Name: Differenzierung von Mausbrustepithel-HC11- und EpH4-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung von Mausbrustepithelzellen HC11 und EpH4 in Kultur. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Signalwegen und Onkogenen für die Krebstherapieforschung.

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Die HC11-Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. D. Medina (Houston, TX) zur Verfügung gestellt. Die Autoren sind Dr. Andrew Craig von der Queen es University für viele Reagenzien und wertvolle Vorschläge dankbar. EpH4-Zellen waren ein Geschenk von Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick leistete hervorragende technische Unterstützung für 3D-Kulturstudien.
Finanzielle Unterstützung des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), der Canadian Institutes of Health Research (CIHR), der Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), der Canadian Breast Cancer Research Alliance , die Ontario Centres of Excellence, die Breast Cancer Action Kingston (BCAK) und der Clare Nelson Vermächtnisfonds durch Zuschüsse an LR werden dankbar anerkannt. BE erhielt Stipendien von CIHR, CBCF, BCAK und Cancer Research Society Inc. PTG wird von einem Canada Research Chair, der Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC und der Canadian Cancer Society unterstützt. MN wurde von einem Studentenwerk des Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research von NCIC, einem Graduate Award (QGA) und einem Dean es Award der Queen es University unterstützt. MG wurde durch Postdoktorandenstipendien des US Army Breast Cancer Program, des Ministry of Research and Innovation der Provinz Ontario und des Advisory Research Committee der Queen es University unterstützt. VH wurde durch ein CBCF-Doktorandenstipendium und ein Postdoktorandenstipendium des Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research in Partnerschaft mit CIHR unterstützt. Hanad Adan erhielt ein NSERC-Sommerstudium. BS wurde von einem Queen es University Graduate Award unterstützt.

