Name: Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Lernen Sie die hocheffiziente mRNA-Transfektion primärer Makrophagen ohne Zytotoxizität oder Immunogenität. Diese Methode ermöglicht die Expression mutierter oder markierter Proteine für funktionelle Studien.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 670) unterstützt.

<ol><li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li>
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<li>Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li>
<li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li>
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<li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).</li>
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<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li>
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<li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEMO%2FIKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li>
<li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+Assembly%2C+Production%2C+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier stellen wir ein Protokoll zur hocheffizienten Transfektion von meist schwer transfekten primären Makrophagen mit in vitro transkribierter mRNA vor. Wichtig ist, dass die Transfektion der Makrophagen mit diesem Protokoll weder den Zelltod induziert noch die proinflammatorische Signalisierung aktiviert, was darauf hinweist, dass weder das Transfektionsreagenz noch die transfizierte mRNA als nicht-selbst erkannt werden.
Die Qualität der mRNA ist von zentraler Bedeutung für die erfolgreiche T...

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die sich auf die Erkennung, Einnahme und Erniedrigung von Mikroben, apoptotischen Zellen und zellulären Ablagerungen spezialisieren. Darüber hinaus helfen sie, Immunantworten zu orchestrieren, indem sie Zytokine und Chemokine sezernieren und Antigene t-Zellen und B-Zellen präsentieren. Makrophagen spielen auch eine wichtige Rolle in zahlreichen anderen Prozessen, wie Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorgenese und Adipositas.
Um Nicht-Selbstmoleküle wie pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) und außerorts entfernte Moleküle wie schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) nachweisen zu können, sind Makrophagen mit einer Vielzahl von Mustererkennungsrezeptoren (PRR)ausgestattet 1. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig,um 2 zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz3 und die transfizierten Nukleinsäuren4,5,6,7 oft von den PRRs als nicht selbst erkannt werden. Aus diesem Grund führt die Transfektion von Makrophagen mit chemischen oder physikalischen Methoden8 in der Regel zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Makrophagenselbstmord mittels Pyroptose, einer Form des programmierten lytischen Zelltodes, der nach Erkennung von zytosolischen PAMPs/DAMPs wie DNA oder Fremd-RNA9ausgelöst wird. Biologische Transfektion von Makrophagen mit Viren wie Adenoviren oder Lentiviren als Vektoren ist oft effizienter, aber die Konstruktion solcher viralen Vektoren ist zeitaufwändig und erfordert Biosicherheitsausrüstung der Stufe 210,11.
Obwohl Makrophagen intensiv erforscht werden, wird die Analyse ihrer Funktionen auf molekularer Ebene dadurch erschwert, dass eines der wichtigsten Instrumente der Molekularbiologie, die Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten zur exogenen Expression von Proteine, ist kaum anwendbar. Dies zwingt Forscher oft dazu, makrophagenähnliche Zelllinien anstelle von bona fide Makrophagen zu verwenden. Anwendungen für Nukleinsäurekonstrukttransfektion enzinieren die Expression mutierter oder getaggter Proteinversionen, die Überexpression eines bestimmten Proteins, die Proteinreexpression in einem entsprechenden Knockout-Hintergrund und die Expression von Proteinen anderer Arten (z. B. , Cre Recombinase oder Guide RNA und Cas9 für gezielte Gen Knockout).
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das hocheffiziente Transfektion von (in der Regel schwer zu transfekten) primären Makrophagen ermöglicht, d. h. murinen peritonealen Makrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden. Wichtig ist, dass die mit diesem Protokoll erzeugte in vitro transkribierte mRNA die natürlich vorkommenden modifizierten Nukleoside nukleoside nucleosides 5-methyl-CTP und Pseudo-UTP enthält, die die Immunogenität reduzieren und dieStabilität4,6,7,12,13. Darüber hinaus werden die 5'-Enden der in vitro transkribierten mRNA durch antarktische Phosphatase dephosphoryliert, um die Erkennung durch den RIG-I-Komplex14,15zu verhindern. Dies minimiert die angeborene Immunerkennung der in vitro transkribierten mRNA. Mit unserem einfach durchzuführenden Protokoll werden Transfektionsraten zwischen 50-65% (Peritonealmakropages (PM)) und 85% (BMDM) erreicht, während, was wichtig ist, keine Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet wird. Wir beschreiben detailliert (i) wie die immunologisch stumme mRNA zur Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und (ii) dem Transfektionsverfahren selbst erzeugt werden kann.

