Name: Generierung eines Rattenmodells für akutes Leberversagen durch Kombination von 70% partieller Hepatektomie und Acetaminophen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Erfahren Sie, wie ein reproduzierbares Rattenmodell für akutes Leberversagen durch 70% partielle Hepatektomie und Acetaminophen entwickelt wird. Diese Methode ermöglicht die Evaluation neuer Therapieansätze.

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Diese Arbeit wurde durch den Kernzuschuss des Department of Biotechnology, Government of India an das National Institute of Immunology, Neu-Delhi, unterstützt.

Das unten beschriebene Verfahren wurde von der Institutional Animal Ethics Committee of National Institute of Immunology, Neu-Delhi, genehmigt. Die Seriennummer der Zulassung lautet IAEC-355/14.
1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie sich auf den chirurgischen Eingriff vor, wie zuvor von Das B et al.26beschrieben.</li>
	<li>Verwenden Sie 6–8 Wochen alte inzuchtige Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 200–250 g.</li>
	<li>Die Tiere unter normalen Tierpflegebedingungen unterbringen und vor und nach dem Eingriff mit Ratten-Chow und Libitum füttern.</li>
	<li>Verwenden Sie bei der Ausführung von 70 % PHx eine Standard-Cocktailmischung aus Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht), der intraperitoneal injiziert wird. HINWEIS: Die Art des verwendeten Anästhetikums kann postoperative Auswirkungen auf die Sterblichkeit und Morbidität haben.</li>
	<li>Verwenden Sie während der Zelltransplantation die anhalante Anästhesie Isoflurane (2-Chlor-2-(Difluormethoxy)-1,1,1-Trifluor-Ethan), um die Zeit der Genesung des Tieres nach der Transplantationsoperation zu verkürzen.</li>
	<li>Induzieren und pflegen Sie die inhalative Anästhesie mit einem maßgeschneiderten Anästhesiesystem. Halten Sie den Sauerstoffstrom bei 4 L/min. Zur Induktion sofluranbei bei 4% und zur Wartung 2–3% während des chirurgischen Eingriffs.</li>
</ol>2. Präoperative Verfahren
<ol><li>Anästhetisieren Sie die Ratte, indem Sie die in Schritt 3.1 beschriebene Ketamin-Xylazin-Mischung intraperitoneal injizieren. Bestätigen Sie die vollständige Anästhesisierung, indem Sie die Zehen des Tieres kneifen. Weitere Eingriffe werden nur durchgeführt, wenn kein Pedalreflex vorhanden ist.</li>
	<li>Um die Austrocknung der Hornhaut zu verhindern, wenden Sie einen carboxy Methyl-Zellulose-basierten Augentropfen auf beide Augen an.</li>
	<li>Halten Sie das anästhesierte Tier mit weißem Klebeband auf ein operationsgestütztes Brett zurück. Platzieren Sie das Tier mit der Bauchseite nach oben, um sicherzustellen, dass sich der Mund auf der distalen Seite der Person befindet, die die Operation durchführt.</li>
	<li>Entfernen Sie Das Haar aus dem rechten Rechten Bauchchirurgiebereich mit einem elektrischen Clipper.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle durch drei abwechselnde Peelings von Povidon-Jod und 70% Ethanol mit sterilisierten Wattepads in kreisförmiger Bewegung.</li>
</ol>3. Partielle Hepatektomie (PHx), um 70% der Lebermasse zu entfernen
HINWEIS: Führen Sie den gesamten chirurgischen Eingriff unter einer sterilen Umgebung in einer laminaren Durchflusshaube durch. Verwenden Sie nur sterile chirurgische Instrumente, um das Infektionsrisiko postchirurgisch zu minimieren. Die Entfernung von 70% der Lebermasse, genannt 70% partielle Hepatektomie (70% PHx), wurde durchgeführt, wie von C. Mitchell und H. Willenbring beschrieben, 200827.
<ol><li>Bestätigen Sie vor Beginn der Operation die vollständige Anästhesisierung des Tieres, indem Sie den Zehen kneifen. Weitere Eingriffe werden nur durchgeführt, wenn kein Pedalreflex vorhanden ist.</li>
	<li>Markieren Sie die Haut, die direkt unter dem Brustbein geschnitten werden soll, senkrecht zum Xiphoid und parallel zum Brustkorb.</li>
	<li>Legen Sie ein steriles Drapat mit einer Öffnung von ca. 3 cm x 1 cm über die markierte Haut.</li>
	<li>Führen Sie einen Querschnitt von etwa 2–3 cm entlang der markierten Linie mit einem Skalpell durch. Verwenden Sie die chirurgische Klinge Nr. 22. Entfernen Sie vorsichtig die Befestigung der Haut an der darunter liegenden Muskelschicht in der Nähe des eingeschnittenen Bereichs mit sterilen befeuchteten Baumwollspitzen.</li>
	<li>Als nächstes machen Sie einen Querschnitt durch die Peritonealschicht direkt unter dem xiphoiden Prozess.</li>
	<li>Mit Hilfe von zwei kochigen befeuchteten Baumwollspitzen, entlarven Sie den linken Leberlappen, indem Sie sanften Druck auf den Thorax ausüben. Legen Sie eine Baumwollspitze auf den Zwerchfellbereich des eingeschnittenen Teils und die andere Baumwollspitze unterhalb des eingeschnittenen Bereichs, um den Leberlappen nach oben zu heben.</li>
	<li>Schieben Sie eine 8–10 cm lange sterile Nylonfadenschlaufe (Größe 4–0, 0,15 mm Durchmesser) um den exponierten Leberlappen. Nehmen Sie die Schleife an die Basis des Lappens in der Nähe des Hilums mit Hilfe von mikrosezierenden Zangen oder befeuchteten Baumwollknospen.</li>
	<li>Mit Hilfe des Mikrochirurgie-Nadelhalters und der Mikrozange binden Sie die beiden Enden der Schleife, indem Sie den Knoten so nah wie möglich an die Basis des Lappens legen, um das Blutgefäß zu verengen und Blutungen zu reduzieren, nachdem der Leberlappen entfernt wurde. Binden Sie zwei zusätzliche Knoten auf der anderen Seite.</li>
	<li>Seien Sie vorsorglich, um den Knoten nicht zu nah an die nahe gelegenen Blutgefäße zu binden, was sonst zu venösen Obstruktionen (Stenose) führen kann.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mikrochirurgie-Schere, um den gebundenen Lappen knapp über dem Knoten zu schneiden, der eine verfärbte Gewebemasse hinterlässt, die als ischämischer Stumpf anstelle des Lappens bezeichnet wird. HINWEIS: Die Rattenleber ist, wie die von Mäusen, in vier verschiedene Lappen unterteilt: den Medianlappen, den rechten Seitenlappen, den linken Seitenlappen und den Caudatelappen, die etwa 40 %, 20 %, 30 % bzw. 7 % der gesamten Lebermasse ausmachen. Jede Kombination dieser Lappen kann entfernt werden, um 70% Lebermasse verbrauchen. In der aktuellen Studie wurden der Medianlappen und die linken Seitenlappen entfernt.</li>