1. Beschichtung HC11 Zellen
<ol><li>In einer laminaren Durchflusshaube mit sterilen Techniken bereiten Sie eine Flasche mit 50 ml HC11 Zellmedium: RPMI-1640 mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 5 g/ml Insulin und 10 ng/ml EGF (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Platte ca. 400.000 Zellen pro 3 cm Petrischale: Zwei 10 cm, 50% konfluente Petrischalen in 23 cm Schalen in HC11 medium geben. Die Zellen müssen gut verteilt sein, aber das Trocknen muss vermieden werden.<ol>
<li>Mit einer Vakuumpumpe das Medium in einen Kolben aussaugen.</li>
		<li>Fügen Sie 250 l Trypsin (siehe Materialtabelle)pro 10 cm Platte hinzu. Wirbeln und schlagen Sie die Platte von den Seiten, während Sie es horizontal halten, um das Trypsin zu verbreiten und die angeschlossenen Zellen zu lösen</li>
		<li>Beobachten Sie unter Phasenkontrastmikroskopie mit einem 4x Objektiv, um sicherzustellen, dass sich die Zellen vor dem Pipetieren von den Rändern zu lösen begonnen haben.</li>
		<li>Aspirieren Sie ca. 1,5 ml HC11 Medium in einer sterilen, 9 Zoll Pasteur Pipette und spritzen Sie es vertikal gegen die Zellen. Drehen Sie die Petrischale beim Spritzen, um alle Zellen zu lösen. Sie müssen schnell arbeiten, um das Trocknen der Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Übertragen Sie alle Zellen auf die Flasche mit dem HC11 Medium und wirbeln.</li>
		<li>Pipette 2 ml Zellsuspension in je 3 cm Petrischale. Die Petri-Gerichte quer schaukeln, um sich gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie die Zellen in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am nächsten Tag, oder wenn Die Zellen sind 90-100% konfluent, aspirieren das Medium, und ersetzen Sie es mit Medium mit FBS und Insulin, aber ohne EGF.</li>
</ol>2. Differenzierungsinduktion, Überwachung und Quantifizierung von HC11-Zellen
<ol><li>Nach dem Anbau der Zellen in mittelfehlendem EGF für 24 h, fügen Sie das Differenzierungsmedium (HIP-Medium) auf zehn 3 cm Platten: RPMI-1640 ergänzt mit 10% FBS, 1 g/mL HYdrocortison (siehe Tabelle der Materialien), 5 g/mL Insulin und 5 g/mL PRolactin (siehe Tabelle der Materialien) für bis zu 10 Tage.</li>
	<li>Bewahren Sie die anderen zehn 3 cm Platten als Steuerung auf: Wechseln Sie auf ein Medium mit 10% FBS und 5 g/ml Insulin ohne EGF und HIP.</li>
	<li>Ändern Sie das Medium alle 2–3 Tage in HIP-behandelte Zellen und Steuerelemente. Pipette das Medium sorgfältig, um sicherzustellen, dass Zellen nicht lösen.</li>
	<li>Zur Überwachung der Differenzierung (d. h. der Bildung von "Kuppeln") beobachten Sie die Zellen unter Phasenkontrastmikroskopie(Abbildung 1A, linkes Panel). Wenn die Zellen grünes Fluoreszenzprotein (GFP) exezieren, beobachten Sie unter Fluoreszenzmikroskopie (Erregung = 485/20; Emission = 530/25; Vergrößerung 240x; 20x Objektiv) (Abbildung 1A, rechtes Panel).</li>
	<li>Um den Grad der Differenzierung zu quantitieren, extrahieren Sie Proteine aus einer Petrischale jeder VON HIP-behandelten Zellen und Kontrollen, einmal täglich für insgesamt 10 Tage und untersuchen Western-Blots für .-Casein (siehe Tabelle der Materialien) ( Abbildung1B).<ol>
<li>Die Zellen auf Eis mit 1,5 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS) in ein 1,8 ml Kunststoffzentrifugenrohr zerkleinern.</li>
		<li>Pellet die Zellen bei 350 x g, 1 min, 4 °C.</li>
		<li>Waschen Sie das Pellet 2x schnell mit eiskaltem PBS. Entleeren Sie rückstände.</li>
		<li>Einen Lysepuffer bilden: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 g/ml Aprotinin, 10 g/ml Leupeptin16. Fügen Sie 100 l pro 3 cm Petrischale hinzu.</li>
		<li>Klären Sie das Lysat durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 min in der Kälte.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration (siehe Materialtabelle) und laden Sie 10–20 g Protein aus jeder Probe auf ein 10% Polyacrylamid-SDS-Gel.</li>
		<li>Elektrophorese für 15 h bei 45 V oder bei 100 V für 2–2,5 h.</li>
		<li>Übertragung auf eine Nitrocellulose- oder PVDF-Membran mit einem Elektroblotting-Transfergerät (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Block mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Kochsaline mit 0,1% Tween-20 (TBST).</li>
		<li>Fügen Sie den primären Antikörper, Ziege Anti---Casein verdünnt 1:2.000 oder Maus Anti--Actin verdünnt 1:1.000 (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Waschen Sie 3x mit TBST, 5 min jedes Mal.</li>
		<li>Fügen Sie den sekundären Antikörper, Meerrettichperoxidase (HRP) verknüpft Esel Anti-Ziete verdünnt 1:2.500, oder HRP verknüpft Pferd Anti-Maus-Antikörper verdünnt 1:10,000.</li>
		<li>Waschen Sie 3x mit TBST, 5 min jedes Mal.</li>
		<li>Fügen Sie der Membran eCL-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Beschichtung und 3D-Wachstum von EpH4-Zellen in EHS-Matrix
HINWEIS: Die Matrix ist bei Temperaturen von <10 °C flüssig und bei Temperaturen über 10 °C fest. Bei -80 °C lagern. In der Nacht vor Gebrauch bei 4 °C auftauen. Die Gewebekulturplatten und Pipettenspitzen vor der Handhabung bei -20 °C vorkühlen und die Matrix-, Platten- und Pipettenspitzen auf Eis halten, um eine Erstarrung zu verhindern.
<ol><li>Wachsen Sie EpH4-Zellen in 2D in RPMI-1640 Medium mit 10% FBS und 5 g/ml Insulin (EGF ist nicht erforderlich).</li>
