigen zurückzuführen. Ein positives Ergebnis in der Immunhistochemie entspricht der magentaroten Färbung in den Gewebeschnitten. Die Färbung von zytoplasmatischen Einschlüssen und körnigen Einschlüssen unterschiedlicher Größe weist auf Proben hin, die positiv auf RABV-Infektionen sind.Proben gelten als negativ, wenn keine spezifische rote Färbung oder nur der blaue Hintergrund aufgrund von Hämatoxylin beobachtet wurde. Zusätzlich zur positiven Färbung könnte die Verteilung der Einschlüsse eine indirekte Quantifizierung der Konzentrationen des Tollwutiquantigens in der Probe ermöglichen, die der Viruslast der Gewebeprobe entsprechen könnte. Unabhängig von den Verteilungsgraden wird jede spezifische Färbung die Probe als positiv für den RABV-Antigennachweis klassifizieren.Gewebe sollten ausreichend in Formalin fixiert werden und vermeiden, das Gewebe während dieses Prozesses einzufrieren. Tollwutantigen wird von IHC nachgewiesen, dann können molekulare Techniken an Paraffinabschnitten durchgeführt werden, um die Lyssavirus-Variante basierend auf RNA-Sequenzinformationen zu bestimmen. Reagenzien wie Xylol und Formalin sollten in Abzug behandelt werden.Beim Umgang mit AEC ist Vorsicht geboten, da es krebserregend ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine Technik, die Kombination von in situ-Tetramer-Färbung und in situ-Hybridisierung (ISTH) ermöglicht die Visualisierung, Kartierung und Analyse der räumlichen Nähe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen, um ihre Virus-infizierte Zielzellen, und die Bestimmung der quantitativen Beziehungen zwischen diesen Immunsystem Effektoren und Targets auf eine Infektion Ergebnisse.

Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ</em

Dieses Video zeigt die immunhistochemische Färbung für den Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen in infiziertem Hirngewebe von Mäusen. Der Prozess umfasst die Entparaffinisierung und Alkoholbehandlung, gefolgt von einer proteolytischen Behandlung, um die Antigenzugänglichkeit zu verbessern. Die immunhistochemische Färbung zeigt rote Ausfällungen, die das Vorhandensein von Tollwutantigenen im Gewebeschnitt bestätigen.

Eine immunhistochemische Färbung zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen

Wir präsentieren hier ein optimiertes, detailliertes Protokoll für die Doppelimmunfärbung in Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten des Zentralnervensystems (ZNS) und des peripheren Lymphknotens (LN) von Ratten.

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Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

Dieses Protokoll führt ein Standard-Labor-Betriebsverfahren für diagnostische Tests von Lyssavirus-Antigenen bei Fledermäusen in Taiwan.

Standard-Betriebsverfahren für Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan

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Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographischer Diagnostischer Test für ressourcenbegrenzte Einstellungen mit weiteren molekularen Anwendungen

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Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Dieses Protokoll demonstriert den Echtzeit-Assay für die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) des Pan-Lyssavirus LN34 von der Gewebeentnahme bis zur Ergebnisinterpretation, einschließlich Aktualisierungen von Primersequenzen und Formulierungen zur Verbesserung der Assay-Leistung für einige Nicht-Tollwut-Lyssaviren und Hasentiere. Wir demonstrieren auch den Assay-Aufbau für ein Single-Well-LN34-Multiplexformat (LN34M).

Postmortale Diagnose von Tollwut bei Tieren mit dem aktualisierten, multiplexierten LN34 Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsassay

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MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

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