	<li>Lokalisieren Sie den Mittleren Lappen vorsichtig, ohne den verbleibenden Stumpf des linken Seitenlappens zu beschädigen. Ziehen Sie es vorsichtig aus der Bauchhöhle, und an der Basis des Lappens binden Sie einen 8–10 cm langen Nylonfaden (Größe 4–0) Knoten, wie bereits erwähnt. Binden Sie zwei zusätzliche Knoten auf der anderen Seite. Unter Allen genannten Vorsichtsmaßnahmen müssen Sie vorsichtig verbrauchen und den gebundenen Mittellappen entfernen.</li>
	<li>Nach dem Entfernen der Lappen, Nähen Sie das Peritoneum mit einer resorbierbaren chromischen 4:0-Nähte mit kontinuierlichen Stichen, gefolgt von Haut nähen mit einer unterbrochenen Naht.</li>
	<li>Tragen Sie Povidon-Jod auf die Haut rund um die Nähte auf, um eine Infektion zu verhindern.</li>
	<li>Entfernen Sie das Drapat und entfernen Sie das Tier vom Operationsbrett.</li>
</ol>4. Postoperative Pflege bei Tieren
<ol><li>Intraperitoneal injizieren Sie das Tier mit einer Dosis von 12 mg Cefotaxam-Antibiotikum in 1 ml 5% Glukoselösung mit einer 1 ml Spritze, um es vor dem Risiko einer postoperativen Infektion zu schützen.</li>
	<li>Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von schmerzstillendem Meloxicam (1 mg/kg Körpergewicht) zur Schmerzlinderung nach der Operation und folgen Sie ihr durch zwei weitere Dosen, wobei das Regime als eine Dosis pro Tag erhalten bleibt.</li>
	<li>Die betriebenen Tiere unter Standardbedingungen von 12 h Licht/Dunkel-Zyklus unterbringen und in regelmäßigen Abständen überwachen.</li>
</ol>5. Injektion von Medikamenten bei teilweise hepatectomisierten Tieren, um Leberversagen zu induzieren
<ol><li>Nach 24 h Postchirurgie, wenn die Tiere erfolgreich von 70% PHx erholt haben, messen Sie das Körpergewicht des Tieres gefolgt von den Injektionen.</li>
	<li>Injizieren Sie 750 mg/kg Körpergewicht von APAP intraperitoneal bei teilweise hepatectomisierten Tieren 24 h nach dem 70% PHx nach erfolgreicher Genesung der Tiere vom chirurgischen Eingriff. Wiederholen Sie die Dosis nach 24 h erneut. HINWEIS: Zwei Dosen APAP werden dem Tier intraperitoneal verabreicht (d. h. 24 h bzw. 48 h nach dem 70% PHx-Verfahren).</li>
	<li>Messen Sie zu jedem Zeitpunkt nach der Injektion von APAP das Körpergewicht des genesenden Tieres. HINWEIS: APAP (Biocetamol) wird bei Tieren als 150 mg/ml-Lösung in 2% Benzylalkohol injiziert.</li>
</ol>6. Transplantation gesunder Hepatozyten in ALF-Tiermodellen
HINWEIS: Um die Reversibilität von ALF bei Ratten zu untersuchen, transplantieren Sie gesunde syngene Rattenhepatozyten intrasplenisch bei den ALF-induzierten Tieren zusammen mit der1. Dosis von APAP. In der aktuellen Studie, um genügend Zeit für die transplantierten Zellen für Homing und Engraftment zu bieten, wurde die Transplantation kurz nach der1. Dosis von APAP durchgeführt. Rattenhepatozyten werden durch ein Protokoll isoliert, das zuerst von Berry and Friends et al.28 veröffentlicht und später in verschiedenen anderen Studien29,30,31 mit einigen Modifikationen angepasst wurde. Für intrasplenische Transplantation von Zellen im ALF-Tiermodell, folgen Sie den unten genannten Schritten.
<ol><li>Die Ratte zur Induktion der Anästhesie mit 4% Isofluran und 4 L/min Sauerstoffdurchfluss für eine Ratte von 250–350 g Körpergewicht in eine Poly-Methacrylat-Kammer geben. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Mangel an Pedalreflexen beim Kneifen der Zehen des Tieres.</li>
	<li>Legen Sie die anästhesierte Ratte so auf das Operationsbrett, dass ihr linker seitenteil nach oben gerichtet ist. Halten Sie die Anästhesie bei 2–3% Isofluran-Inhalation durch ein geeignetes Mundstück aufrecht.</li>
	<li>Rasieren Sie die Haut auf der linken Seitenregion und sterilisieren Sie sie mit Povidon Jodlösung.</li>
	<li>Machen Sie einen Querschnitt auf den rasierten Bereich der Haut.</li>
	<li>Machen Sie einen 1-2 cm großen Schnitt in der Peritonealschicht, um die Milz freizulegen.</li>
	<li>Nehmen Sie vorsichtig die Milz der Peritonealhöhle heraus und heben Sie sie mit Hilfe von zwei befeuchteten Baumwollspitzen an.</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen (in der Regel 107 pro Tier) auf, die in 50 L IMDM-Medien in einer 1 ml Insulinspritze mit einer 29 G-Nadel transplantiert werden.</li>
	<li>Pierce die Nadel vorsichtig in den Milzkortex und lassen Sie die Zellsuspension innerhalb von 2-3 min in die Milz.</li>
	<li>Nach Abschluss der Zelltransplantation nehmen Sie vorsichtig die Nadel heraus und tupferen Sie den Bereich der Nadelpunktion mit einer befeuchteten Baumwollspitze, um ein Auslaufen der Zellsuspension von der Stelle zu vermeiden.</li>
	<li>Schließen Sie das Peritoneum und die Haut durch eine 4:0-absorbierbare Naht mit kontinuierlicher bzw. diskontinuierlicher Naht.</li>
	<li>Tragen Sie Povidon Jodlösung auf die Haut an der Stelle der Nähte, um eine Infektion auf der operierten Stelle zu verhindern.</li>
	<li>Intraperitoneal injizieren 1 ml Volumen von 12 mg/ml Antibiotikum (z. B. Cefotaxim) Lösung und subkutan injiziert analgetisch (z. B. Meloxicam) 1 mg/kg Körpergewicht in das Tier als Teil der postoperativen Pflege. Bewegen Sie das Tier in einen warmen, sich erholenden Käfig.</li>
	<li>Halten Sie das operierte Tier unter normalen Bedingungen von 12 h Hell/Dunkel-Zyklus isoliert, bis die chirurgischen Wunden vollständig geheilt sind. Dies kann 3 bis 4 Tage dauern.</li>
</ol>7. Charakterisierung der ALF-Entwicklung
<ol><li>Euthanisieren Sie die Tiere durch Überdosierung der Ketamin-Xylazin-Lösung 2 h nach der2. Dosis der APAP-Behandlung und sammeln Sie Blut- und Gewebeproben.</li>
	<li>Serum aus Blut für biochemische Studien sammeln32.</li>
	<li>Verarbeiten Lebergewebeproben für histologische und Genexpressionsstudien33,34,35.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Entwicklung eines geeigneten Tiermodells für ALF ist für ein besseres Verständnis der Pathogenese und des Fortschreitens von ALF von größter Bedeutung. Ein gut charakterisiertes ALF-Tiermodell bietet auch die Möglichkeit, neue therapeutische Ansätze gegen ALF zu entwickeln und zu erproben. Es wurden viele Versuche unternommen, ein klinisch relevantes Modell von ALF6,12,21,23,<sup...