	<li>Bereiten Sie EpH4-Wachstumsmedium, ergänzt durch 10% (v/v, 3.500 l) oder 20% (v/v 2.000 l) Matrix in zwei 50 ml konischen Röhren. Auf Eis bleiben, bis es einsatzbereit ist.</li>
	<li>10 Bohrungen (je 1 cm2) einer 24-Well-Platte mit 150 l unverdünnter Matrix beschichten. Verteilen Sie die Matrix mit einer Pipettenspitze. Vermeiden Sie blasen. Tippen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platte, während Sie sie horizontal halten, um sicherzustellen, dass die Matrix gleichmäßig über den Boden des Brunnens verteilt ist.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 24 Wellplatte bei 37 °C für 1 h, damit die Matrix erstarrt.</li>
	<li>Trypsinize EpH4-Zellen wie oben für HC11-Zellen beschrieben und zählen sie mit einem Hämozytometer. 5 x 104 Zellen pro Brunnen auf ein 1,5 ml steriles konisches Zentrifugenrohr übertragen und bei 250 x g 5 min drehen.</li>
	<li>Das Medium vorsichtig ansaugen und die Röhre auf Eis legen.</li>
	<li>Resuspend-Zellen in 350 l EpH4 Wachstumsmedium ergänzt mit 20% Matrix mit einer 1 ml Pipettenspitze, während die konische Röhre auf Eis zu halten. Vermeiden Sie Blasen. Es ist wichtig, eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.</li>
	<li>Sobald sich die Matrix der unteren Schicht verfestigt hat (die Matrix sollte im Vergleich zur ursprünglichen Beschichtung der Brunnen transluzent und heller erscheinen), fügen Sie die 350 l Zellsuspension zu jedem beschichteten Brunnen hinzu und legen Sie sie in einenCO2-Inkubator bei 37 °C für 1 h, damit sich die 20%ige Matrixschicht verfestigen kann.<ol>
<li>Beobachten Sie die Zellen mikroskopisch unter Phasenkontrast mit einem 4x Objektiv. Einzelne Zellen sollten sichtbar sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 200 L EpH4-Medium mit 10% Matrix auf die 350 L Zellen, die in 20% Matrix suspendiert sind, hinzuzufügen. Bei 37 °C inkubieren.</li>
</ol>4. Differenzierungsinduktion von EpH4-Zellen, die in 3D angebaut werden (Abbildung 2)
HINWEIS: Neben der Differenzierung können EpH4-Zellen auch Tubulogenese erleiden, wenn sie mit HGF (Hepatozyten-Wachstumsfaktor) in der 3D-Kultur stimuliert werden. TubularE Auswüchse können nach 10 Tagen HIP- und HGF-Stimulation gesehen werden.
<ol><li>Beginnen Sie die Differenzierungsinduktion von EpH4-Zellen 1 Tag nach der Beschichtung in der Matrix. Entfernen Sie vorsichtig 150 l des oberen Mediums, das 10% Matrix enthält, mit einer Kunststoff-Pipettespitze aus den Brunnen. Fügen Sie 200 L EpH4-Medium mit HIP und 10% Matrix hinzu.</li>
	<li>Ersetzen Sie das 10% Matrix-HIP Medium alle 2 Tage für bis zu 10 Tage. Wachsen Sie Kontrollzellen im gleichen 10% Matrixmedium ohne HIP.</li>
	<li>Überwachen Sie die Mammosphärenbildung unter Phasenkontrast(Abbildung 3A, unteres Panel).</li>
</ol>5. Tubulogenese Induktion von EpH4-Zellen in 3D angebaut (Abbildung 3A und 3C)
<ol><li>Bereiten Sie 24 Well-Platten und EpH4-Zellen für das Wachstum in der Matrix vor, wie in den Schritten 3.1–3.9 beschrieben. Entfernen Sie am Tag nach der Beschichtung der Zellen in der Matrix 150 L EpH4-Medium mit 10% Matrix aus den Brunnen mit einer Kunststoff-Pipettenspitze. Fügen Sie 200 L EpH4-Medium mit 10% Matrix, HIP und 20 ng/ml HGF hinzu (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Ersetzen Sie das 10%-Matrix-/HIP/HGF-Medium alle 2 Tage für bis zu 12–14 Tage.</li>
	<li>Überwachen Sie die Tubulibildung mikroskopisch mit einem 20x- oder 40x-Objektiv(Abbildung 3A, rechtes Panel).</li>
</ol>6. Quantifizierung der Differenzierung: Western Blotting für '-Casein
<ol><li>Sorgfältig Pipetten aus dem 10% Matrix-HIP Medium aus den Brunnen. Spülen Sie die 20% Matrixschicht 2x mit 350 l eiskaltem PBS. Die Sphäroide sollten weiterhin in der Matrixschicht vorhanden sein.</li>
	<li>700–1.000 l eiskaltes PBS mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) direkt in die Brunnen geben. Lösen Sie die untere Schicht der 100%-Matrix vorsichtig mit einer Pipettenspitze vom Brunnen, um sphäroide in dieser Schicht vorhandene Sphäroide wiederherzustellen. 30 min bei 4 °C vorsichtig schütteln.</li>
	<li>Übertragen Sie die Sphäroidsuspension vorsichtig in ein konisches Rohr. Spülen Sie die Brunnen mit einem PBS-EDTA-Wert von 500 ,,,um alle verbleibenden Sphäroide in den Brunnen wiederherzustellen und in das konische Rohr hinzuzufügen.</li>
	<li>Rock auf Eis für weitere 30 min. Stellen Sie sicher, dass sich die Matrix vollständig aufgelöst hat. Wenn sichtbare Matrixklumpen gesehen werden, fügen Sie weitere PBS-EDTA hinzu oder schütteln Sie länger.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Lösung, um die Sphäroide bei 350 x g für 5 min zu pellet.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand, lysieren Sie die Sphäroide im eiskalten Lysepuffer und sonden Sie nach sondieren für s-Casein, Cyclin D1 und p120RasGAP durch Western Blotting wie in Schritt 2.5 über16. Als primäre Antikörper verwenden Sie Ziegen-Anti--Casein verdünnt 1:2.000, Kaninchen Anti-Cyclin D1 verdünnt 1:2.000, und Maus Anti-p120 verdünnt 1:2.000. Für sekundäre Antikörper verwenden HRP-verknüpfte Esel Anti-Ziete verdünnt 1:2.500, HRP verknüpft Esel Anti-Kaninchen verdünnt 1:2.500, und HRP verknüpft Pferd Anti-Maus verdünnt 1:10,000.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