<table><tbody><tr><td>5-Methyl-CTP (100 mM)</td><td>Jena Biosience</td><td>NU-1138S</td><td>gelagert bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>Antarktische Phosphatase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0289</td><td>gelagert bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>Antarktischer Phosphatase-Reaktionspuffer (10x)</td><td>New England BioLabs</td><td>B0289</td><td>gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Anti-NEMO/IKK&gamma; Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-41046</td><td>gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-Aktin-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Petrischalen 92,16 mm mit Nocken</td><td>Sarstedt</td><td>821,473</td><td>gelagert bei RT</td></tr><tr><td>CD11b Mikrokügelchen Maus und Mensch</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-601</td><td>gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Cre Rekombinase + T7-Promotor Forward</td><td>Primer Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&acute;, gelagert bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>Cre Rekombinase + T7-Promotor Reverse Primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&prime;, gelagert bei -20 &de; </td></tr><tr><td>C-DNA-Aufreinigungskit: QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>gelagert bei RT</td></tr><tr><td>eGFP + T7-Promotor Forward Primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&acute;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&acute;, gelagert bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>eGFP + T7-Promotor Reverse Primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&acute;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&acute;, gelagert bei -20&de; C</td></tr><tr><td>Fast Digest Puffer (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B64</td><td>gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td>gelagert bei -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>High-Fidelity-Polymerase mit Korrekturlesen: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0491S</td><td>gelagert bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>IKK&beta; + T7-Promotor Forward Primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&prime;, gelagert bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>IKK&beta; + T7-Promotor Reverse Primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&prime;, gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>In vitro mRNA-Transkriptionskit: HiScribe T7 ARCA mRNA-Kit (mit polyA-Tailing)</td><td>New England BioLabs</td><td>E2060</td><td>gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>gelagert bei RT</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>gelagert bei RT</td></tr><tr><td>mRNA-Transfektionspuffer und Reagenz: jetMESSENGER</td><td>Polyplus Transfektion</td><td>409-0001DE</td><td>gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Mutant IKK&beta; IKK-2S177/181E Plasmid</td><td>Addgen</td><td>11105</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Mutante NEMOC54/347A Plasmid</td><td>Addgen</td><td>27268</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>pEGFP-N3-Plasmid</td><td>Addgen</td><td>62043</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>poly(I:C)</td><td>Calbiochem</td><td>528906</td><td>bei -20 &° gelagert; C</td></tr><tr><td>pPGK-Cre-Plasmid</td><td></td><td></td><td>F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Neue Varianten der induzierbaren Cre-Rekombinase: Eine neuartige Mutante des Cre-PR-Fusionsproteins weist eine erhöhte Sensitivität und einen erweiterten Bereich der Induzierbarkeit auf. Nukleinsäuren Res. 29, 47e (2001). gelagert bei -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>pseudo-UTP (100 mM)</td><td>Jena Biosience</td><td>NU-1139S</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>gelagert bei RT</td></tr><tr><td>Ratten-Anti-Maus CD11b Antikörper, APC-konjugierter</td><td>BioLegend</td><td>101212</td><td>gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Ratten-Anti-Maus F4/80 Antikörper, PE-konjugiert</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td>, <td>gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Rekombinant M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td>gelagert bei -20 &°; </td></tr><tr><td>C-RNA-Aufreinigungskit: MEGAclear Transkriptions-Aufreinigungskit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td>gelagert bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>RNAse-abbauendes Tensid: RnaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020</td><td>gelagert bei RT</td></tr><tr><td>Ultrapure LPS aus E.coli O111:B4</td><td>Invivogen</td><td></td><td>gelagert bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>Wildtyp IKK&beta; Plasmid</td><td>Addgen</td><td>11103</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Wildtyp-NEMO-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>27268</td><td>gelagert bei -20 μg; C</td></tr></tbody></table>

hocheffiziente transfektion von primärer makrophagen mit in vitro transscribed mrna

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisiert sind. Zu diesem Zweck sind sie mit einer großen Auswahl an Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) ausgestattet. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz und die transfizierten Nukleinsäuren von den PRRs oft als nicht-selbst erkannt werden. Daher führt die Transfektion oft zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Selbstmord der Makrophagen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von murinen primären Makrophagen wie Peritonealmakrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA in vitro aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden transkribiert ermöglicht. Mit diesem einfachen Protokoll werden Transfektionsraten von etwa 50-65% für PM und etwa 85% für BMDM erreicht, ohne dass Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet werden. Wir beschreiben detailliert die Generierung von mRNA für die Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und dem Transfektionsverfahren.

Wir haben dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um mRNA-Codierung für FLAG-markierte NEMO- und IKK-Varianten für die Transfektion von primären Makrophagen16zu generieren. Die Plasmide, die für FLAG-markierte Wildtyp (NEMOWT) und C54/347A mutierte NEMO (NEMOC54/374A) (siehe Materialtabelle) kodieren, enthalten bereits einen T7-Promotor in der richtigen Ausrichtung (Abbildung 1A)....

Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Da Makrophagen auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisiert sind, sind sie besonders schwer zu transfetieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden. Der Hauptvorteil unserer Methode besteht darin, dass hohe Transfektionsraten ohne nachweisbare Zytotoxizität oder Immunogenität erreicht werden.Demonstrieren sie das Verfahren wird Marc Herb ein Postdoc aus meinem Labor sein. Beginnen Sie mit dem Auftauen aller Komponenten des RNA-Transkriptionskits. Wirbeln Sie die Reagenzien für fünf Sekunden und drehen Sie sie für zwei Sekunden bei 2.000 mal g, dann halten Sie sie auf Eis, bis zum Gebrauch.Bereiten Sie die In-vitro-RNA-Transkriptionsreaktion in einem 0,5-Mikroliter-Mikrozentrifugenrohr entsprechend den Manuskriptanweisungen vor. Wirbeln Sie die Röhre und drehen Sie sie nach unten. Dann inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, während bei 400 Rpm auf einem thermischen Mischpult mischen.Nach der Inkubation zwei Mikroliter DNase I direkt in den Reaktionsmix geben. Wirbel und drehen Sie die Röhre nach unten, und inkubieren Sie es in den thermischen Mischer für weitere 15 Minuten. Reservieren Sie ein Zwei-Mikroliter-Aliquot des mit Dnase behandelten Produkts für das Kontrollgel und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.Für PolyA-Tailing fünf Mikroliter 10X PolyA-Polymerase-Reaktionspuffer und fünf Mikroliter PolyA-Polymerase zur Dnase-behandelten Reaktion hinzufügen. Wirbel und drehen Sie die Mischung. Dann inkubieren Sie es in den thermischen Mischer für 30 Minuten.Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, nehmen Sie ein Zwei-Mikroliter-Aliquot für das Kontrollgel und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Fügen Sie 5-Prime-Dephosphorylierungsreagenzien direkt in das PolyA-Tailed-Produkt gemäß den Manuskriptanweisungen. Wirbel und drehen Sie das Rohr, und inkubieren Sie es in den thermischen Mischer für weitere 30 Minuten.Folgen Sie der Dephosphorylierungsreaktion mit einer zweiminütigen Inkubation bei 80 Grad Celsius, um die antarktische Phosphatase zu erhitzen. Reinigen Sie dann die in vitro transkribierte mRNA mit einem speziellen RNA-Reinigungskit. Messen Sie die Konzentration und Reinheit der eluierten mRNA mit einem Mikrovolumenspektrophotometer.Führen Sie ein denaturierendes Agarose-Gel mit den zuvor gesammelten Aliquots aus, um das Vorhandensein eines einzelnen Produkts, die korrekte Transkriptlänge und die PolyA-Abschweifung zu überprüfen. Bereiten Sie sich auf die Transfektion vor, indem Sie das vorberechnete Volumen des mRNA-Transfektionspuffers abzüglich der Volumina von mRNA-Transfektionsreagenz und der mRNA zu einem Reaktionsröhrchen hinzufügen. Den mRNA-Bestand auftauen und sanft mischen, indem Sie das Rohr umdrehen.Fügen Sie dann das vorberechnete Volumen von mRNA in das Reaktionsröhrchen. Wirbel und Spin-down der Reaktionsmischung und der mRNA-Transfektionsreagenz, dann fügen Sie das entsprechende Volumen des mRNA-Transfektionsreagenzins in das Reaktionsmixröhrchen. Wirbeln Sie die Röhre und drehen Sie sie nach unten.Dann inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 15 Minuten. In der Zwischenzeit ersetzen Sie das Kulturmedium der Makrophagen durch frische swarme Kulturmedium. Sobald die Inkubation der Transfektionsmischung abgeschlossen ist, fügen Sie die Mischung in die Plattenbrunnen, die die Makrophagen tropfenweise und in einem Kreis von außen bis zur Mitte des Brunnens enthalten.Um eine gleichmäßige Verteilung der Transfektion zu gewährleisten, schaukeln Sie die Platte sanft in vertikaler und horizontaler Richtung. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für mindestens sechs Stunden. Analysieren Sie nach der Inkubation die Transfektionseffizienz mit Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie oder Immunoblot.Der wichtigste Teil dieses Verfahrens ist die Gewährleistung einer gleichmäßigen Verteilung des Transfektionsmixes, so dass alle Makrophagen mit der gleichen Menge an mRNA in Kontakt kommen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um mRNA-Codierung FLAG-markierte NEMO- und IKK-Beta-Varianten für die Transfektion von primären Makrophagen zu generieren. Die korrekte Größe und PolyA-Abschwänze der mRNA wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese nachgewiesen.Die Transfektionseffizienz wurde durch die Generierung von mRNA-Codierung GFP und die Durchführung von Durchflusszytometrie-Analysen bestätigt. Die Transfektionsrate erhöhte sich zusammen mit der Menge an transfizierter mRNA und erreichte 50 bis 65 % für PM und 80 bis 85 % für BMDM. Sowohl bei PM als auch bei BMDM erhöhte sich der Expressionsgrad von EGFP in transfizierten Zellen in zeitlicher und dosisabhängiger Weise.Wichtig ist, dass die Analyse von Propidiumiodid-positivem oder Annexin-V-positiver Makrophagen bestätigte, dass das Transfektionsverfahren keinen lytischen oder apoptotischen Zelltod induzierte. Die Transfektionseffizienz von mRNAs, die mit FLAG-markierten Nemo- oder IKK-Beta-Varianten kodieren, wurde mit Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Raten lagen bei Nemo mRNAs bei etwa 60% und bei IKK-beta mRNAs bei 55%.Dieses Protokoll wurde auch verwendet, um mRNA-Codierung Cre Recombinase zu generieren. Die Transfektion von 400.000 BMDM mit 400 Nanogramm Cre-Rekombimeiß mRNA führte nach 48 Stunden zu einer nahezu vollständigen Erschöpfung des Nemo-Proteins, was auf eine hocheffiziente Transfektion hindeutet. Das Fehlen nachweisbarer Mengen an Interleukin 1 beta, Interleukin-6 und Tumornekrosefaktor deuten darauf hin, dass das Transfektionsverfahren keine pro-inflammatorische Signalisierung aktiviert.Unsere relativ einfache Methode ermöglicht es schließlich, mutierte oder markierte Proteine in primären Makrophagen effizient auszudrücken. Dies würde die Analyse von Makrophagenfunktionen auf molekularer Ebene wesentlich voranbringen.