Akutes Leberversagen (ALF) wird von der American Association for the Study of Liver Diseases als schnelle Entwicklung akuter Leberschäden ohne vorherige Anzeichen von Schäden definiert und ist durch eine schwere Beeinträchtigung der synthetischen, metabolischen und entgiftenden Funktionen der Leber gekennzeichnet1. ALF unterscheidet sich von chronischem Leberversagen, bei dem das Versagen als Folge von Leberschäden über einen langen Zeitraum verursacht und von akutem chronischem Leberversagen (ACLF), wo abrupte Leberschäden als Folge von chronischen Lebererkrankungen2,3,4. Die einzige verfügbare Heilung für ALF ist orthotopische Lebertransplantation (OLT), oder der Tod kann auftreten. Aufgrund des Mangels an Leberspendern ist die Sterblichkeitsrate bei Patienten mit ALF sehr hoch.
Um das Potenzial alternativer therapietherapeutischer Ansätze zu untersuchen und die Pathophysiologie von ALF besser zu verstehen, sind Tiermodelle erforderlich, die die ALF beim Menschen widerspiegeln können. Viele der bereits verfügbaren ALF-Tiermodelle weisen einige Mängel auf. Acetaminophen (APAP) Effekte sind schwer zu reproduzieren, haben aber die engsten Ähnlichkeiten in Bezug auf zeitliche, klinische, biochemische und pathologische Parameter. APAP-induzierte Tiermodelle stoßen häufig auf Probleme aufgrund des Vorhandenseins von Methemoglobinämie, die durch die Oxidation von Hämoglobin durch APAP und seine Zwischenprodukte5,6,7verursacht wird. Ein weiteres Problem ist die mangelnde Reproduzierbarkeit, die sich in unvorhersehbaren Dosisreaktionen und dem Zeitpunkt des Todes widerspiegelt. Die ALF-Tiermodelle, die mit Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) hergestellt wurden, haben eine schlechte Reproduzierbarkeit8,9,10,11. Concavalin A (Con A) und Lipoplysaccharid (LPS)-induzierte ALF-Tiermodelle spiegeln nicht das klinische Muster der menschlichen Krankheit wider, obwohl sie Vorteile in der Untersuchung von zellulären Mechanismen haben, die an Autoimmunlebererkrankungen beteiligt sind, und in der Studie von Sepsis bzw.12,13,14,15. In ähnlicher Weise erfordert Thioacetamid (TAA) auch eine Biotransformation zu einem aktiven Metaboliten Thioacetamidsulfoxid und zeigt Artenvariation16,17,18,19. D-Galactosamin (D-Gal) produziert einige biochemische, metabolische und physiologische Veränderungen ähnlich ALF, ist aber nicht in der Lage, den gesamten alf pathologischen Zustand20,21,22,23widerzuspiegeln. Es gab nur sehr wenige Versuche, zwei oder mehr dieser Methoden zu kombinieren, um ein ALF-Modell zu entwickeln, das in der Lage ist, das ALF-Syndrom besser widerzuspiegeln13. Daher sind weitere Studien erforderlich, um ein Modell zu entwickeln, das die Krankheitsparameter widerspiegeln kann, eine bessere Reproduzierbarkeit hat und genügend Zeit bietet, um die Auswirkungen einer therapeutischen Intervention zu untersuchen.
In der aktuellen Studie wurde ein alternatives ALF-Modell bei Ratten durch die Kombination der Wirkungen der partiellen Hepatektomie (PHx) und niedrigeren Dosen eines hepatotoxischen Reagenzes geschaffen. APAP hat eine etablierte Rolle bei der Entstehung von Leberschäden5,24,25. Es ist ein weit verbreitetes Schmerzmittel und ist toxisch für die Leber in supratherapeutischen Dosen durch die Bildung von toxischen Metaboliten. APAP ist die Ursache für viele Todesfälle in den Industrieländern. Körperliche Verletzungen durch partielle Hepatektomie initiieren Aktivierung verschiedener Prozesse bei Entzündungen sowie Leberregeneration. Die Injektion des hepatotoxischen Mittels APAP verursacht eine feindliche Umgebung in der Leber und verhindert die Proliferation von Hepatozyten. Dies reduziert die Belastungszeit für das Tier, was in Kombination mit kleineren Dosen von Hepatotoxin zu einer besseren Reproduzierbarkeit des Verfahrens führt. Daher wurde mit diesem Modell eine kombinatorische Wirkung von zwei Arten von Leberverletzungen untersucht. Um das entwickelte ALF-Tiermodell zu charakterisieren, wurden physiologische und biochemische Parameter untersucht. Die erfolgreiche Reversibilität von ALF wurde durch die Transplantation syngenischer gesunder Rattenhepatozyten bestätigt.