HC11-Zellen eignen sich ideal für die Untersuchung der Differenzierung in Verbindung mit neoplastischer Transformation. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass HC11-Zellen leicht mit Mo-MLV-basierten retroviralen Vektoren infizieren können, um eine Vielzahl von Genen auszudrücken. In unseren Händen waren EpH4-Zellen schwieriger mit den gleichen retroviralen Vektoren zu infizieren als HC112.
Zell-zu-Zell-Kontakt und Wachstumsstillstand sind wichtige Voraussetzungen für die HC...

In normalen Geweben oder Tumoren haben Zellen umfangreiche Möglichkeiten, sich in einer dreidimensionalen Organisation an ihre Nachbarn zu halten, und dies wird in der Kultur durch das Wachstum von Zellen mit hoher Dichte nachgeahmt. Die Zell-zu-Zell-Adhäsion wird hauptsächlich über Cadherinrezeptoren vermittelt, die die Zell- und Gewebearchitektur definieren. Interessanterweise wurde vor kurzem gezeigt, dass Cadherine auch eine mächtige Rolle bei der Signaltransduktion spielen, insbesondere bei der Überlebenssignalisierung1. Paradoxerweise wurden einige dieser Zell-zu-Zell-Adhäsionssignale, die von Cadherinen ausgingen, vor kurzem sowohl von der Differenzierung als auch von der Neoplasie geteilt2. Hier beschreiben wir Methoden der Induktion und Bewertung der Differenzierung in zwei repräsentativen Arten von Mausbrustepithelzelllinien, HC11 und EpH4.
Die HC11 Maus Brust epitheliale Zelllinie kann ein nützliches Modell für die Untersuchung der Epithelzelldifferenzierung bieten. HC11-Zellen sind eine VON COMMA-1D abgeleitete Zelllinie, die aus der Brustdrüse einer mittelschwangeren Balb/c-Maus3stammt. Im Gegensatz zu anderen COMMA-1D-Derivateklonen hat der HC11-Klon keine Anforderung an exogen zugesetzte extrazelluläre Matrix oder Kokultivierung mit anderen Zelltypen zur In-vitro-Induktion des endogenen -casein-Gens durch lactogene Hormone3. Diese Zelllinie wurde in Differenzierungsstudien ausgiebig verwendet, da sie wichtige Eigenschaften des normalen Brustepithels beibehalten hat: HC11-Zellen können dasduktale Epithel teilweise in einem gereinigten Brustfettpad 4 rekonstituieren. Darüber hinaus können sie in einer zweidimensionalen (2D) Kultur unterscheiden, wenn sie zu Zusammenfluss an einer Kunststoff Petri schale Oberfläche in Gegenwart eines Steroids wie HYdrocortison oder Dexamethason, zusätzlich zu Insulin und PRolactin (HIP Medium) ohne epidermale Wachstumsfaktor (EGF), ein Inhibitor der Differenzierung5,6,7. Unter diesen Bedingungen produzieren HC11-Zellen Milchproteine wie z.B. '-Casein und WAP, die durch Western Blotting innerhalb von 4 Tagen nach der Induktion nachweisbar sind. Gleichzeitig bildet ein Teil der HC11-Zellen rudimentäre Brustdrüsenstrukturen, die auf stochastische Weise als "Dome" bezeichnet werden. Kuppeln sind 4–5 Tage nach der Induktion sichtbar und nehmen bis zum Tag 10 allmählich zu, zusammen mit einer Erhöhung der Produktion von '-Casein8. Interessanterweise besitzen HC11-Zellen mutierte p539und stellen daher einen präneoplastischen Zustand dar. Aus diesem Grund eignet sich das HC11-Modell ideal, um Signalnetze der Differenzierung in Verbindung mit Neoplasie im selben Zellsystem zu untersuchen.
EpH4-Zellen, ein Derivat von IM-2-Zellen, sind eine nichttumorogene Zelllinie, die ursprünglich aus spontan verewigten Maus-Mamma-Erüsen-Epithelzellen abgeleitet wurde, die aus einer mittelschwangeren Balb/c-Maus10isoliert wurden. EpH4-Zellen bilden kontinuierliche epitheliale Monolayer in der 2D-Kultur, differenzieren sich aber nicht in drüsenähnliche Strukturen10,11. Nach dem 3D-Wachstum in einem Material, das aus einer Mischung von extrazellulären Matrixproteinen besteht, die von EHS-Maussarkomzellen12 (EHS-Matrix, Matrix oder Matrigel, siehe Tabelle der Materialien)produziert werden, können EpH4-Zellen jedoch zusätzlich zur Stimulation mit HIP die Anfangsstadien der Brustdrüsendifferenzierung rekapitulieren. Unter diesen Bedingungen bilden EpH4-Zellen Sphäroide (auch Mammosphären genannt), die eine apikal-basale Polarität und ein hohles Lumen aufweisen und in der Lage sind, die Milchproteine -Casein und WAP zu produzieren, ähnlich wie lakierende Brustepithelzellen. Im Gegensatz zu HC11-Zellen, die undifferenziert sind, und einige exprimieren mesenchymale Marker13, EpH4-Zellen zeigen eine rein luminale Morphologie14. EpH4-Zellen wurden auch berichtet, Milchproteine in 2D-Kultur durch Stimulation mit Dexamethason, Insulin und Prolaktin15zu produzieren. Dieser Ansatz schließt jedoch die Untersuchung von regulatorischen Effekten aus, die die Mikroumgebung der Brustdrüse in der 3D-Kultur imitieren.