highly-efficient-transfection-primary-macrophages-with-vitro

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir präsentieren unsere optimierten High-Throughput-Nukleofektion Protokoll als eine effiziente Art der Transfektion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen entweder mit Plasmid-DNA oder siRNA, ohne dass Zellreifung. Wir fördern den Nachweis für die erfolgreiche siRNA-Silencing von gezielten Gen RIG-I sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dieses Video zeigt den Prozess der Transfektion von primären Makrophagen mit modifizierter mRNA, die für grün fluoreszierendes Protein kodiert. Diese modifizierten mRNAs, die die Immunogenität verringern und ihre Stabilität verbessern sollen, gewährleisten die erfolgreiche Transfektion und anschließende Expression von grün fluoreszierenden Proteinen, was durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt wird.

Transfizierung von primären Makrophagen mit modifizierter mRNA

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur effizienten Transfektion von murinen Makrophagen-Zelllinien mit siRNAs unter Verwendung des Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systems, zur Stimulation der Makrophagen mit Lipopolysaccharid und zur Überwachung der Auswirkungen auf die Produktion von entzündlichen Zytokinen.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Dieses Protokoll stellt ein effizientes und zuverlässiges Verfahren zum humanen THP-1 Makrophagen mit siRNA oder Plasmid-DNA durch Elektroporation mit hohen Transfektionseffizienz transfizieren während eine hohe Vitalität der Zellen und Makrophagen volle Kapazität für die Differenzierung und Polarisation.

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Die Transfektion in die Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 ist aufgrund der natürlichen Reaktion der Zelle auf Fremdmaterialien schwierig. Wir haben hier ein schonendes und dennoch robustes Verfahren zur Transfektion von Luciferase-Reportergenen in RAW264.7-Zellen beschrieben.

Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

In diesem Artikel liefern wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark dendritische Zellen und Makrophagen abgeleitet. Die Methode basiert auf der Transduktion des Knochenmarks Stammväter mit retroviralen Konstrukten gefolgt von Differenzierung in Makrophagen und dendritischen Zellen in Vitro.

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Wir demonstrieren ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Untersuchung der Genfunktion in peritonealen Gewebe-residenten Makrophagen in vivo unter Verwendung lentiviraler Vektoren.

Lentivirale Vektorpräparation für die effiziente Gen- und microRNA-Modulation von geweberesidenten Makrophagen in der Bauchhöhle in vivo bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Genom-Editierung in aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Makrophagen unter Verwendung von Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteinkomplexen, die in vitro zusammengesetzt und durch Elektroporation verabreicht werden.

Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe

Lernen Sie die hocheffiziente mRNA-Transfektion primärer Makrophagen ohne Zytotoxizität oder Immunogenität. Diese Methode ermöglicht die Expression mutierter oder markierter Proteine für funktionelle Studien.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

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