<table><tbody><tr><td>Paracetamol (Biocetamol)</td><td>EG Pharmaceuticals</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Alkalisches Phosphatase-Kit (DEA)</td><td>Coral Clinical System, Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Automatisiertes Analysegerät</td><td>Tulip, Alto Santracruz, Indien</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>Biochemisches Analysegerät für Leberfunktionstest</td></tr><tr><td>Betadin ( Povidon-Jod-Lösung)</td><td>Win-Medicare; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank (Klasse I)</td><td>Kartos international; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Hellfeldmikroskop</td><td>Olympus, Japan</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxim (Taxim&reg;)</td><td>AlKem; Indien</td><td></td><td>Cefotaxim-Natrium-Injektion, keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Sigma; US</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ I</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Pure Swabs Pvt Ltd; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Abdecktuch</td><td>JSD Surgicals, Delhi, Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y-Lösung, alkoholisches</td><td>Sigma; US</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Zangen</td><td>Große chirurgische Eingriffe; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Gasanästhesiesystem</td><td>Ugo Basile; Italien</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Himedia, Indien</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme (Veet&reg;)</td><td>Reckitt Benckiser, Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Lösung, Mayer's</td><td>Sigma; US</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz</td><td>Himedia; Indien</td><td>RM554</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase aus Schafen Hoden</td><td>Sigma; US</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>I.V. Kanüle (Plusflon)</td><td>Mediplus, Indien</td><td>Ref 1732411420</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritzen</td><td>BD; US</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Foran&reg;)</td><td>Asecia Queenborough</td><td>Nr. B506</td><td>Inhalationsanästhetikum</td></tr><tr><td>Ketamin (Ketamax&reg;)</td><td>Troikaa Pharmaceuticals GmbH</td><td></td><td>IP für Ketaminhydrochlorid, keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Meloxicam (Melonex&reg;)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Mikronadelhalter gerade & gebogener</td><td>Mercian; England</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Nadelhalter gerade & gebogener</td><td>Mercian; England</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Histo-Line Laboratories, Italien</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Thread</td><td>mächtig; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Himedia; Indien</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td><td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td><td>P3060</td><td>Keine spezifische Katalognummer</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Major Ssurgeonicals; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Große Chirurgie; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>SGOT (ASAT) KIT Coral</td><td>Clinical System, Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation; US</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge Nr. 22</td><td>La Medcare, Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Chirurgische Platine</td><td>lokal hergestellt</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Chirurgisches weißes Klebeband</td><td>3M Indien; Indien</td><td>1530-1</td><td>Mikroporen-Chirurgie-Bandnähte</td></tr><tr><td></td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, Indien</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen (1ml, 26 g)</td><td>Dispo Van; Indien</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>Trimmer (Clipper)</td><td>Philips</td><td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Braun</td><td></td><td>Keine spezifische Katalognummer (lokale Beschaffung)</td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Himedia; Indien</td><td>AT125</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (Xylaxin&reg;)</td><td>Indian Immunologicals Limited</td><td></td><td>Beruhigungsmittel, Präanästhetikum, Analgetikum und Muskelrelaxans</td></tr></tbody></table>