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamid/0,8% Bis-Lösung</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-Cyclin D1 Antikörper</td><td>Kaninchen, Santa Cruz</td><td>sc-717</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-p120 Antikörper</td><td>Maus, Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-& Beta; Aktin Antikörper</td><td>Maus, Cell Signalling technology</td><td>3700</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&Beta; Kasein Antikörper</td><td>Ziege, Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17971</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bio Shop</td><td>APR600</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Bicinchoninsäure Lösung</td><td>Sigma</td><td>B9643-1L-KC</td><td>Proteinbestimmung</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Bio Shop</td><td>ALB007.500</td><td>Proteinbestimmung</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrat</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML</td><td>Proteinbestimmung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Färben</td></tr><tr><td>von Digitonin</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>Färben</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Medium für HC11-Zellen</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Ziege - Anti Kaninchen-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Hepatozyten-Wachstumsfaktor rekombinant</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Pferd Anti-Maus HRP</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>7076</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>HIP Medium</td></tr><tr><td></td><td>Insulin Sigma</td><td>I6634</td><td>HIP Medium</td></tr><tr><td>Laminar-Flow Hood</td><td>BioGard Hood</td><td></td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bio Shop</td><td>LEU001.10</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm Matrix, Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Ziege HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8360</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 Reagenz</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>Färbemittel</td></tr><tr><td>Konfokales Multiphotonenmikroskop</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Bio Shop</td><td>SOV850</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Na4P207</td><td>Sigma</td><td>125F-0262</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Nikon Digitalkamera</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td> Phasenkontrastmikroskop <td>für Färbezwecke</td></tr><tr><td></td><td>Olympus IX70</td><td></td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Phenylmethylsuphonylfluorid</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>Prolaktin</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP Medium</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Zelle Nährmedium</td></tr><tr><td>Gewebekulturschale 35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatte-24 Well</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td>Zellkulturtransfergerät</td></tr><tr><td></td><td>CBS Scientific Co</td><td>EBU-302</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Tris Acetate</td><td>Bio Shop</td><td>TRA222.500</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>9002-07-7.</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Veritical Gelelektrophorese-System</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>Western Blotting</td></tr></tbody></table>

differenzierung von mausbrustepithel-hc11- und eph4-zellen

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherine spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zelldifferenzierung sowie der Neoplasie. Hier beschreiben wir die Ursprünge und Methoden der Induktion der Differenzierung von zwei Mausbrustepithelzelllinien, HC11 und EpH4, und ihre Verwendung zur Untersuchung komplementärer Stadien der Brustdrüsenentwicklung und neoplastischen Transformation.
Die HC11 Maus Brust epitheliale Zelllinie stammt aus der Brustdrüse einer schwangeren Balb/c Maus. Es unterscheidet sich, wenn es zu Zusammenfluss an einer Kunststoff-Petrischale Oberfläche in Medium mit fetalem Kalbsserum und HYdrocortison, Insulin und PRolactin (HIP-Medium) befestigt angebaut wird. Unter diesen Bedingungen produzieren HC11-Zellen die Milchproteine -Casein und Molkenssäureprotein (WAP), ähnlich wie laktierende Brustepithelzellen, und bilden rudimentäre Brustdrüsenstrukturen, die als "Dome" bezeichnet werden.
Die EpH4-Zelllinie wurde von spontan verewigten Maus-Mamma-Drüsen-Epithelzellen abgeleitet, die von einer schwangeren Balb/c-Maus isoliert wurden. Im Gegensatz zu HC11 können sich EpH4-Zellen vollständig in Sphäroide (auch Mammosphären genannt) unterscheiden, wenn sie unter dreidimensionalen (3D) Wachstumsbedingungen im HIP-Medium kultiviert werden. Die Zellen werden trypsinisiert, in einer 20%igen Matrix suspendiert, bestehend aus einer Mischung aus extrazellulären Matrixproteinen, die von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkomzellen hergestellt werden, auf einer Schicht konzentrierter Matrixbeschichtung einer Kunststoff-Petrischale oder Multiwell-Platte plattiert und mit einer Schicht von 10% Matrix-haltigem HIP-Medium bedeckt. Unter diesen Bedingungen bilden EpH4-Zellen hohle Sphäroide, die eine apikal-basale Polarität aufweisen, ein hohles Lumen, und produzieren '-Casein und WAP.
Mit diesen Techniken zeigten unsere Ergebnisse, dass die Intensität des Cadherin/Rac-Signals für die Differenzierung von HC11-Zellen entscheidend ist. Während Rac1 für die Differenzierung und niedrige Konzentrationen der aktivierten RacV12-Erhöhung der Differenzierung notwendig ist, blockieren hohe RacV12-Spiegel die Differenzierung und induzieren Neoplasie. Im Gegensatz dazu stellen EpH4-Zellen ein früheres Stadium der Brustepitheldifferenzierung dar, das durch selbst niedrige RacV12-Spiegelgehemmt wird.

Es ist seit langem bekannt, dass die Differenzierung von Epithelzellen und Adipozyten den Zusammenfluss und das Eingreifen von Kaderinen2erfordert. Wir und andere zeigten, dass Die Zell-zu-Zell-Haftung und -Interaktion von E- oder N-Cadherin und Cadherin-11, wie beim Zusammenfluss von kultivierten Zellen auftritt, löst eine dramatische Zunahme der Aktivität des kleinen GTPases Rac und des Zellteilungskontrollproteins 42 (Cdc42) aus, und dieser Prozess führt zur Aktivierung von Interleukin-6 (IL6) ...

Wir beschreiben Techniken zur Differenzierungsinduktion von zwei Brustepithellinien, HC11 und EpH4. Während beide fetales Kalbsserum, Insulin und Prolaktin benötigen, um Milchproteine zu produzieren, können sich EpH4-Zellen in der dreidimensionalen Kultur vollständig in Mammosphären differenzieren. Diese komplementären Modelle sind nützlich für Signaltransduktionsstudien der Differenzierung und Neoplasie.