generierung eines rattenmodells für akutes leberversagen durch kombination von 70% partieller hepatektomie und acetaminophen

Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen

Akutes Leberversagen (ALF) ist ein klinischer Zustand, der durch verschiedene Ätiologien verursacht wird, was zum Verlust von metabolischen, biochemischen, synthetisierenden und entgiftenden Funktionen der Leber führt. In den meisten irreversiblen Leberschäden, orthotrope Lebertransplantation (OLT) bleibt die einzige verfügbare Behandlung. Um das therapeutische Potenzial einer Behandlung für ALF zu untersuchen, ist ihre vorherige Prüfung in einem Tiermodell von ALF unerlässlich. In der aktuellen Studie wurde ein ALF-Modell bei Ratten entwickelt, indem 70% partielle Hepatectomie (PHx) und Injektionen von Acetaminophen (APAP) kombiniert wurden, das ein therapeutisches Fenster von 48 h bietet. Die medianen und linken seitlichen Lappen der Leber wurden entfernt, um 70% der Lebermasse zu verbrauchen und APAP wurde 24 h postchirurgisch für 2 Tage gegeben. Das Überleben bei ALF-induzierten Tieren wurde als stark verringert. Die Entwicklung von ALF wurde durch veränderte Serumspiegel der Enzyme Alanin-Aminotransferase (ALT), Aspartat-Aminotransferase (AST), alkalische Phosphatase (ALP); Veränderungen der Prothrombinzeit (PT); und Bewertung des international normalisierten Verhältnisses (INR). Die Untersuchung des Genexpressionsprofils durch qPCR ergab einen Anstieg der Expressionskonzentrationen von Genen, die an Apoptose, Entzündungen und am Fortschreiten der Leberverletzung beteiligt sind. Diffuse Degeneration von Hepatozyten und Infiltration von Immunzellen wurde durch histologische Auswertung beobachtet. Die Reversibilität von ALF wurde durch die Wiederherstellung des Überlebens- und Serumspiegels von ALT, AST und ALP nach intrasplenischer Transplantation syngenischer gesunder Rattenhepatozyten bestätigt. Dieses Modell stellt eine zuverlässige Alternative zu den verfügbaren ALF-Tiermodellen dar, um die Pathophysiologie von ALF zu untersuchen und das Potenzial einer neuartigen Therapie für ALF zu bewerten. Die Verwendung von zwei verschiedenen Ansätzen ermöglicht es auch, die kombinierte Wirkung von körperlichen und drogeninduzierten Leberverletzungen zu untersuchen. Die Reproduzierbarkeit und Durchführbarkeit des laufenden Verfahrens ist ein zusätzlicher Vorteil des Modells.

Überlebensprozentsatz in Tiermodellen von ALF Die optimale Dosis von APAP, die ALF in Kombination mit 70% PHx verursachte, wurde als 750 mg/kg Körpergewicht standardisiert. Das Behandlungsschema begann 24 h nach 70% PHx, als sich die Tiere vollständig von der Operation erholt hatten, und bestand aus zwei APAP-Dosen in 24-Stunden-Intervallen. Die Sterblichkeit wurde mit einer Rate von 80% nach der Verabreichung der zweiten Dosis von APAP, 48 h nach der Operation beobachtet. Der Überlebensprozentsatz wu...

Das in der aktuellen Studie entwickelte Modell für akutes Leberversagen stellt eine praktikable Alternative zur Untersuchung potenzieller Therapien dar. Das aktuelle Modell nutzt die kombinierte Wirkung von körperlichen und drogeninduzierten Leberverletzungen und bietet ein geeignetes Zeitfenster, um das Potenzial neuartiger Therapien zu untersuchen.

Generierung eines Rattenmodells für akutes Leberversagen durch Kombination von 70% partieller Hepatektomie und Acetaminophen

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and ...

Akutes Leberversagen oder ALF ist im Allgemeinen definiert als schnelle Entwicklung von Leberschäden in einer gesunden Leber und wird von einer schweren Beeinträchtigung seiner Hauptfunktionen begleitet. Orthotopische Lebertransplantation ist die einzige verfügbare Heilung in den meisten Fällen. Aber aufgrund des Mangels an Leberspendern ist die Sterblichkeitsrate bei ALF-Patienten sehr hoch.Um das Potenzial alternativer therapietherapeutischer Ansätze zu untersuchen und die Pathophysiologie von ALF besser zu verstehen, werden Tiermodelle der Krankheit eingesetzt. Viele der ALF-Modelle basieren auf der hepatotoxischen Wirkung von Acetaminophen, Tetrachlorkohlenstoff, Concanavalin A, Lipopolysaccharid, D-Galactosamin und Thioacetamid. Diese weisen jedoch einige Mängel auf, wie schlechte Reproduzierbarkeit und Reversibilität, Toxizität gegenüber anderen lebenswichtigen Organen, schlechte Reflexion der Pathologie menschlicher Krankheiten und Artenvariation.Daher ist ein besseres Modellsystem erforderlich, das reproduzierbar ist und ein ausreichendes Zeitintervall ermöglicht, um die Wirkung einer therapeutischen Intervention zu untersuchen. In der aktuellen Studie wurde ein ALF-Modell bei Ratten durch die Kombination von Wirkungen der partiellen Hepatektomie und Acetaminophen Hepatotoxizität erstellt. Median und linker Seitenlappen der Leber werden entfernt, um 70% Lebermasse zu verbrauchen, und weiter, Acetaminophen wird gegeben, um ALF verursachen.Die Entwicklung von ALF im Modell wurde durch biochemische und histologische Analyse gekennzeichnet und die Reversibilität von Leberschäden wurde durch die Transplantation von syngenen gesunden Rattenhepatozyten bestätigt. Wistar Ratten mit Körpergewicht im Bereich von 180 bis 250 Gramm wurden in der aktuellen Studie verwendet. Die folgenden Schritte beschreiben den chirurgischen Eingriff zur Induktion von ALF bei einer Ratte.Das Tier wird durch Injektion von Ketamin-Xylazin-Mischung intraperitoneal anästhesiert. Die vollständige Anästhesisierung wird durch Kneifen der Zehen des Tieres bestätigt, und weitere Eingriffe werden nur durchgeführt, wenn kein Pedalreflex vorhanden ist. Um die Austrocknung der Hornhaut zu verhindern, wird ein auf Carboxy Methyl-Zellulose basierender Augentropfen auf beide Augen aufgetragen.Das Tier wird mit einem weißen Klebeband an das Operationsbrett zurückgehalten. Das Haar wird mit einem elektrischen Knipser aus dem rechten Bauchbereich entfernt. Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle durch drei abwechselnde Peelings von 70% Ethanol und Povidon Jod mit sterilisierten Wattepads in kreisförmiger Bewegung.Die zu schneidende Haut ist direkt unter dem Brustbein senkrecht zum Xiphoid und parallel zum Brustkorb markiert. Über der markierten Haut wird ein steriles Drapat mit einer Öffnung von etwa drei Zentimetern um einen Zentimeter platziert. Ein Querschnitt von etwa zwei bis drei Zentimetern wird entlang der markierten Linie mit Hilfe eines Skalpells gemacht.Die Befestigung der Haut mit der darunter liegenden Muskelschicht in der Nähe des eingeschnittenen Bereichs wird durch sterile feuchte Baumwollspitzen schonend entfernt. Als nächstes wird ein Querschnitt durch peritoneale Schicht direkt unter dem xiphoiden Prozess gemacht. Der linke Leberlappen wird durch einen sanften Druck auf den Thorax mit Hilfe von zwei kochigen befeuchteten Baumwollspitzen ausgesetzt.Eine sterile Nylon-Fadenschlaufe wird um den exponierten Leberlappen geschlüpft. Die Schleife wird mit Hilfe von Mikrosezierender Zangen oder Wattestäbchen sorgfältig an die Basis des Lappens gebracht. Mit Hilfe von Mikrochirurgie Nadelhalter und Mikrozange, die beiden Enden der Schleife sind gebunden, platzierung den Knoten so nah wie möglich an der Basis des Lappens.Dies ist, um die Blutgefäße zu verengen und Blutungen zu