Differenzierung von Mausbrustepithel-HC11- und EpH4-Zellen

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Die HC11- und EpH4-Zellen sind Mausbrust-Epithelzelllinien, die sich in der Kultur unterscheiden können. Gleichzeitig können diese Zellen durch eine Reihe von Onkogenen transformiert werden. Diese Zellen sind ideal für die Untersuchung der Wechselbeziehung zwischen Differenzierung und neoplastischer Transformation.Diese Techniken können in Signaltransduktionsstudien eingesetzt werden, um Ziele für die Krebstherapie zu entdecken. Zum Beispiel können die kleinen GTPase Rac und andere Moleküle die Transformation von Brustepithelzellen auslösen, wenn sie auf hohen Ebenen ausgedrückt werden, aber überraschenderweise auf niedrigen Niveaus, können sie Differenzierung induzieren. Andere Signalwandler können sich ähnlich verhalten.Die Prinzipien können auch für andere Arten der Differenzierung gelten, wenn der Zellzusammenfluss eine wichtige Rolle spielt, z. B. die Differenzierung von Adipozyten oder Myotuben. Jemand, der diese Technik zum ersten Mal durchführt, sollte bedenken, dass die Beschichtung der HC11-Zellen wichtig ist. Dies liegt daran, dass der Zell-zu-Zell-Kontakt für die Differenzierung wichtig ist.Ein weiterer Punkt, auf den Sie achten sollten, ist, dass die richtige Extraktion von EpH4-Zellen aus der Matrix für die Proteinquantitation von entscheidender Bedeutung ist, da Rückstände die Proteinbestimmung beeinflussen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist nützlich, da einige Details des Protokolls auf dem Papier schwer zu beschreiben sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Flasche von 50 Milliliter HC11 Zellmedium nach Manuskript Anweisungen.Um die Zellen zu verkachten, saugen Sie das Medium aus fünf sechs Zentimetern 50% konfluenten Petrischalen an und waschen Sie die Zellen mit etwa 1,8 Milliliter Trypsin mit einer sterilen Neun-Zoll-Baumwolle verstopften Pasteur Pipette. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Trypsin pro Platte hinzu und wirbeln Sie die Platte, um die angeschlossenen Zellen zu lösen. Beobachten Sie die Zellen unter Phasenkontrastmikroskopie mit einem 4X-Objektiv, um sicherzustellen, dass sie begonnen haben, sich zu lösen.Dann aspirieren Sie etwa 1,5 Milliliter HC11 Medium mit einer sterilen 9-Zoll-Pasteur-Pipette und spritzen Sie es vertikal gegen die Zellen, während Sie die Schale drehen, um sicherzustellen, dass Spritzer vermieden wird. Übertragen Sie alle Zellen auf die Flasche mit HC11 Medium und wirbeln, um gleichmäßig in der Flasche zu dispergieren. Dann aliquot die Zellsuspension in 20 drei Zentimeter Petrischalen durch Pipettieren zwei Milliliter Zellen pro Schale.Die Petrischalen zu streuen, um die Zellen zu verbreiten und sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid über Nacht zu bebrüten. Am nächsten Tag, wenn die Zellen 90 bis 100% konfluent sind, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es durch Medium mit FBS, aber ohne EGF. Nach dem Anbau der Zellen in Medium ohne EGF für 24 Stunden, fügen Sie die Differenzierung Medium auf 10 Gerichte und wachsen die Zellen für bis zu 10 Tage halten die anderen 10 Gerichte als Kontrollen.Ändern Sie das Medium alle zwei bis drei Tage mit HIP-behandelten und Kontrollzellen. Um die Differenzierung zu überwachen, beobachten Sie die Zellen mit Phasenkontrastmikroskopie. Verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, wenn die Zellen grünes fluoreszierendes Protein exdrücken.Darüber hinaus quantifizieren Sie den Grad der Differenzierung, indem Sie Proteine einmal pro Tag aus den HIP-behandelten und Kontrollzellen extrahieren und Western Blot-Analysen durchführen. Sammeln und legen Sie das EpH4-Wachstumsmedium, die EHS-Matrix und zwei konische 50-Milliliter-Röhren auf Eis. Die Gewebekulturplatten mit Pipettenspitzen bei minus 20 Grad Celsius vorbereiten und EpH4-Wachstumsmedium mit 10 oder 20% Matrix in zwei 50 Milliliter konischen Röhren ergänzen und auf Eis halten, bis sie einsatzbereit sind.Nach dem Abrufen der vorgechillten Gewebekulturplatten bei minus 20 Grad Celsius 10 Brunnen der 24-Well-Platte mit 150 Mikrolitern unverdünnter Matrix überziehen, indem Sie die Matrix mit einer Pipette verteilen. Vermeiden Sie blasen, wenn Sie die Matrix verteilen. Tippen Sie dann vorsichtig auf die Seiten der Platte und bebrüten die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Matrix erstarren kann.Bereiten Sie sich in der Zwischenzeit auf die Differenzierung vor, indem Sie die epH4-Zellen sowie die zuvor beschriebenen Trypsinisierungszellen versuchen und einzelzellige Suspensionen nach Resuspension von trypsinisierten Zellen sicherstellen. Als Nächstes zählen Sie die Zellen in Suspension mit einem Hämozytometer. Fünfmal 10 auf die vier Zellen pro Brunnen auf ein 1,5 Milliliter steriles konisches Zentrifugenrohr übertragen und fünf Minuten lang bei 250 mal g drehen.Das überstande Medium vorsichtig ansaugen und die Röhre auf Eis legen. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die Zellen in 350 Mikroliter EpH4-Wachstumsmedium mit 20% Matrix ergänzt, während die Rohre auf Eis zu halten, um sicherzustellen, dass Blasen zu vermeiden. Sobald sich die untere Schicht verfestigt hat, fügen Sie die 350 Mikroliter Zellsuspension zu jedem beschichteten Brunnen hinzu und legen Sie sie eine Stunde lang in einen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, damit sich die 20%ige Matrixschicht erstarren lässt.Beobachten Sie die Zellen mit Phasenkontrastmikroskopie, um sicherzustellen, dass einzelne Zellen sichtbar sind. Dann fügen Sie 200 Mikroliter EpH4 Medium mit 10%Matrix auf der Oberseite und inkubieren die Platte bei 37 Grad Celsius. Beginnen Sie die Differenzierungsinduktion einen Tag nach der Beschichtung der Zellen in der Matrix.Entfernen Sie vorsichtig 150 Mikroliter des oberen 10%Matrix-Mediums und fügen Sie 200 Mikroliter EpH4-Medium mit HIP und 10%Matrix hinzu und fügen Sie für Kontrollen ein 10%Matrix-Medium ohne HIP hinzu. Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage für bis zu 10 Tage und überwachen Sie die Mammosphärenbildung durch Phasenkontrastmikroskopie. Um die Differenzierung zu quantifizieren, pipette vorsichtig aus dem 10%Matrix HIP Medium aus den Brunnen und spülen Sie die 20%Matrix-Schicht mit 350 Mikroliter eiskalte PBS.Dann 70 bis 100 Mikroliter eiskalte SeiskalteS PBS mit einem Millimolaren EDTA direkt in die Brunnen geben und die untere Schicht von 100% Matrix vorsichtig mit einer Pipettenspitze lösen. Schütteln Sie die Platte 30 Minuten lang sanft bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Sphäroidsuspension vorsichtig auf ein konisches Rohr und spülen Sie die Brunnen mit 500 MikroliterPBS EDTA, um die verbleibenden Sphäroide wiederherzustellen.Die Röhre für weitere 30 Minuten auf Eis schaukeln, um sicherzustellen, dass sich die Matrix vollständig auflöst. Wenn sichtbare Matrixklumpen zu sehen sind, fügen Sie weitere PBS-EDTA hinzu oder schütteln Sie länger. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 350 mal g, um die Sphäroide zu pellet.Dann aspirieren Sie den Überstand, lysieren Sie die Sphäroide und untersuchen Sie die Zellen für Beta-Casein, Cyclin D1 und p120RasGAP durch Western Blotting. Es besteht eine auffallende Abhängigkeit der Differenzierung von der Stärke des Rac-Signals in HC11-Zellen. Während endogenes CRAC1 für die Differenzierung erforderlich ist und niedrige Mutationsniveaus racV12 eine Erhöhung der Differenzierungskapazität verursachen, lösen hohe RacV12-Spiegel einen Differenzierungsblock aus und induzieren Neoplasie.Als die Differenzierungseigenschaften von EpH4-Zellen in einer 3D-Matrixkultur untersucht wurden, wurde festgestellt, dass die Beta-Casein-Produktion bei acht bis zehn Tagen ihren Höhepunkt erreichte und die Cyclin-D1-Expression vier bis sechs Tage nach der HIP-Stimulation maximal war. Um die Positionierung einzelner Zellen zu bestimmen, wurden sie mit DAPI befleckt und mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Der Tod der inneren Zellen und die Bildung von hohlen Lumen wurden in den Mammosphären beobachtet, während die Zugabe von HGF zur Bildung von röhrenförmigen Strukturen führte.Jemand, der diese Technik zum ersten Mal durchführt, sollte bedenken, dass die Beschichtung der HC11-Zellen wichtig ist. Auch die richtige Extraktion der EpH4-Zellen aus der Matrix ist entscheidend für die Proteinquantifizierung, da Rückstände die Proteinbestimmung beeinflussen. Diese Technik kann verwendet werden, um andere Signalwandler zu untersuchen, die sich in ähnlicher Weise verhalten können.Wenn es Treibermutationen bei einem Krebs gibt, dann wird ihre vollständige Hemmung nicht notwendig sein, da niedrige Verbleibende Werte tatsächlich differenzierungsinduziert würden.

differentiation-of-mouse-breast-epithelial-hc11-and-eph4-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

HC11 lactogenic Differenzierung kann durch die Bildung von Kuppelbauten genannt mammospheres charakterisiert werden. Die Strukturen können durch Phasenkontrast-Mikroskopie aufgezählt werden, um bei der Quantifizierung lactogenic Differenzierung zu unterstützen.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

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Differenzierung von Mausbrustepithel-HC11- und EpH4-Zellen

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