reduzieren, nachdem der Leberlappen entfernt wurde. Auf der anderen Seite sind zwei weitere Knoten gebunden. Der gebundene Lappen wird mit einer mikrochirurgischen Schere, die einen ischämischen Stumpf hinterlässt, knapp über den Knoten geschnitten.In ähnlicher Weise wird der Medianlappen der Leber mit Baumwollspitzen angehoben. Erkennen Sie die einzigartige Form des Medianlappens der Leber. Legen Sie eine Nylon-Gewindeschlaufe über den Lappen, binden Sie seine Enden fest.Auf der anderen Seite sind zwei zusätzliche Knoten gebunden und stellen den Lappen wieder auf. Nach dem Entfernen der Lappen wird das Peritoneum mit resorbierbarer Catgut-Chrom-4/0-Absorber-Nähte mit kontinuierlichen Stichen, gefolgt von hautnah mit einfacher unterbrochener Naht, genäht. Nach dem Hautverschluss wird Povidon-Jodlösung um die chirurgische Stelle aufgetragen.Das Drapat wird entfernt und das Tier vom Operationsbrett entfernt. Eine Antibiotikadosis von 12 Milligramm Cefotaxim in einem ml 5%Glukoselösung wird dem Tier intraperitoneal verabreicht, um es vor dem Risiko einer postoperativen Infektion zu schützen. Zur Schmerzlinderung nach der Operation wird das schmerzstillende Meloxicam, typischerweise 1 mg pro kg Körpergewicht, dem Tier subkutan verabreicht, gefolgt von einer Dosis pro Tag für zwei Tage.Das Tier wird in einen warmen Bergkäfig gebracht. Das Tier wird innerhalb von 30 bis 40 Minuten bei Bewusstsein und beginnt sich zu bewegen. Das operierte Tier wird isoliert gehalten, bis die chirurgischen Wunden vollständig verheilt sind, was drei bis vier Tage dauern kann.Zur Induktion von ALF werden 750 Milligramm pro kg Körpergewicht von Acetaminophen und die zweite Dosis Meloxicam intraperitoneal 24 Stunden nach teilweisem Hepatectomieverfahren injiziert. Diese Dosis wird nach 24 Stunden wiederholt. Nach der Induktion von ALF wurde festgestellt, dass das Überleben bei Tieren stark verringert wurde.Um die Entwicklung von ALF zu charakterisieren, wurden operierte Tiere nach der zweiten Dosis Acetaminophen eingeschläfert, und verschiedene biochemische und histologische Studien wurden durchgeführt. Die Ergebnisse werden im Folgenden im Video beschrieben. Der Überlebensprozentsatz in der ALF-induzierten Gruppe wurde als stark verringert und die Sterblichkeit von bis zu 80 % innerhalb von 24 Stunden nach der zweiten Dosis Von Acetaminophen beobachtet.Leberschäden waren auf morphologischer Ebene in der ALF-induzierten Gruppe und nur 70% der partiellen Hepatektomiegruppe zu erkennen. Während die Kontrollgruppe und nur Acetaminophen behandelt Gruppe hatte ein gesundes Aussehen. Enzymspiegel von Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase und alkalischer Phosphatase wurden in der ALF-induzierten Gruppe im Vergleich zu anderen Gruppen als stark erhöht befunden.Die Analyse des Genexpressionsprofils durch qPCR zeigte eine erhöhte Expression von Genen, die an Apoptose, Entzündung und Fortschreiten der Leberverletzung beteiligt waren. Hämatoxylin und Eosin Färbung von Lebergewebe Abschnitte zeigten meist normale Hepatozyten in der Kontrollgruppe. In der ALF-Gruppe wurde eine meist moderate makrovesikuläre Fettdegeneration beobachtet.Prothrombin-Zeit und International Normalized Ratio wurden in der ALF-induzierten Gruppe erhöht, was auf einen behinderten Blutgerinnungsprozess hindeutet. Es wurde festgestellt, dass der Überlebensprozentsatz in der ALF-induzierten Gruppe nach der Transplantation syngenischer gesunder Rattenhepatozyten wiederhergestellt wurde. Serumspiegel der Enzyme Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase und alkalische Phosphatase wurden bei ALF-induzierten Tieren nach einer Zelltransplantation wiederhergestellt.Diese Methode der Induktion von ALF bei Ratten ist reproduzierbar, zeigt eine gute Reversibilität und bietet ein geeignetes Zeitfenster, um neue Therapien zu testen. Daher kann dieses Modell als effizientes Krankheitsmodell für die Bewertung potenzieller therapeutischer Ansätze zur Behandlung von ALF dienen.

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JoVE Journal

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Lebertransplantation bei Ratten ist ein unverzichtbares experimentelles Modell für die biomedizinische Forschung. Hier präsentieren wir unsere chirurgischen Verfahren zur orthotopen Ratten Lebertransplantation mit arteriellen Rekonstruktion mit 50% partielle Transplantat.

Chirurgische Verfahren für eine Ratte Modell Teilweise Lebertransplantation mit arteriellen Rekonstruktion

Hilfslebertransplantation bietet eine temporäre Unterstützung in akuten Leberversagen, bis die Regeneration der Leberversagen. Die heterotope Hilfslebertransplantation (HALT) mit Pfortader Arterialisation (PVA) macht ausreichende Leberfunktion. Wir entwickelten eine analoge Technik in der Ratte, um den Einfluss der Pfortader Arterialisation auf die Morphologie und Funktion des Transplantats zu untersuchen.

Heterotope Hilfs Ratte Leber-Transplantation mit strömungs geregelt Pfortader Arterialisation in akutes Leberversagen

Wir beschreiben eine Methode, um ein Tiermodell der Leberfibrose bei der Ratte zu erstellen und den Grad der Fibrose durch histologische Untersuchung der Leber zu beurteilen. Das Modell kann sowohl zur Untersuchung der Entwicklung von Lebererkrankungen als auch zur Prüfung der Wirksamkeit potenzieller antifibrotischer Wirkstoffe verwendet werden.

Die Dimethylnitrosamin Induced Liver Fibrosis Modell in der Ratte

Ein einzigartige Rattenleber hilar Clamp-Modell wurde für die Untersuchung der Auswirkungen von pharmakologischen Molekülen in Lindern Ischämie-Reperfusionsschaden entwickelt. Dieses Modell beinhaltet direkte Kanülierung der Portal Versorgung des ischämischen Lebersegment über einen Zweig des Pfortader, was eine direkte hepatische Lieferung.

Methode der direkten segmentale Intra-Leber-Lieferung Mit einer Rattenleber Hilar Clamp Modell

Induktion schnelle Leber Hypertrophie mit Leber-Partition zuordnen und Pfortader Ligatur für eine Hepatektomie bereitgestellt wurde (ALPPS) für die Resektion von borderline entfernbaren Lebertumoren vorgeschlagen. Dieses Modell kann schnelle Hypertrophie Mechanismen aufzuklären und ermöglicht die Prüfung von Betäubungsmitteln, die fördern oder blockieren die Beschleunigung der Regeneration.

Rattenmodell der Leber Partition zuordnen und Pfortader Ligation inszenierten Hepatektomie (ALPPS) Verfahren

Hier beschreiben wir eine gängige Methode um chronische Schädigung der Leber bei Mäusen zu induzieren, durch die Fütterung einer Cholin-Mangel und Ethionine ergänzt (CDE) Ernährung. Wir zeigen Systemüberwachung, Leber Perfusion, Isolation und Erhaltung. Schädigung der Leber, Pathohistology, Fibrose, entzündliche, und Leber Stammvater-Zell-Reaktionen kann ein zeitlichen Verlauf von sechs Wochen mitteilen.

Der murinen Cholin-Mangel, Ethionine ergänzt (CDE) Diät-Modell einer chronischen Leberschädigung

Hier ist ein Protokoll mit neu arterialized Ratte teilweise Lebertransplantation vorgestellt. Insbesondere war 70 % Leber resezierten in Vivo durch eine aktualisierte Technik des Schiffes-orientierte Hepatektomie. Die leberarterie wurde in einer End-to-Side Weise rekonstruiert. Die Manschette Technik wurde modifiziert, um die Anastomose Infrahepatic Vena Cava verkürzen.

Re Arterialized Ratte teilweise Leber Transplantation mit einem in Vivo Schiff-orientierte 70 % Hepatektomie

Hier präsentieren wir eine neue Methode zur teilweisen Resektion des linken hepatischen Lappens bei Neugeborenen (Tag 0) Mäusen. Dieses neue Protokoll eignet sich für akute Leberschädigung und Verletzungen Reaktion in der neonatalen Einstellung zu studieren.

Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration

Dieses Protokoll beschreibt eine gängige und praktikable Methode zur Induktion akuter Leberverletzungen (ALI) über cCl4 Exposition durch eine orogastrische Röhre. CCl4 Exposition induziert ALI durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies während seiner Biotransformation in der Leber. Diese Methode wird verwendet, um die Pathophysiologie von ALI zu analysieren und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu untersuchen.

Induzieren akute Leberverletzung bei Ratten über Kohlenstofftetrachlorid (CCl4) Exposition durch eine orogastrische Röhre

Das Mausmodell der partiellen 2/3 (66%) Hepatektomie ist in der Literatur gut beschrieben, aber ausgedehntere Hepatektomien, die das Small-for-Size-Syndrom nach Lebertransplantation nachahmen, wurden selten verwendet. Wir beschreiben eine erweiterte 78%ige Hepatektomie in einem Mausmodell, die bei gesunden Mäusen zu einer postoperativen Letalität von etwa 50% führt.

Erweiterte 78%-Hepatektomie in einem chirurgischen Mausmodell

Erfahren Sie, wie ein reproduzierbares Rattenmodell für akutes Leberversagen durch 70% partielle Hepatektomie und Acetaminophen entwickelt wird. Diese Methode ermöglicht die Evaluation neuer Therapieansätze.

Generierung eines Rattenmodells für akutes Leberversagen durch Kombination von 70% partieller Hepatektomie und Acetaminophen

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